孟金柱，陸雨芳，趙成剛，張羽強(qiáng)，趙園園

(1.銅仁學(xué)院，貴州銅仁 554300；2.貴州梵凈山同心生態(tài)養(yǎng)殖有限公司，貴州銅仁 554300)

蛋雞的卵泡發(fā)育具有明顯的等級(jí)優(yōu)先性，根據(jù)直徑大小及其功能，把卵泡劃分為等級(jí)卵泡和等級(jí)前卵泡兩大類[1]。等級(jí)卵泡，也稱為排卵前卵泡，從大到小排列為F1、F2、F3、F4、F5…，直徑最大能達(dá)到40mm[2]。等級(jí)前卵泡按照直徑分為：1～2mm的小白卵泡(SWF)、3～5mm的大白卵泡(LWF)、6～8mm的小黃卵泡(SYF)和9～12mm的大黃卵泡(LYF)[3]。研究發(fā)現(xiàn)，直徑為6～8mm的小黃卵泡是卵泡在選擇過程中能否優(yōu)先進(jìn)入等級(jí)的轉(zhuǎn)擇點(diǎn)，只有進(jìn)入小黃卵泡庫(kù)的卵泡才有可能被選擇發(fā)育成為排卵前卵泡。然而，只有5% 的大白卵泡可以發(fā)育成為小黃卵泡[4]。

在蛋雞卵泡發(fā)育過程中，由下丘腦分泌的促性腺激素釋放激素(GnRH)通過促進(jìn)垂體分泌促卵泡素(FSH)和促黃體素(LH)刺激卵巢分泌雌激素和孕激素，來調(diào)控卵母細(xì)胞的增殖，進(jìn)而導(dǎo)致排卵[5]。卵泡中的顆粒細(xì)胞和包圍在顆粒細(xì)胞外層的卵泡內(nèi)膜細(xì)胞都參與了激素的合成及分泌，其中顆粒細(xì)胞負(fù)責(zé)合成分泌孕激素(P4)，而卵泡內(nèi)膜細(xì)胞是合成及分泌雄激素和雌激素(E2)的主要部位[6]。在等級(jí)前卵泡中，E2對(duì)促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖及卵泡發(fā)育成熟具有重要的作用[7]；當(dāng)卵泡接近成熟時(shí)，卵泡內(nèi)膜細(xì)胞中的芳構(gòu)化酶活性會(huì)降低， E2的分泌會(huì)逐漸減弱，相反，顆粒細(xì)胞分泌的P4會(huì)增加[8]。

絲氨酸蛋白酶(PRSS)是蛋白酶家族中的重要成員，Miyakoshi 等[9]發(fā)現(xiàn)，PRSS35在小鼠卵巢顆粒細(xì)胞、黃體以及早期妊娠子宮內(nèi)表達(dá)，推測(cè) PRSS35在雌性生殖過程中發(fā)揮重要作用，特別是在卵母細(xì)胞發(fā)育、排卵、著床和蛻膜化等過程[10]。進(jìn)一步研究表明，PRSS35mRNA 只在發(fā)育卵泡的膜層、排卵前和排卵卵泡的顆粒細(xì)胞，以及正在形成及消退的黃體中有表達(dá)[11-12]，可能與卵母細(xì)胞的受精潛力有關(guān)。且PRSS35的表達(dá)具有高度特異性，推測(cè)PRSS35可能參與小鼠卵泡發(fā)育及排卵過程并促進(jìn)卵泡發(fā)育、誘導(dǎo)排卵[13-14]。而關(guān)于PRSS35在禽類卵泡中的功能研究及作用機(jī)制鮮見報(bào)道。因此，本研究通過免疫組織化學(xué)技術(shù)對(duì)PRSS35在蛋雞卵泡中的表達(dá)進(jìn)行定位，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)和Western blot技術(shù)對(duì)PRSS35mRNA和蛋白在卵泡內(nèi)膜細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)情況進(jìn)行分析，同時(shí)采用ELISA技術(shù)對(duì)卵泡液中的E2進(jìn)行測(cè)定，旨在探明PRSS35在蛋雞卵泡中的表達(dá)位置及其在不同大小卵泡中的表達(dá)與E2分泌的關(guān)系，為進(jìn)一步研究PRSS35在卵泡發(fā)育中的功能及作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及樣品采集

