張?jiān)叫?，張華偉，李連峰，仇華吉

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150069)

豬瘟(Classical swine fever，CSF)是由 CSF 病毒(CSFV)引起的一種嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的烈性動物傳染病。天然免疫系統(tǒng)是機(jī)體抵抗外來病原感染的第一道防線，其中干擾素(IFN)和干擾素刺激基因(ISGs)在宿主抗病毒防御中發(fā)揮關(guān)鍵作用[1]。CSFV 感染宿主后，激活I(lǐng) 型IFN (IFN-I)信號通路，引起下游ISGs 的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮抗CSFV 作用。

2'-5' 寡腺苷酸合成酶(OAS)家族成員是IFN 誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗病毒蛋白，IFN-I 和IFN-Ⅱ均能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生OAS 家族蛋白。豬源OAS 家族包括3 個(gè)成員：OAS1、OAS2 和OASL。OAS 家族包含保守的2'-5' 寡腺苷酸(2-5A)合成酶合成域(OAS)單元，其中OAS2 含有2 個(gè)OAS 單元。OAS2 抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒和日本腦炎病毒的復(fù)制[2-3]；其抗病毒功能主要是利用ATP 催化合成2-5A，隨后2-5A 激活核糖核酸內(nèi)切酶(RNase L)，活化的RNase L 降解胞內(nèi)的病毒RNA 和細(xì)胞RNA，從而導(dǎo)致病毒感染過程中宿主細(xì)胞內(nèi)蛋白的合成受到抑制，病毒的增殖隨之受到抑制[4-5]。本實(shí)驗(yàn)室前期利用表達(dá)螢火蟲熒光素酶的報(bào)告病毒感染過表達(dá)豬源ISGs 的PK-15 細(xì)胞系，篩選到豬源OAS 家族成員OAS1 和OASL，并且它們具有抗CSFV 的作用[6]，后續(xù)研究中，本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)一步探究豬源同家族成員OAS2 對CSFV 復(fù)制的影響。

CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas(CRISPR-associated)是一種由RNA指導(dǎo)Cas 核酸酶對靶向基因進(jìn)行特定DNA 修飾的技術(shù)，即通過人工優(yōu)化的具有引導(dǎo)作用的單鏈RNA(Guide RNA，gRNA)引導(dǎo)核酸酶Cas 蛋白在與 gRNA 配對的靶位點(diǎn)處剪切雙鏈DNA，引起DNA 雙鏈斷裂，進(jìn)而利用生物體內(nèi)非同源末端修復(fù)機(jī)制或同源重組機(jī)制修復(fù)DNA，導(dǎo)致基因移碼突變、替換或刪除，致使基因功能喪失[7]。本研究利用CRISPR/Cas9 技術(shù)獲得OAS2基因敲除的豬腎(PK-15)細(xì)胞系，并利用該敲除細(xì)胞系研究敲除OAS2 對CSFV 復(fù)制的影響，為進(jìn)一步闡明OAS2 抗CSFV 復(fù)制的作用機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 人胚腎細(xì)胞(HEK293T)、PK-15 細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室購買并保存；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自TaKaRa 公司；慢病毒載體Lenti-CRISPRv2 及輔助質(zhì)粒 psPAX2、pMD2.G 購自 Addgene 公司；CSFV 石門(Shimen)株 AF092448.2、表達(dá)海參熒光素酶(Rluc)的重組報(bào)告豬瘟病毒rCSFV-Rluc 由本實(shí)驗(yàn)室保存。

限制性內(nèi)切酶BsmBⅠ、T4 DNA 連接酶購自NEB 公司；TRIzol、AMV 反轉(zhuǎn)錄酶、RNA 抑制劑 RRI和 Premix ExTaqTMMix 購自 TaKaRa 公司；X-treme GENE HP DNA 轉(zhuǎn)染試劑購自Roche 公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒、PCR 產(chǎn)物純化試劑盒、膠回收試劑盒、DNA 提取試劑盒和質(zhì)粒大提試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；CCK-8 試劑盒購自Dojindo公司；雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測試劑盒購自Promega 公司；熒光素酶檢測白板購自Corning 公司；BCA 法測定蛋白質(zhì)濃度試劑盒購自Solarbio 公司；鼠源抗Flag 標(biāo)簽單克隆抗體(MAb)、鼠源抗β-actin MAb 和兔源抗 OAS2 多克隆抗體(PAb)購自Sigma-Aldrich 公司；FITC 標(biāo)記的山羊抗兔和抗鼠IgG 均購自LI-COR Bioscience 公司；引物由吉林庫美有限公司合成。

1.2 LentiCRISPRv2-sgRNA 敲除質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 根據(jù)NCBIOAS2基因組(NO：595128)信息，標(biāo)注外顯子。將OAS2基因第1、第2 外顯子(Exon)核苷酸序列輸入sgRNA 在線設(shè)計(jì)網(wǎng)站(http://crispr.mit.edu)，選擇兩條脫靶率最低的sgRNA 基因序列，分別命名為：sgRNA-E1 和sgRNA-E2。

按照LentiCRISPRv2 載體信息以及選定的sgRNA 基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物(表1)，通過程序性退火將 sgRNA 引物合成雙鏈 DNA；載體 Lenti-CRISPRv2 經(jīng)BsmBⅠ酶切后回收線性化的載體。用T4 DNA 連接酶將退火后的sgRNA 雙鏈DNA 與線性化的LentiCRISPRv2 在室溫連接30 min 獲得重組質(zhì)粒，分別命名為pLentiCRISPRv2-sgRNA-E1 (psgRNA-E1)和 pLentiCRISPRv2-sgRNA-E2 (psgRNA-E2)，經(jīng)測序鑒定正確后用于慢病毒包裝。

表1 靶向OAS2 基因的sgRNA 序列Table 1 The sequence of sgRNA targeting OAS2 gene

1.3 不同sgRNA 對OAS2基因切割效果的檢測將HEK293T 細(xì)胞接種于6 孔細(xì)胞板中，待細(xì)胞匯合度達(dá)到80%時(shí)轉(zhuǎn)染，分為4 個(gè)組：pFlag-OAS2+psgRNA-E1；pFlag-OAS2+psgRNA-E2；pFlag-OAS2+psgRNA-E1+psgRNA-E2 和 pFlag-OAS2+pLentiCRISPRv2(陰性對照)。轉(zhuǎn)染36 h 后，裂解細(xì)胞收集蛋白樣品，BCA 法測定蛋白濃度后，經(jīng)SDS-PAGE 凝膠電泳檢測Flag-OAS2 蛋白的表達(dá)。分別以鼠源抗Flag MAb (1∶1 000 倍)和鼠源抗 β-actin MAb (1∶1 000)為一抗，山羊抗鼠IgG-FITC (1∶10 000)為二抗，western blot 檢測sgRNAs 對OAS2 基因的切割效率。同時(shí)，采用LI-CO Odyssey 紅外影像掃描儀分析蛋白的灰度值。

1.4OAS2基因敲除的PK-15 細(xì)胞的制備及篩選將HEK293T 細(xì)胞接種于6 孔細(xì)胞板中，待細(xì)胞匯合度達(dá)到80 %時(shí)，將 psgRNA-E1、psgRNA-E2 (實(shí)驗(yàn)組)分別與輔助質(zhì)粒 psPAX2 和 pMD2.G 按 2.1 μg、1.4 μg 和 0.7 μg 共轉(zhuǎn)染，同時(shí)以 pLentiCRISPRv2(對照組)與輔助質(zhì)粒psPAX2 和pMD2.G 按照相同方式其轉(zhuǎn)染作為陰性對照。轉(zhuǎn)染48 h 后收集慢病毒備用。將狀態(tài)良好的PK-15 細(xì)胞傳代接種于6 孔細(xì)胞板中，待細(xì)胞匯合度達(dá)到80 %時(shí)，將慢病毒以MOI 1 的劑量接種PK-15 細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)，36 h 后，用2.5 μg/mL 的嘌呤霉素(puro)進(jìn)行壓力篩選，經(jīng)兩輪puro 篩選，對照組細(xì)胞全部死亡后，將實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞消化成單個(gè)細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)后滴定單克隆，挑取單克隆細(xì)胞并擴(kuò)大培養(yǎng)，細(xì)胞系傳代后凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 PK-OAS2-KO 細(xì)胞株OAS2基因及其蛋白敲除的檢測 收集單克隆細(xì)胞株，編號后按照DNA提取試劑盒說明書提取細(xì)胞的基因組DNA。依據(jù)sgRNA 靶向的OAS2基因組序列位點(diǎn)，根據(jù)其相應(yīng)外顯子兩端的內(nèi)含子基因序列設(shè)計(jì)特異性鑒定引物(表2)，以此為引物，以提取的細(xì)胞基因組DNA 為模板，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 產(chǎn)物經(jīng)測序及序列比對，檢測所獲單克隆細(xì)胞株OAS2基因的敲除效果。

表2 鑒定OAS2 基因敲除的引物序列Table 2 Primer sequence for detecting OAS2 gene knockout

將鑒定為OAS2基因敲除的單克隆細(xì)胞株(PK-OAS2-KO)和對照組細(xì)胞(PK-Cas9)接種于 6 孔細(xì)胞板中，待細(xì)胞貼壁后采用1 000 IU/mL IFN-α 刺激12 h，裂解細(xì)胞收集蛋白樣品，同時(shí)設(shè)無IFN-α刺激對照。SDS-PAGE 凝膠電泳檢測內(nèi)源性O(shè)AS2蛋白的表達(dá)水平，以兔源抗OAS2 PAb (1∶500)和鼠源抗β-actin MAb (1∶1 000)為一抗，山羊抗鼠和山羊抗兔 FITC-IgG (1∶10 000)為二抗，western blot 檢測OAS2 蛋白的敲除效果。同時(shí)以野生型PK-15 細(xì)胞做上述處理后作為對照。

1.6 敲除 OAS2 對 CSFV 復(fù)制的影響 將 PKOAS2-KO 和 PK-Cas9 細(xì)胞計(jì)數(shù)后，以 1×104個(gè)細(xì)胞/ 孔接種96 孔板，每種細(xì)胞設(shè)置5 個(gè)重復(fù)孔；待細(xì)胞匯合度達(dá)到80 %時(shí)，每孔加入10 μL CCK-8 溶液。37 ℃培養(yǎng) 2 h 后，測定 PK-OAS2-KO 和 PKCas9 細(xì)胞的OD450nm值，并計(jì)算PK-OAS2-KO 和PKCas9 的細(xì)胞活力。

將 MOI 0.01 的 rCSFV-Rluc 感染 PK-OAS2-KO和PK-Cas9 細(xì)胞，感染病毒24 h 后，棄掉細(xì)胞培養(yǎng)上清，每孔加入100 μL 1 Luc 裂解液，裂解 1 h，吸取細(xì)胞裂解產(chǎn)物于1.5 mL EP 管中，離心收集上清備用。熒光素酶檢測白板每孔加入30 μL STOP Buffer (海腎熒光素酶檢測底物)，取30 μL 裂解上清液與底物混勻后，將白板放入多功能聚焦式熒光分析儀中讀取熒光值，檢測rCSFV-Rluc 的復(fù)制水平。

將 MOI 0.01 的 CSFV Shimen 株感染 PK-OAS2-KO 和PK-Cas9 細(xì)胞，感染病毒24 h 后，采用TRI-zol 法提取感染細(xì)胞的RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后利用本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的熒光定量PCR (qRT-PCR)方法定量檢測細(xì)胞中CSFV 基因組拷貝數(shù)[8]。

1.7 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 20.0 軟件對所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行Student 氏t檢驗(yàn)或方差分析。其中，***：p＜0.001；**：p＜0.01 為差異極顯著；NS：p＞0.05，沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 LentiCRISPRv2-sgRNA 敲除質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 將退火獲得的sgRNA 雙鏈序列克隆至Lenti-CRISPRv2 載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒psgRNA-E1 和psgRNA-E2。經(jīng)測序鑒定表明正確構(gòu)建了含有sgRNA 的重組質(zhì)粒，構(gòu)建模式見圖1。

圖1 pLentiCRISPRv2-sgRNA 的構(gòu)建模式圖Fig.1 Schematic diagram of the pLentiCRISPRv2-sgRNA

2.2 不同sgRNA 對OAS2基因敲除效果的檢測結(jié)果 將 pLentiCRISPRv2-sgRNAs 與過表達(dá) OAS2 的真核表達(dá)質(zhì)粒pFlag-OAS2 共轉(zhuǎn)染HEK293T 細(xì)胞，經(jīng)western blot 檢測Flag-OAS2 的表達(dá)水平并分析蛋白的灰度值。結(jié)果顯示，sgRNA-E1 和sgRNA-E2 均能夠有效地降低OAS2 蛋白表達(dá)(圖2)，表明設(shè)計(jì)的sgRNA 具有較高的敲除效率。

圖2 sgRNA 敲除 OAS2 蛋白的 western blot 鑒定結(jié)果(A)和灰度值分析(B)Fig.2 Identification of OAS2 knockout efficiency by western blot(A) and grey value analysis (B)

2.3OAS2基因敲除細(xì)胞PK-OAS2-KO 的篩選與測序鑒定結(jié)果 將pLentiCRISPRv2-sgRNA 與輔助質(zhì)粒psPAX2 和pMD2.G 共轉(zhuǎn)染HEK293T 細(xì)胞獲得的慢病毒感染PK-15 細(xì)胞，經(jīng)Puro 加壓篩選和有限稀釋法最終獲得18 株可能敲除OAS2基因的單克隆PK-15 細(xì)胞株，提取細(xì)胞的基因組DNA，擴(kuò)增目的片段，測序結(jié)果顯示得到1 株OAS2基因第2 外顯子缺失突變的PK-15 細(xì)胞株P(guān)K-OAS2-KO。將測序結(jié)果比對顯示，PK-OAS2-KO 細(xì)胞與野生型PK-15細(xì)胞相比，在第2 外顯子位置有2 bp 堿基的缺失突變(圖3)，從基因水平表明 PK-OAS2-KO 細(xì)胞中OAS2基因發(fā)生移碼突變。

圖3 PK-OAS2-KO 細(xì)胞中OAS2 基因缺失的測序鑒定結(jié)果Fig.3 Sequence identification of OAS2 gene in PK-OAS2-KO cells

2.4OAS2基因敲除細(xì)胞PK-OAS2-KO OAS2 蛋白敲除的鑒定結(jié)果 收集PK-OAS2-KO、PK-Cas9和PK-15 細(xì)胞的蛋白樣品，經(jīng)western blot 檢測結(jié)果顯示，PK-15 細(xì)胞中OAS2 蛋白表達(dá)豐度高，經(jīng)IFN-α 刺激后，OAS2 蛋白表達(dá)量稍有提高，表明OAS2 是一種ISG 分子；與PK-Cas9 細(xì)胞相比，PKOAS2-KO 細(xì)胞有無 IFN-α 誘導(dǎo)，OAS2 蛋白均未表達(dá)(圖4)，表明OAS2基因的缺失突變導(dǎo)致OAS2 閱讀框的紊亂，使PK-OAS2-KO 細(xì)胞不表達(dá)OAS2 蛋白。

