張繼鑫，彭遠(yuǎn)義，李能章

(西南大學(xué)動物科技學(xué)院，重慶北碚400715)

溶血性曼氏桿菌(Mannheimia haemolytica，Mh)是一種革蘭氏陰性短桿菌，可作為常在菌定植于牛羊上呼吸道，但在應(yīng)激條件下，能夠引起牛呼吸道疾病綜合征(Bovine respiratory disease complex，BRDC)、羊肺炎和新生羔羊急性敗血癥等多種牛羊疾病。溶血性曼氏桿菌病導(dǎo)致的臨床病理變化以纖維素性滲出性肺炎、大葉性肺炎、胸膜肺炎為主，對牛羊養(yǎng)殖業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失，僅北美，Mh 給肉牛養(yǎng)殖業(yè)造成的經(jīng)濟(jì)損失就高達(dá)數(shù)十億美元[1]。Mh 按莢膜抗原分型可分為12 種血清型(A1、A2、A5～A9、A12 ～A14、A16、A17)，其中以莢膜血清型 A1、A2、A6 最為常見。Mh 含眾多毒力因子，包括白細(xì)胞毒素(Leukotoxin，Lkt)、莢膜、脂多糖、黏附素、外膜蛋白及多種金屬蛋白酶等，其中Lkt 為Mh 最重要的毒力因子[2]。

Lkt 對熱不穩(wěn)定，在Mh 對數(shù)生長期時分泌最多[3]。Lkt 為RTX (Repeats in toxin)毒素家族成員，其它家族成員包括如大腸桿菌的HlyA，胸膜肺炎放線桿菌的Apx，百日咳桿菌的CyaA 等，它們在基因結(jié)構(gòu)和蛋白結(jié)構(gòu)上均具有一定相似性，但在宿主及靶細(xì)胞的特異性方面卻各不相同[4]。Lkt 主要作用于反芻動物的白細(xì)胞，通過破壞先天性及適應(yīng)性免疫系統(tǒng)進(jìn)而促進(jìn)Mh 的感染?；谀壳皩kt 的結(jié)構(gòu)及功能的研究，本文將對Lkt 的遺傳學(xué)特征、功能特性及其在疫苗中的應(yīng)用進(jìn)行綜述，歸納總結(jié)對Lkt 的研究進(jìn)展及尚未解決的問題，為對其后續(xù)研究提供思路，同時也為國內(nèi)Mh 疫苗的研制提供參考。

1 Lkt的遺傳學(xué)特征

1.1Lkt基因簇的構(gòu)成及功能lkt基因簇由4 個基因構(gòu)成(圖1)，從5' 到3' 分別為lktC、lktA、lktB、lktD，與大腸桿菌溶血素操縱子基因(hlyCABD)具有一定的同源性，其編碼的蛋白大小依次約為19.9 ku、102 ku、79.6 ku、54.7 ku[5]。LktA 為毒力效應(yīng)蛋白，LktC 蛋白具有轉(zhuǎn)酰酶作用，可以酰基化LktA 蛋白，目前認(rèn)為，這種?；饔脤τ贚ktA 與靶細(xì)胞受體的結(jié)合是非必需的，但其是否是LktA 發(fā)揮細(xì)胞毒性所必需的還尚存爭議[6-7]。LktB 和LktD 蛋白則負(fù)責(zé)將LktA 通過Ⅰ型分泌系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)至胞外。

LktA 結(jié)構(gòu)如圖1 所示，LktA 包含953 個氨基酸，自N 端向C 端方向，前54 個aa 形成的雙親性結(jié)構(gòu)域構(gòu)成了線粒體靶向信號(Mitochondrial targeting signal，MTS)，參與介導(dǎo)Lkt 在胞內(nèi)向線粒體的運(yùn)輸[8]；而后約aa169 處起含有一疏水結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域參與了白細(xì)胞毒素的穿孔作用，包含8 個跨膜α 螺旋，其中4 個具有疏水性，4 個具有雙親性；隨后是一個富含β 轉(zhuǎn)角的結(jié)構(gòu)域，使LktA 蛋白在此處形成了一個靜態(tài)彎曲(Static bend)，將LktA 的酰基化結(jié)合位點(diǎn)暴露了出來，LktC 即與該處的賴氨酸殘基相結(jié)合進(jìn)行?；霓D(zhuǎn)移[7]；在該?；Y(jié)合位點(diǎn)后，向C端繼續(xù)延續(xù)，有一個高度保守，且富含甘氨酸(Gly)和天冬氨酸(Asp)，并且以重復(fù)的九肽序列L/I/F-X-G-G-X-G-ND-D-X 為基序的區(qū)域，該區(qū)域內(nèi)含鈣離子結(jié)合位點(diǎn)以及白細(xì)胞CD18 分子的配體，是LktA 發(fā)揮細(xì)胞毒性必不可少的功能域；在LktA 的C 末端共含229aa 的區(qū)域內(nèi)，含有Lkt 中和抗原表位，以及最末端70aa 構(gòu)成的LktB/D 的識別位點(diǎn)[9]。