在貴州梵凈山同心生態(tài)養(yǎng)殖有限公司(貴州銅仁)選取5只150 日齡健康的土母雞宰殺后，分別剪下卵巢上的小白卵泡、大白卵泡、小黃卵泡和大黃卵泡，抽取卵泡液用于E2含量的測(cè)定，刮取卵泡內(nèi)膜細(xì)胞用于總RNA和總蛋白提取。選取部分大白卵泡和小黃卵泡，放入體積分?jǐn)?shù)為4% 的多聚甲醛溶液中固定24 h，用于PRSS35在大白卵泡和小黃卵泡組織中的表達(dá)定位。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 PRSS35的組織定位 參照于雪靜[15]免疫組織化學(xué)研究的方法，將大白卵泡和小黃卵泡的石蠟切片經(jīng)脫蠟、阻斷、抗原修復(fù)、封閉后，分別滴加兔抗PRSS35一抗(1∶100稀釋)，以滴加正常兔血清作對(duì)照，4 ℃過夜孵育，然后復(fù)溫，二抗孵育(鼠抗兔IGg)，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水，透明，封片；最后置于顯微鏡(Leica，德國(guó))下采集照片并分析。

1.2.2 總RNA提取及RT-PCR分析 使用Trizol法分別提取小白卵泡、大白卵泡、小黃卵泡和大白卵泡膜細(xì)胞的總RNA，通過反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京全式金)反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)條件為： 42 ℃孵育15 min，85 ℃加熱5 s。使用GAPDH作為內(nèi)參基因，通過NCBI在線設(shè)計(jì)引物(表1)并交由上海生工生物有限公司合成。

表1 供試引物序列Table 1 Tested primer sequence

RT-PCR按照北京全式金產(chǎn)品Transstart○RTip Green qPCR SuperMix使用說明書推薦的 20 μL反應(yīng)體系進(jìn)行，采用LightCycler 480平臺(tái)設(shè)置條件：94 ℃預(yù)變性1 min；94 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 10 s，45個(gè)循環(huán)。結(jié)果使用2-△△CT法計(jì)算PRSS35的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 總蛋白提取及Western blot分析 使用上海碧云天生物技術(shù)有限公司的RIPA裂解液(強(qiáng))分別提取小白卵泡、大白卵泡、小黃卵泡和大白卵泡膜細(xì)胞的總蛋白，參照畢錫麟[16]的方法進(jìn)行Western blot，所用一抗為兔抗PRSS35 (1∶1 000稀釋)，以GAPDH為對(duì)照，4 ℃孵育14 h，TBST清洗3次，每次10 min；HRP-山羊抗兔為二抗(1∶2 000稀釋)，TBET清洗3次，每次10 min；最后置于凝膠成像系統(tǒng)拍照并分析。

1.2.4 卵泡液中E2的含量測(cè)定 使用E2ELISA試劑盒(上海藍(lán)基)分別測(cè)定小白卵泡、大白卵泡、小黃卵泡、大黃卵泡卵泡液中E2的含量。采用5個(gè)樣本重復(fù)，每個(gè)樣本進(jìn)行3個(gè)技術(shù)重復(fù)，分別向酶標(biāo)板上的空白孔中依次加入 50 μL 0 ng/mL、0.25 ng/mL、0.5 ng/mL、 1 ng/mL、2.5 ng/mL和5 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)品，其余孔中依次加入待測(cè)樣品，按照試劑盒使用說明書將反應(yīng)液配置好以后，置于酶標(biāo)儀中讀取OD(Optical density)值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度所對(duì)應(yīng)的OD值建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，將所獲得的OD值轉(zhuǎn)換為質(zhì)量濃度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 PRSS35蛋白在蛋雞卵泡內(nèi)的表達(dá)

通過免疫組織化學(xué)技術(shù)對(duì)PRSS35在蛋雞卵泡中的表達(dá)進(jìn)行定位，顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)(圖1)，陰性對(duì)照組未發(fā)現(xiàn)有特異性著色，試驗(yàn)組卵泡顆粒細(xì)胞層、膜細(xì)胞層和卵丘細(xì)胞均呈現(xiàn)棕黃色。表明PRSS35蛋白在蛋雞卵泡的顆粒細(xì)胞層、膜細(xì)胞層和卵丘細(xì)胞中均有表達(dá)。