圖4 PK-OAS2-KO 細(xì)胞中OAS2 蛋白表達(dá)水平的檢測Fig.4 Detection of OAS2 expression in PK-OAS2-KO cells

2.5 敲除 OAS2 對 CSFV 復(fù)制影響的檢測結(jié)果利用CCK-8 細(xì)胞活力檢測試劑盒檢測PK-OAS2-KO和PK-Cas9 細(xì)胞的活性，結(jié)果顯示兩種細(xì)胞具有相似的生長活力(圖5A)。之后，分別通過熒光素酶活性檢測試驗(yàn)和qRT-PCR 檢測敲除OAS2 對CSFV 復(fù)制的影響，結(jié)果顯示，與PK-Cas9 對照細(xì)胞相比，PK-OAS2-KO 細(xì)胞內(nèi)的海腎熒光素酶活性(p＜0.001)(圖5B)和病毒基因拷貝數(shù)(p＜0.01) (圖5C)均顯著增加，表明敲除OAS2 可促進(jìn)CSFV 復(fù)制。

圖5 敲除OAS2 對CSFV 復(fù)制影響的檢測結(jié)果Fig.5 The impact of OAS2 knockout on the replication of CSFV

3 討 論

本研究采用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)，分別設(shè)計(jì)了靶向OAS2 基因第1 和第2 外顯子的sgRNAs，將sgRNAs 序列插入LentiCRISPRv2 載體，獲得重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒與輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T 細(xì)胞，獲得攜帶sgRNA 的慢病毒，將重組慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)PK-15細(xì)胞，采用puro 篩選分離得到單克隆細(xì)胞株，經(jīng)基因測序和western blot 鑒定，表明正確構(gòu)建了敲除OAS2 基因的 PK-15 穩(wěn)定細(xì)胞系。將 CSFV 感染PK-OAS2-KO 細(xì)胞系，結(jié)果表明敲除OAS2 促進(jìn)CSFV 復(fù)制。本研究為構(gòu)建CSFV 的其它基因敲除的PK-15 細(xì)胞系提供了參考，并為進(jìn)一步闡明OAS2抗CSFV 的作用機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

豬源OAS 家族包括3 個(gè)成員：OAS1、OAS2 和OASL。前期實(shí)驗(yàn)已證實(shí)豬源OAS1 和OASL 均能夠抑制CSFV 的復(fù)制[9]，本實(shí)驗(yàn)顯示敲除OAS2 促進(jìn)CSFV 復(fù)制，表明豬源OAS 家族均能夠抑制CSFV復(fù)制。其中，OASL 不是依賴于經(jīng)典的OAS/RNase L 通路發(fā)揮抗病毒作用，而是通過促進(jìn)MDA5 介導(dǎo)的 IFN 信號通路發(fā)揮抗 CSFV 作用[9]；OAS1 和OAS2 抑制CSFV 復(fù)制的機(jī)制還不明確，有必要進(jìn)一步探究其是否依賴于經(jīng)典的OAS/RNase L 通路而發(fā)揮抗CSFV 作用。

CRISPR/Cas9 系統(tǒng)是一種高效、方便的基因編輯工具，具有操作簡單、基因修飾率高、可遺傳和實(shí)驗(yàn)成本低等優(yōu)點(diǎn)[10]。與小RNA 干擾技術(shù)相比，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)是在DNA 水平對OAS2 基因進(jìn)行編輯，完全沉默了OAS2 的表達(dá)；與shRNA 相比，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)克服了用慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞引發(fā)的突變及不穩(wěn)定表達(dá)的缺點(diǎn)。但是，由于受到sgRNA識別位點(diǎn)特異性及某些基因結(jié)構(gòu)復(fù)雜性的限制，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)還面臨著脫靶的問題，在一定程度上限制了其在基因功能研究方面的應(yīng)用[11]，但隨著CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的不斷優(yōu)化以及新的Cas 系統(tǒng)的出現(xiàn)，其應(yīng)用范圍將更加廣泛。