劉盼盼，王繼洋，楊 霞， 劉紅英，李永濤，常洪濤，王新衛(wèi)，夏銀河，陳 陸，趙 軍，王川慶

(河南農(nóng)業(yè)大學禽病研究所，河南鄭州450002)

鴨源雞桿菌(Gallibacterium anatis，G.anatis)為巴氏桿菌科雞桿菌屬，是一種定植于易感動物上呼吸道及下生殖道的條件性致病菌[1]，主要感染雞、鴨、鵝、火雞等[2]，輸卵管是其主要靶器官，常引起腹膜炎、輸卵管炎[3]、輸卵管囊腫[4]等疾病，導(dǎo)致蛋雞產(chǎn)蛋量及質(zhì)量明顯下降，死亡率提高，混合感染的情況下會給養(yǎng)殖業(yè)造成更大的損失，因而對G.anatis的致病機理和致病因子的研究越來越受到關(guān)注[5]。目前已確定的G.anatis毒力因子主要有外膜囊泡、GtxA 毒素、菌毛、莢膜及金屬蛋白酶等[6]。Lucio等發(fā)現(xiàn)G.anatis能夠黏附于雞口咽上皮細胞和惰性物質(zhì)表面，并在其表面觀察到短而小的毛發(fā)樣結(jié)構(gòu)[7]。隨后 Bager 等證實了G.anatis表面存在 F-17 菌毛，該菌毛基因簇由flfD、flfC、flfG，flfA4 個基因構(gòu)成，G.anatis的FlfA 菌毛不但有良好的免疫原性，而且與其毒力也密切相關(guān)[8]。另有文獻顯示，G.anatis的F-17 樣菌毛是一種可以黏附于含N- 乙?；?D- 氨基葡萄糖的細胞表面受體，其與對宿主細胞的黏附密切相關(guān)[9]。Kristensten 等人發(fā)現(xiàn)G.anatis具有溶血活性及較強細胞毒性，并隨后通過基因組分析預(yù)測到一個RTX 樣毒素GtxA，并發(fā)現(xiàn)該菌具有的溶血能力與分泌型RTX 毒素GtxA 有關(guān)[10]。

鑒于此， 本研究以中國G.anatis分離株P(guān)DS-RZ-1-SLG 為研究對象，在RTX 樣毒素GtxA基因缺失株RZΔgtxA基礎(chǔ)上進一步構(gòu)建F-17 菌毛flfA基因缺失菌株RZΔgtxAΔflfA，分析其生物學特性變化，并以已建立的雞原代輸卵管上皮細胞感染模型，探究GtxA 毒素及F-17 菌毛在G.anatis感染中的作用及兩毒力因子之間的相互作用關(guān)系，為進一步了解G.anatis的致病機理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒G.anatisPDS-RZ-1-SLG(RZ)株由本實驗室分離鑒定并保存；RZΔgtxA[11]由本實驗室構(gòu)建保存。質(zhì)粒pMD18-T、pUC18 購自寶生物工程(大連)有限公司；質(zhì)粒pBC KS+由本實驗實保存。

1.2 主要試劑和培養(yǎng)基 血瓊脂平板購自鄭州貝瑞特有限公司；酵母浸膏、蛋白胨、DL2000 DNA Marker、dNTP 混合液、TaqDNA 聚合酶、限制性內(nèi)切酶均購自寶生物工程(大連)有限公司；Ezup 柱式細菌基因組DNA 抽提試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司；L- 天冬氨酸、L- 谷氨酸、富馬酸(反丁烯二酸)、NaCl、K2HPO4、KH2PO4、吐溫80、L- 胱氨酸、L- 酪氨酸、L- 瓜氨酸、L- 苯丙氨酸、L- 絲氨酸、L- 丙氨酸、CaCl2、MgSO4、MTT均購自北京索萊寶科技有限公司；兔抗原核表達FlfA 多克隆抗體[12]由本實驗室制備保存，羊抗兔IgG-HRP 購自武漢三鷹生物公司；無維生素酪蛋白氨基酸購自美國BD 公司；BHI 培養(yǎng)基購自美國Difco 公司。