圖1 lkt 基因簇結(jié)構(gòu)及LktA 結(jié)構(gòu)域

1.2 Lkt 的多樣性與特異性 為了更好的適應(yīng)宿主環(huán)境，Mh 存在廣泛的種間及種內(nèi)DNA 水平轉(zhuǎn)移和在宿主基因內(nèi)重組現(xiàn)象，衍生出了復(fù)雜的lktCABD鑲嵌結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致了Lkt 的多樣性。不同宿主來源，及不同Mh 莢膜血清型之間，其lktA基因序列均可能存在一定差異。目前，按照lktA 等位基因突變情況，主要將lktA 分為8 種基因型，lktA1 ～lktA3、lktA6 ～lktA10，且lktA的基因型與Mh 的莢膜血清型存在一定關(guān)聯(lián)，通常莢膜血清型A1 Mh含 lktA1，A7 Mh 含 lktA1 或者 lktA8，A2 Mh 含lktA2、lktA3、lktA8、lktA10基因型中的一種[10]。盡管不同lktA基因型Mh 所產(chǎn)生的LktA 在氨基酸序列及對靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性方面存在一定差異，但不同基因型Lkt的Mh 之間仍具有交叉保護(hù)性，這也為研制基于Lkt 的Mh 疫苗奠定了理論基礎(chǔ)[11-12]。

Lkt 的特異性取決于反芻動物白細(xì)胞表面的β2 整合素[4]。β2 整合素由 α 亞基(CD11)和 β 亞基(CD18)組成，根據(jù)其α 亞基的不同，可將β2 整合素分為3 種類型：淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原1(Lymphocyte functions associated antigen 1，LFA-1；CD11a/CD18)；巨噬細(xì)胞 -1 抗原受體(Macrophage-1 antigen receptor，Mac-1；CD11b/CD18)；補(bǔ)體受體 4(Complement receptor 4，CR4；CD11c/CD18)。這3 種類型的β2 整合素均可以作為Lkt 的受體而介導(dǎo)對細(xì)胞的毒性[13]，但不論哪種類型的β2 整合素，它們均有一個共同的CD18 亞基，這也是當(dāng)前公認(rèn)的Lkt 的結(jié)合位點(diǎn)。而關(guān)于Lkt 與CD18 分子的具體結(jié)合位點(diǎn)，Dileepan等通過在人K562 細(xì)胞系共表達(dá)牛源CD11a，同時在細(xì)胞表面構(gòu)建人- 牛嵌合CD18 后分別與Lkt 作用，顯示Lkt是與CD18 分子aa541～aa581 片段相結(jié)合的[14]。但Shanthalingam 等通過在小鼠肥大瘤細(xì)胞系P815 及牛淋巴細(xì)胞系BL3 表面構(gòu)建牛CD18 分子片段后與Lkt 作用，顯示Lkt 結(jié)合位點(diǎn)在CD18 分子aa1～aa291 之間，進(jìn)一步利用合成的CD18 分子小片段多肽競爭性結(jié)合Lkt，顯示準(zhǔn)確的結(jié)合位點(diǎn)是aa5～aa17，這一區(qū)域恰好也是CD18 分子的信號肽，而當(dāng)該信號肽被切除后，Lkt 的細(xì)胞毒性也隨之消失。同時，Shanthalingam 等還合成了 CD18 分子aa500～aa600 之間的小片段多肽，利用同樣的競爭性結(jié)合的方法與Lkt 作用，結(jié)果顯示該區(qū)域并無Lkt 的結(jié)合位點(diǎn)，因此，Shanthalingam 等認(rèn)為Dileepan 等的結(jié)果存在一定問題，其不能反應(yīng)Lkt 在反芻動物白細(xì)胞中的分子結(jié)合機(jī)制[15]。鑒于兩者實(shí)驗(yàn)方法及細(xì)胞系的差異，本實(shí)驗(yàn)室更傾向于認(rèn)為CD18 分子aa5～aa17 為Lkt 的結(jié)合位點(diǎn)，而至于另一亞基CD11 是否參與Lkt 與白細(xì)胞的結(jié)合作用，還有待進(jìn)一步研究。

2 Lkt的功能特性

Lkt 能夠以單體或多聚體的形式作用于白細(xì)胞，其對白細(xì)胞的作用呈現(xiàn)明顯的劑量依耐性，通常可分為3 種：①極低濃度或亞細(xì)胞毒性濃度時可激活靶細(xì)胞，發(fā)生氧化迸發(fā)(Oxidative burst)及脫粒作用(Degranulation)等；②較低濃度時可誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡；③高濃度時造成靶細(xì)胞細(xì)胞膜穿孔進(jìn)而造成細(xì)胞腫脹壞死[16]。在這3 種作用中，Ca2+均起著重要的調(diào)節(jié)作用。研究表明，降低胞外和(或)胞內(nèi)Ca2+濃度，或阻滯Ca2+通道，均能夠有效降低Lkt 的細(xì)胞毒性[17]。同時，Lkt 的細(xì)胞毒性還取決于白細(xì)胞表面β2整合素的表達(dá)量，牛皰疹病毒感染會造成牛白細(xì)胞表面β2 整合素表達(dá)量增高，使得白細(xì)胞對Lkt 敏感性增強(qiáng)，這也是牛羊在感染某些病毒如牛皰疹病毒后，更容易感染Mh 的原因[18]。另外，Lkt 通常還會與脂多糖(LPS)以復(fù)合體的形式共同作用于白細(xì)胞，進(jìn)而發(fā)揮更強(qiáng)的細(xì)胞毒性[19]。

2.1 Lkt 與白細(xì)胞激活 亞細(xì)胞毒性濃度的Lkt 與白細(xì)胞β2 整合素相結(jié)合后，可通過G 蛋白藕聯(lián)受體介導(dǎo)胞內(nèi)Ca2+濃度升高，從而激活白細(xì)胞，引起氧化迸發(fā)及脫粒作用等。另外，在中性粒細(xì)胞中，Lkt 還可激活磷脂酶代謝通路，產(chǎn)生具有趨化作用的類花生酸(如LTB4 等)等代謝產(chǎn)物[20]；Lkt 作用于巨噬細(xì)胞中，可激活NF-κB 信號通路，引起IL-1β、IL-8 及TNF-α 等細(xì)胞因子的分泌；而被Lkt 激活的肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞可以產(chǎn)生血管活性物質(zhì)及其他趨化因子，肥大細(xì)胞還可以產(chǎn)生組胺。這些類花生酸、細(xì)胞因子及趨化因子能夠募集更多的中性粒細(xì)胞到炎癥部位，引起炎性細(xì)胞浸潤，并且IL-1β 還可刺激中性粒細(xì)胞表達(dá)更多的β2 整合素，進(jìn)一步增加中性粒細(xì)胞對Lkt 的敏感性[21]，這些均為纖維素性滲出機(jī)制的研究奠定了細(xì)胞基礎(chǔ)。體外實(shí)驗(yàn)顯示，Lkt 可以抑制由刀豆蛋白A(Concanavalin A，ConA)及美洲商陸有絲分裂原(Pokeweed mitogen，PWM)誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖效應(yīng)，而IL-1、IL-2可減輕這種抑制作用[22]，但具體機(jī)制仍未研究清楚，目前也還沒有體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)這一現(xiàn)象。

2.2 Lkt 與白細(xì)胞凋亡 盡管大多數(shù)細(xì)胞凋亡機(jī)制與鈣Ca2+及鈣調(diào)磷酸酶相關(guān)，但研究顯示，Lkt 誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞的凋亡可能在一定程度上并不依賴于Ca2+的內(nèi)流，而是有多種途徑參與。Praveen 等的研究顯示，Lkt 可通過LFA-1、Caspase-3 和TNF-α 參與的凋亡途徑誘導(dǎo)牛肺泡巨噬細(xì)胞凋亡[23]。Atapattu 等的研究顯示Lkt 能夠上調(diào)牛淋巴細(xì)胞系 BL3 Caspase-9 和促凋亡蛋白 Bad 及 Bax 的表達(dá)，并下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2、BclXL 和Akt-1 的表達(dá)，同時Lkt 還造成了線粒體外膜的損傷及膜電位的下降，引起細(xì)胞色素C 的外流，由此推測Lkt 引起的細(xì)胞凋亡可能依賴于線粒體-Caspase-9 途徑[24]。進(jìn)一步研究顯示，LktA N端的前54aa 具有線粒體靶向信號(MTS)作用，當(dāng)Lkt 被運(yùn)送至線粒體外膜時，Lkt 通過轉(zhuǎn)移酶TOM22 和TOM44 被轉(zhuǎn)移至線粒體內(nèi)，通過動力蛋白2 (Dynamin-2，DNM2)與親環(huán)素D(Cyclophilin D，cyD)相結(jié)合，引起白細(xì)胞線粒體膜通透性改變，進(jìn)而激活下游多種凋亡通路[8,25]。

2.3 Lkt 與白細(xì)胞壞死 高濃度Lkt 作用于白細(xì)胞，一方面可通過LFA-1 和Caspase-1 途徑誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞脹亡(Oncosis)[23]；另一方面可迅速引起細(xì)胞膜穿孔，初始孔徑約0.9 nm，造成K+外流，Na+及Ca2+內(nèi)流，導(dǎo)致細(xì)胞膜兩側(cè)滲透壓失衡，大量水分進(jìn)入細(xì)胞，使細(xì)胞迅速膨脹，隨時間延長，細(xì)胞膜中的孔洞直徑可達(dá)100 nm[26]，大量胞質(zhì)內(nèi)容物流出，并最終導(dǎo)致細(xì)胞膜降解，細(xì)胞壞死。流出的胞質(zhì)內(nèi)容物如乳酸脫氫酶(LDH)、活性氧(ROS)、活性氮(RNS)、溶酶體酶等則會造成組織細(xì)胞的損傷，并最終導(dǎo)致組織功能障礙。

2.4 Lkt 的其它功能特性 Lkt 除了引起白細(xì)胞的凋亡與壞死外，Aulik 等的研究顯示其還可以引起中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(NETs)和巨噬細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(METs)的形成[27]。由DNA 骨架及鑲嵌在其中的多種顆粒蛋白如髓過氧化酶、彈性蛋白酶、抗菌肽等組成的NETs 和METs，是一種有別于細(xì)胞凋亡與壞死的現(xiàn)象[28]，具有溶解Mh 毒力因子及捕獲和殺滅Mh 的作用，同時也可能與纖維素性滲出有關(guān)。除上述Lkt 與白細(xì)胞的作用外，Lkt 還可引起溶血和血小板聚集[29]，以及誘導(dǎo)肺實(shí)質(zhì)細(xì)胞釋放白三烯B4(LTB4)和血栓素B2(TXB2)[30]，繼而募集中性粒細(xì)胞至感染部位，進(jìn)一步引起炎性細(xì)胞浸潤及組織損傷。

3 Lkt與Mh疫苗

由于Mh 的嚴(yán)重危害性，其疫苗研發(fā)早在上世紀(jì)70年代即已經(jīng)展開。早期研制的滅活疫苗，雖然能夠引起機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)抗體，并具有一定的保護(hù)性，但由于缺少Lkt成分，免疫后宿主不具有抗白細(xì)胞毒素效應(yīng)。在某些情況下，該疫苗不僅起不到好的保護(hù)效果，反而還可能因?yàn)镮gG 抗體的調(diào)理作用而促進(jìn)巨噬細(xì)胞與Mh 的結(jié)合，進(jìn)而加劇Lkt 引起的細(xì)胞毒性，起到促進(jìn)Mh 感染的作用，而活疫苗因能夠持續(xù)表達(dá)Lkt，可誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生中和抗體，從而起到較好的保護(hù)性[31]。盡管Lkt 在疫苗保護(hù)性中起了重要作用，但Conlon 等的研究卻顯示，單獨(dú)采用重組Lkt免疫牛后卻并不能抵抗Mh 的攻毒，而該重組Lkt 卻能夠增強(qiáng)Mh 培養(yǎng)上清對牛的免疫保護(hù)性，表明基于Lkt 的免疫保護(hù)還需要其他抗原成分的參與[32]。這一發(fā)現(xiàn)也為后來將Lkt 作為疫苗研制的主要成分奠定了基礎(chǔ)，如目前國外使用的One Shot (由菌影和類毒素構(gòu)成)、Presponse SQ (由類毒素構(gòu)成)、Nuplura PH (由外膜蛋白提取物和重組Lkt構(gòu)成)等疫苗(數(shù)據(jù)來源：Drugs.com)。后來有研究顯示Mh外膜蛋白PlpE 能夠增強(qiáng)現(xiàn)有疫苗的保護(hù)效果，并且將PlpE 與LktA 融合表達(dá)后免疫小鼠能夠?qū)ζ淦鸬搅己玫谋Ｗo(hù)效果[33]。Batra 等嘗試將lktA-plpE 融合基因克隆到牛皰疹病毒載體后免疫大角羊，結(jié)果雖然能夠檢測到抗Lkt 和PlpE 的抗體，但可能由于PlpE 抗體水平較低而導(dǎo)致對免疫動物最終幾乎無保護(hù)作用[34]。

Mh 疫苗的保護(hù)效果在很大程度上取決于其Lkt 的含量，由此Tucci 等還提出用抗Lkt 的抗體來定量測定疫苗中的Lkt 含量，以建立商業(yè)化疫苗的驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)[35]。當(dāng)前工業(yè)化生產(chǎn)的Lkt 產(chǎn)量較低，雖然將重組Lkt 直接添加到疫苗中能夠增強(qiáng)疫苗的免疫效果，但這也相應(yīng)增加了生產(chǎn)成本。而Lkt 產(chǎn)量問題又與菌株的差異、培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)條件等諸多因素有關(guān)，直到現(xiàn)在，仍然沒有一個最優(yōu)化的條件來最大化Lkt 的產(chǎn)量，而且也缺乏對這方面的研究[3]。

4 小結(jié)與展望

Lkt 不論作為毒力因子參與Mh 的感染和致病，還是作為疫苗的主要成分發(fā)揮其免疫保護(hù)作用，均具有不可替代的作用。由于Lkt 靶細(xì)胞的特異性，其并不直接參與宿主組織損傷的形成，而是調(diào)動宿主免疫系統(tǒng)，引起過度的免疫反應(yīng)，在這一過程中，中性粒細(xì)胞發(fā)揮了主要作用。單獨(dú)的重組Lkt 不能產(chǎn)生免疫保護(hù)效果，意味著其在Mh致病機(jī)制中的作用仍有待進(jìn)一步探究。而NETs 和METs作為一種新發(fā)現(xiàn)的非特異性免疫方式，盡管目前已經(jīng)有很多研究，但Lkt、Mh 誘導(dǎo)其形成的機(jī)制，其在牛羊肺炎中的作用，以及Mh 是否對其具有抵抗、逃避的作用均還有待探究，這方面的研究也有助于進(jìn)一步揭示NETs 和METs 的形成機(jī)制以及Mh 的致病機(jī)制。另外，考慮到lktA的多樣性，還可以將其作為追蹤靶標(biāo)整合入不同血清型的Mh 中進(jìn)行該疾病流行病學(xué)的調(diào)查溯源，為疾病防控提供依據(jù)。

疫苗接種是預(yù)防Mh 病的重要措施。研究顯示，在牛群或羊群產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)(運(yùn)輸、換舍等)的前幾周對其接種疫苗，能夠起到較好的預(yù)防Mh 病的效果[36]。這一舉措在國外已有較為廣泛的應(yīng)用，但在國內(nèi)尚未見有Mh 疫苗的報(bào)道。這可能是由于國內(nèi)Mh 病流行情況不如國外嚴(yán)重而沒有得到重視所致，但不排除國內(nèi)將來有Mh 病暴發(fā)的風(fēng)險。對于Mh 疫苗的研究，從細(xì)菌本身的角度來講，一方面可以優(yōu)化Mh 培養(yǎng)方法，以提高Lkt 的產(chǎn)量；另一方面，也可以通過篩選其他類似于PlpE 的蛋白，以增強(qiáng)基于Lkt 疫苗的免疫效果。本研究室目前正在從事這一方面的研究，通過對具有免疫反應(yīng)的Mh 培養(yǎng)上清中的蛋白進(jìn)行質(zhì)譜分析，擬從中篩選出具有免疫保護(hù)或能夠激發(fā)Lkt保護(hù)性的新型保護(hù)性抗原，但到目前還尚未篩選到，而對于該類蛋白的篩選也有助于進(jìn)一步了解Mh 的致病機(jī)制。從宿主角度來講，利用特定病毒載體或其它已知抗原誘導(dǎo)來提高白細(xì)胞表面β2 整合素的表達(dá)量，從而提高免疫后Lkt 與白細(xì)胞的結(jié)合量，進(jìn)而增強(qiáng)疫苗的免疫效果，也是一種較好的疫苗研制方向。由于Lkt 是與反芻動物白細(xì)胞表面CD18 分子的信號肽區(qū)域相結(jié)合而發(fā)揮作用的，因此Shanthalingam 等提出構(gòu)建無CD18 分子信號肽的基因工程牛，也許能夠?qū)h 的感染產(chǎn)生良好的抵抗性[37]，但缺少信號肽的CD18 分子是否會對機(jī)體其他功能產(chǎn)生影響還有待進(jìn)一步研究。