2.2 PRSS35 mRNA在蛋雞不同大小卵泡膜細(xì)胞中的表達(dá)差異

采用QRT-PCR檢測(cè)PRSS35 mRNA在蛋雞不同大小卵泡膜細(xì)胞中的表達(dá)情況，結(jié)果表明(圖2)，PRSS35 mRNA在小黃卵泡膜細(xì)胞中的含量顯著高于其他卵泡(P<0.05)，而小白卵泡、大白卵泡和大黃卵泡膜細(xì)胞之間PRSS35 mRNA的含量差異不顯著(P>0.05)。

2.3 PRSS35蛋白在蛋雞不同大小卵泡膜細(xì)胞中的表達(dá)差異

采用QRT-PCR檢測(cè)PRSS35 蛋白在蛋雞不同大小卵泡膜細(xì)胞中的表達(dá)情況，結(jié)果表明(圖3)，PRSS35蛋白在小黃卵泡膜細(xì)胞中的含量顯著高于其他卵泡(P<0.05)，而小白卵泡、大白卵泡和大黃卵泡膜細(xì)胞之間差異不顯著(P> 0.05)。

A.大白卵泡陰性對(duì)照； B.大白卵泡試驗(yàn)組；C.小黃卵泡陰性對(duì)照；D.小黃卵泡試驗(yàn)組；GC.顆粒細(xì)胞層；TC.膜細(xì)胞層；CC.卵丘 細(xì)胞

A.Negative control of large wihte follicles; B.Experiment group of large wihte follicles; C.Negative control of small yellow follicles; D.Experiment group of small yellow follicles; GC.Granulosa cells layer; TC.Theca cells layer; CC.Cumulus cells

圖1 PRSS35在蛋雞卵泡中的表達(dá)(×200)
Fig.1 Expression of PRSS35 in chicken ovary follicles (×200)

小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同

Lowercase letters indicate significant difference (P<0.05).The same below

圖2 不同大小卵泡顆粒細(xì)胞內(nèi)
PRSS35 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平
Fig.2 Relative expression of PRSS35 mRNA
in follicle theca cells at different sizes

2.4 蛋雞不同大小卵泡卵泡液中E2的含量

E2測(cè)定結(jié)果表明(圖 4)，E2在小黃卵泡卵泡液中的含量顯著地高于其他卵泡(P<0.05)，小白卵泡和大白卵泡顯著高于大黃卵泡(P< 0.05)。

圖3 不同大小卵泡膜細(xì)胞內(nèi)PRSS35蛋白的相對(duì)表達(dá)水平Fig.3 Relative expression of PRSS35 in follicle theca cells at different sizes

圖4 不同大小卵泡卵泡液中E2的含量Fig.4 E2 concentrations in follicle fluids at different sizes

3 討 論

蛋雞的卵泡在多種激素和生長(zhǎng)因子的共同調(diào)控下，促進(jìn)顆粒細(xì)胞和內(nèi)膜細(xì)胞的增殖和分化及子宮內(nèi)膜細(xì)胞和卵母細(xì)胞的成熟[17]。在這個(gè)過程中，只有大約1% 的卵泡能夠排卵，直徑為6～8 mm的小黃卵泡是卵泡在選擇過程中優(yōu)先進(jìn)入等級(jí)還是走向閉鎖的轉(zhuǎn)擇點(diǎn)：此階段大部分卵泡會(huì)走向閉鎖，另一小部分卵泡則發(fā)育成為大黃卵泡[4]，只有進(jìn)入小黃卵泡庫(kù)的卵泡才有可能被選擇發(fā)育成為排卵前卵泡[18]。等級(jí)前卵泡的發(fā)育會(huì)直接影響卵泡的選擇、成熟及排卵，進(jìn)而影響產(chǎn)蛋規(guī)律[19]。本研究中QRT-PCR和Western blot試驗(yàn)結(jié)果均顯示，PRSS35 mRNA和蛋白在小黃卵泡中的含量顯著高于其他卵泡(P<0.05)，表明PRSS35可能是蛋雞等級(jí)前卵泡發(fā)育過程中的重要調(diào)控因子，可能參與卵泡的選擇。

在動(dòng)物體內(nèi)，絲氨酸蛋白酶(Serine protease)作為一種重要蛋白水解酶類，通過絲氨酸蛋白酶抑制劑(Serine protease inhibitor)來調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、組織重建、血管形成、胚胎發(fā)育和病原侵入等過程[20]。研究發(fā)現(xiàn)，PRSS35在小鼠卵泡顆粒細(xì)胞、黃體妊娠早期的子宮中有表達(dá)，推測(cè)其可能在小鼠卵泡發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用[21]。Sheng等[22]研究表明，PRSS35只在卵巢組織中有表達(dá)，證明其可能與卵母細(xì)胞的活力相關(guān)，從而影響其受精能力。此外，Patrik 等[14]認(rèn)為，PRSS35在小鼠發(fā)育的卵泡膜細(xì)胞層表達(dá)，且在排卵卵泡顆粒細(xì)胞中表達(dá)較高；同時(shí)，在形成和退化的黃體中也有表達(dá)，推測(cè)PRSS35可能參與排卵以及黃體的形成和退化過程，關(guān)于PRSS35在家禽中的研究鮮見報(bào)道。本試驗(yàn)通過對(duì)等級(jí)前大白卵泡和小黃卵泡2種卵泡進(jìn)行免疫組織化學(xué)研究的結(jié)果顯示，PRSS35在蛋雞大白卵泡和小黃卵泡2種卵泡的顆粒細(xì)胞層、膜細(xì)胞層和卵丘細(xì)胞中均有 表達(dá)。

在哺乳動(dòng)物卵泡中，雌激素的合成和分泌是受多種激素和細(xì)胞因子共同調(diào)節(jié)的[23]。促黃體素(LH)通過與卵泡膜細(xì)胞上的LH受體結(jié)合后，會(huì)激活cAMP-蛋白激酶，將膽固醇轉(zhuǎn)化為雄激素，雄激素再被轉(zhuǎn)運(yùn)到顆粒細(xì)胞，在促卵泡素(FSH)與多種生長(zhǎng)因子的共同介導(dǎo)下，使顆粒細(xì)胞進(jìn)一步分化，從而具備合成芳構(gòu)化酶的能力，最終把雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素，而膜細(xì)胞則負(fù)責(zé)為顆粒細(xì)胞合成E2提供前體物質(zhì)(雄激素)[24]。與哺乳動(dòng)物不同，在禽類卵泡中相對(duì)簡(jiǎn)單， 顆粒細(xì)胞中的膽固醇裂解酶將膽固醇裂解為孕激素后被轉(zhuǎn)運(yùn)到膜細(xì)胞內(nèi)，LH與卵泡膜細(xì)胞上的受體結(jié)合以后，使ATP轉(zhuǎn)化為cAMP，進(jìn)而激活芳香化酶將孕激素轉(zhuǎn)化為E2[25]，而合成的E2又可以反饋到顆粒細(xì)胞中，從而抑制顆粒細(xì)胞合成P4，進(jìn)一步調(diào)節(jié)卵泡的發(fā)育、成熟及排卵[26]。卵泡液中E2的含量會(huì)直接影響卵泡的選擇、排卵或閉鎖。本研究通過ELISA法對(duì)不同大小等級(jí)前卵泡卵泡液中的E2含量進(jìn)行測(cè)定，表明E2在小黃卵泡卵泡液中的含量顯著高于其他卵泡卵泡液(P<0.05)，且E2含量在小白卵泡和大白卵泡卵泡液中顯著高于大黃卵泡(P<0.05)。推測(cè)PRSS35在小黃卵泡中可能會(huì)促進(jìn)膜細(xì)胞合成分泌E2，從而參與卵泡的選擇。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)PRSS35在蛋雞卵泡的顆粒細(xì)胞層、膜細(xì)胞層和卵丘細(xì)胞均有表達(dá)；PRSS35 mRNA和蛋白在小黃卵泡中的含量顯著高于其他卵泡(P<0.05)，E2在小黃卵泡卵泡液中的含量顯著高于其他卵泡卵泡液(P<0.01)，在小白卵泡和大白卵泡卵泡液中顯著高于大黃卵泡(P< 0.05)，推測(cè)PRSS35在小黃卵泡中可能會(huì)促進(jìn)卵泡內(nèi)膜細(xì)胞分泌E2，從而影響卵泡的選擇。