1.3 引物的設(shè)計與合成 依據(jù)UMN179 菌株全基因組(NC015460.1)中flfA基因序列，利用Primer 5.0設(shè)計用于擴增flfA基因上游同源臂片段引物FlfA-S-F/FlfA-S-R、下游同源臂片段引物FlfA-X-F/FlfA-X-R、轉(zhuǎn)化片段引物PSKX-F/PSKX-R 及突變菌株鑒定引物FlfA-T-F/FlfA-T-R。同時根據(jù)質(zhì)粒pBC KS+ 的序列信息，設(shè)計擴增卡那霉素(Kan+)的引物KAN-F/KAN-R。所有引物均由上海生工生物工程有限公司合成(表1)。

1.4 同源重組質(zhì)粒pUC18-S-K-X 的構(gòu)建與鑒定利用細菌基因組DNA 快速抽提試劑盒提取G.anatisRZΔgtxA株全基因組，并以其為模板PCR 擴增flfA基因上下游同源臂。同時以pBC KS+ 質(zhì)粒為模板，經(jīng)PCR 擴增獲得kan+篩選標記片段。用EcoRⅠ和BamH Ⅰ雙酶切回收純化的上游同源臂克隆至pUC18 構(gòu)建pUC18-S 質(zhì)粒。回收純化的下游同源臂和pUC18-S 質(zhì)粒經(jīng)Hind Ⅲ和BamHⅠ雙酶切構(gòu)建pUC18-S-X，然后將該質(zhì)粒和抗性標記片段經(jīng)BamHⅠ單酶切后構(gòu)建pUC18-S-K-X，將其轉(zhuǎn)入DH5α 感受態(tài)細胞，經(jīng)BamHⅠ單酶切，EcoRⅠ和Hind Ⅲ雙酶切及測序鑒定正確的質(zhì)粒保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 構(gòu)建RZΔgtxAΔflfA 所需引物Table 1 Primer used for contructing the RZΔgtxAΔflfA mutant strain

1.5 缺失株RZΔgtxAΔflfA的構(gòu)建及篩選 以質(zhì)粒pUC18-S-K-X 為模板，利用引物 PSKX-F/PSKX-R PCR 擴增S-K-X 片段。依據(jù)Ragnhild J[6]報道的方法制備G.anatisRZΔgtxA株感受態(tài)細胞，加 1 μg 轉(zhuǎn)化片段S-K-X 到1 mL 感受態(tài)細胞中培養(yǎng)25 min，加入2 倍體積的BHI 培養(yǎng)2 h 后涂布于Kan+平板。48 h后挑單個菌落于Kan+培養(yǎng)基篩選陽性克隆。對篩選到的的具有穩(wěn)定Kan+的菌株經(jīng)煮沸法提取其基因組DNA 為模板，利用引物FlfA-T-F/FlfA-T-R 對其進行PCR 鑒定。鑒定陽性的PCR 產(chǎn)物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，并命名為RZΔgtxAΔflfA。

1.6 缺失株 RZΔgtxAΔflfA的 western blot 鑒定 將G.anatisRZΔgtxA及 RZΔgtxAΔflfA單菌落接種至不含Kan+的BHI 肉湯中，培養(yǎng)至其OD600nm為1.0，收集菌體后，以兔抗FlfA 多克隆抗體(1∶3 750)為一抗，羊抗兔IgG-HRP (1∶4 000)為二抗，經(jīng) western blot 鑒定FlfA 是否缺失。

1.7 缺失株RZΔgtxAΔflfA的遺傳穩(wěn)定性檢測 將RZΔgtxAΔflfA株接種于BHI 固體培養(yǎng)基中連續(xù)盲傳10 代，挑取第2、4、6、8、10 代單菌落，提取基因組后，利用FlfA-T-F /FlfA-T-R 引物進行菌落PCR鑒定，分析缺失株ΔgtxA/ΔflfA是否穩(wěn)定遺傳flfA基因的缺失。

1.8 缺失株RZΔgtxAΔflfA生長特性試驗 將G.a-natisRZ 株、RZΔgtxA和 RZΔgtxAΔflfA分別接種于綿羊血瓊脂平板，37 ℃孵育24 h，觀察各菌的溶血活性及菌落形態(tài)。

同時，在相同培養(yǎng)條件下將這3 株G.anatis于BHI 液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)。分別取等量的G.anatis過夜培養(yǎng)物接種于BHI 液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)，每隔1 h 測定其OD600nm。試驗重復(fù)3 次并繪制各菌的生長曲線。

1.9 缺失株RZΔgtxAΔflfA生物被膜形成能力測定挑取G.anatisRZ 株、RZΔgtxA、RZΔgtxAