臧鑫鑫,黨光輝,王忠星,劉虹秀,崔子寅,崔瑩瑩,宋寧寧,劉思國(guó)
(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/ 動(dòng)物細(xì)菌病創(chuàng)新團(tuán)隊(duì),黑龍江哈爾濱150069)
中性粒細(xì)胞(Neutrophils)是血液中含量最豐富的一種白細(xì)胞,在抵抗病原微生物的侵入中發(fā)揮重要作用。在病原微生物感染期間,特別是感染的早期,能夠迅速招募大量中性粒細(xì)胞到達(dá)感染部位并發(fā)揮作用[1]。中性粒細(xì)胞主要通過(guò)3 種防御機(jī)制殺滅病原微生物,包括吞噬、脫顆粒和形成中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(Neutrophil extracellular traps,NETs)[2-3]。這種NETs 結(jié)構(gòu)主要由解聚的染色體DNA 構(gòu)成NETs 的基本骨架,上面附著有組蛋白、髓過(guò)氧化物酶、鈣網(wǎng)蛋白及其它抗菌蛋白,在體內(nèi)和體外條件下均能夠捕獲并殺滅病原微生物[4]。許多刺激因子和病原微生物如PMA、脂多糖、鏈球菌、白色念球菌、利什曼原蟲(chóng)等均能夠誘導(dǎo)NETs 的形成[5-6]。
結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)在體外也能夠誘導(dǎo)NETs 的形成,但NETs 不能將其殺滅[7]。恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis,MS)作為一種研究MTB 蛋白功能的重要模式菌[8-9],是否能夠誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞形成NETs 目前還不清楚。因此本研究通過(guò)分離牛的外周血中性粒細(xì)胞,體外研究MS 是否對(duì)中性粒細(xì)胞形成NETs,為后續(xù)利用MS 作為模式菌研究結(jié)MTB 的重要蛋白功能提供參考。
1.1 菌種和質(zhì)粒 pMV361-mCherry 紅色熒光重組質(zhì)粒和MS MC2 155 菌株由本實(shí)驗(yàn)室保存。
1.2 主要試劑 牛外周血中性粒細(xì)胞分離液試劑盒和白細(xì)胞分類染色液購(gòu)自天津?yàn)笊镏破房萍加邢薰荆? %組織細(xì)胞固定液購(gòu)自索萊寶生物科技有限公司;Anti-DNA/histone H1 抗體(鼠源)購(gòu)自美國(guó)Merck Millipore 公司;驢抗鼠 IgG(Alexa Fluor 488)購(gòu)自美國(guó) Abcam 公司;poly-L-lysine、PMA 和DAPI 購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司;Pi-coGreendsDNA 試劑盒購(gòu)自美國(guó)ThermoFisher Scientifi 公司
1.3 重組紅色熒光MS 的構(gòu)建與鑒定 將MS 接種于7H9 (含0.2 %甘油和0.05 % Tween-80)液體培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)至其OD600nm為0.8~1.0,3 000 r/min離心10 min (4 ℃),收集菌體;用1 倍體積預(yù)冷的10 %無(wú)菌甘油重懸,離心去上清,重復(fù)此步驟5~7次;用0.1 倍體積預(yù)冷的10 %甘油重懸,分裝,于-80 ℃保存?zhèn)溆?。?5 μL~10 μL 紅色熒光重組質(zhì)粒pMV361-mCherry 電轉(zhuǎn)化入 100 μL MS 感受態(tài)細(xì)胞后,涂布于LB (含50 μg/mL 卡那霉素)固體培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)3 d。挑取多個(gè)單菌落于7H9(含50 μg/mL卡那霉素)液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600nm到2.0 左右,于45 ℃培養(yǎng)30 min。各取100 μL 菌液于激光共聚焦小皿中,通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察菌液是否產(chǎn)生紅色熒光。
1.4 牛外周血中性粒細(xì)胞的分離及鑒定 采集健康牛的抗凝血,使用牛外周血中性粒細(xì)胞分離液試劑盒分離中性粒細(xì)胞。具體方法參照說(shuō)明書(shū)并作如下改動(dòng):于15 mL 離心管中依次加入4 mL 分離液1,2 mL分離液2,3 mL 抗凝血。700 r/min 離心45 min,取紅色細(xì)胞層,加入紅細(xì)胞裂解液,去除紅細(xì)胞,得到牛外周血中性粒細(xì)胞后。利用白細(xì)胞分類染色液進(jìn)行純度鑒定。
1.5 MS 體外誘導(dǎo)NETs 形成的檢測(cè) 將1 mL 牛外周血中性粒細(xì)胞(105個(gè)細(xì)胞/mL)鋪在預(yù)先用poly-L-lysine 處理過(guò)的激光共聚焦小皿中,以MOI 0.1的感染率加入MS,同時(shí)分別在中性粒細(xì)胞中加入PMA (終濃度為 100 μg/mL)作為陽(yáng)性對(duì)照,加入PBS 作為陰性對(duì)照。分別在感染2 h、4 h、6 h、8 h、10 h 時(shí),依次用4%組織細(xì)胞固定液室溫固定30 min,以10 %的山羊血清-5 %魚(yú)明膠-1 % BSA 室溫封閉2 h,鼠抗 DNA/Histone H1 抗體(1∶100)為一抗 4 ℃孵育過(guò)夜,驢抗鼠 IgG (Alexa Fluor 488) (1∶500)為二抗,室溫孵育1 h,DAPI(5 μg/mL)室溫染色10 min,50 %甘油封片,于激光共聚焦顯微鏡下觀察結(jié)果。
1.6 胞外游離DNA 的定量 采用Pi-coGreends-DNA 試劑盒進(jìn)行胞外游離DNA 的定量分析檢測(cè)。參照1.5 的方法將100 μL 牛外周血中性粒細(xì)胞(105個(gè)細(xì)胞/mL)鋪于96 孔細(xì)胞板中。分別用MS、PMA(陽(yáng)性對(duì)照)、PBS(陰性對(duì)照)感染中性粒細(xì)胞,感染2 h、4 h、6 h、8 h、10 h 后,分別取 50 μL 培養(yǎng)上清到96 孔黑色細(xì)胞板中,再加入50 μL 稀釋后的Pi-CoGreendsDNA 試劑,室溫避光孵育5 min,用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光密度。以PMA 陽(yáng)性對(duì)照為標(biāo)準(zhǔn),計(jì)算MS 實(shí)驗(yàn)組和PBS 陰性組中性粒細(xì)胞釋放DNA 的百分比,最后用GraphPad 軟件分析結(jié)果。
1.7 感染細(xì)胞后MS 存活率的檢測(cè) 將280 μL 牛外周血中性粒細(xì)胞(105個(gè)細(xì)胞/mL)鋪于48 孔細(xì)胞板中,加入MS (MOI 0.01)感染中性粒細(xì)胞,分別于感染 4 h、8 h、16 h、24 h、36 h 和 48 h 后,加入終濃度 100 U/mL 的 DNase I 和 3 %的 Trition X-100作用10 min,混勻,10 倍倍比稀釋至106,每個(gè)稀釋度的菌液均涂布于LB(含50 μg/mL 卡那霉素固體平板上,于37 ℃培養(yǎng)3 d,菌落計(jì)數(shù)后統(tǒng)計(jì)MS 的存活率。
2.1 重組紅色熒光MS 的構(gòu)建與鑒定結(jié)果 將整合型重組質(zhì)粒pMV361-mCherry 電轉(zhuǎn)化入MS 感受態(tài)細(xì)胞中,挑取多個(gè)單菌落接種于LB 液體培養(yǎng)液(含50 μg/mL 卡那霉素)中活化,活化的菌液通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察,結(jié)果顯示,MS 發(fā)出紅色熒光(圖1)。表明,重組紅色熒光MS 正確構(gòu)建。
圖1 重組紅色熒光MS 的鑒定結(jié)果(630×)Fig.1 Identification of red fluorescent generated by recombinaht Mycobacterium smegmatis(630×)
2.2 牛外周血中性粒細(xì)胞的分離與鑒定結(jié)果 分離牛外周血得到的中性粒細(xì)胞用白細(xì)胞分類染色液染色后在顯微鏡下觀察,結(jié)果顯示,細(xì)胞核呈紫紅色,形狀為馬蹄狀或者2~5 個(gè)分葉,確定是中性粒細(xì)胞(圖2),經(jīng)檢測(cè)純度達(dá)到90 %以上。
2.3 MS 誘導(dǎo)NETs 的形成檢測(cè)結(jié)果 將構(gòu)建的紅色熒光MS、PMA 和PBS 與中性粒細(xì)胞共孵育,結(jié)果顯示,MS 與中性粒細(xì)胞共孵育2 h 后,開(kāi)始出現(xiàn)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),并且隨著時(shí)間的延長(zhǎng),網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)也逐漸增加。由于DAPI 可以將DNA 染成藍(lán)色,驢抗鼠IgG (Alexa Fluor 488)將DNA/Histone 1 染成綠色。中性粒細(xì)胞胞外的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)由DNA、DNA/Histone 1共定位,證實(shí)為NETs。PMA 作為陽(yáng)性對(duì)照,與中性粒細(xì)胞共孵育后形成大量的NETs,PBS 與中性粒細(xì)胞共孵育則不能形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(圖3)。表明MS 能夠誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞形成NETs。
圖2 牛外周血中性粒細(xì)胞的鑒定結(jié)果(400×)Fig.2 Identification of bovine peripheral blood neutrophils (400×)
圖3 MS 體外誘導(dǎo)NETs 形成的檢測(cè)結(jié)果(630×)Fig.3 Detection of NETs formation in cluced by Mycobacterium smegmatis in vitro(630×)
2.4 胞外游離DNA 的定量結(jié)果 為了定量研究MS 誘導(dǎo)NETs 的形成,用Pi-coGreendsDNA 試劑盒測(cè)定胞外游離DNA 的含量,并計(jì)算各組釋放DNA 的百分比。結(jié)果顯示,MS 感染中性粒細(xì)胞后,胞外游離DNA 的釋放量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加,與PBS 對(duì)照組相比差異極顯著(p<0.01) (圖4)。表明MS 感染中性粒細(xì)胞后,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),NETs 的釋放量逐漸增加。
圖4 不同時(shí)間點(diǎn)MS 誘導(dǎo)NETs 的定量檢測(cè)結(jié)果Fig.4 The quantitative detection of NETs induced by Mycobacterium smegmatis at different time points
2.5 感染中性粒細(xì)胞后MS 存活率的檢測(cè)結(jié)果 將MS 與中性粒細(xì)胞共孵育不同時(shí)間后經(jīng)菌落計(jì)數(shù)檢測(cè)NETs 殺傷MS 的能力。結(jié)果顯示,MS 感染中性粒細(xì)胞后,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),MS 活菌數(shù)逐漸減少(圖5)。表明NETs 具有殺滅MS 的能力。
圖5 MS 感染中性粒細(xì)胞后的存活情況檢測(cè)結(jié)果Fig.5 Survival of Mycobacterium smegmatis in neutrophil
中性粒細(xì)胞是血液中含量最豐富的一種白細(xì)胞,病原微生物(如細(xì)菌、真菌、病毒)感染的早期其能夠被迅速招募到感染部位發(fā)揮殺菌作用[10]。當(dāng)機(jī)體受到刺激發(fā)生炎癥反應(yīng)時(shí),中性粒細(xì)胞通過(guò)表達(dá)大量的模式識(shí)別受體識(shí)別病原體釋放的病原體相關(guān)分子模式(PAMPs),從而得以激活,最終通過(guò)吞噬、脫顆粒和形成NETs 而清除病原體[11]。MS 沒(méi)有致病性,且生長(zhǎng)迅速,是一種非常好的模式菌,在體外和體內(nèi)常用來(lái)研究具有致病性的、生長(zhǎng)緩慢的分枝桿菌(例如MTB 和副結(jié)核分枝桿菌)重要蛋白的功能[8]。
本實(shí)驗(yàn)在構(gòu)建熒光MS 時(shí)選擇了帶紅色熒光基因的重組質(zhì)粒pMV361-mCherry,原因是其屬于整合型質(zhì)粒,可以將克隆基因整合到基因組染色體中,有效地克服了游離型熒光質(zhì)粒不穩(wěn)定的特性,可以用于后續(xù)MS 的定位實(shí)驗(yàn)。在分離牛外周血中性粒細(xì)胞時(shí),由于牛的外周血相對(duì)于人的外周血而言較粘稠且成分比較復(fù)雜,按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作得到的中性粒細(xì)胞純度太低且細(xì)胞含量較少,不能用于后續(xù)試驗(yàn)。本研究以中性粒細(xì)胞分離液試劑盒為基礎(chǔ),通過(guò)優(yōu)化分離條件,得到了高純度的牛外周血中性粒細(xì)胞。為了檢測(cè)MS 是否能夠誘導(dǎo)NETs 的形成,本研究通過(guò)定性和定量相結(jié)合的方法,確定了NETs 的產(chǎn)生及釋放量。在定性試驗(yàn)中,通過(guò)激光共聚焦顯微鏡準(zhǔn)確觀察到了NETs 的結(jié)構(gòu);在定量試驗(yàn)中,通過(guò)Pi-coGreendsDNA 試劑盒定量中性粒細(xì)胞胞外游離DNA 的釋放量,二者共同證明MS 可以誘導(dǎo)NETs 的形成。
有研究報(bào)道顯示,MTB 能夠誘導(dǎo)NETs 的形成,但該NETs 不能殺滅MTB[7]。本實(shí)驗(yàn)室之前的研究結(jié)果顯示,MS 感染小鼠后,在小鼠肺中7 d左右就能夠被完全清除,而構(gòu)建的MTB 鞘磷脂酶重組MS 則能夠在小鼠肺內(nèi)存活21 d 以上[12],MS被快速清除的機(jī)制就可能有NETs 參與其中。
綜上所述,無(wú)致病力的MS 能夠在體外誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞形成NETs,且形成的NETs 能夠殺滅MS。本實(shí)驗(yàn)為研究分枝桿菌的致病機(jī)制提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù),但是關(guān)于具體是MS 中哪些蛋白誘導(dǎo)形成的NETs 還需要進(jìn)一步研究。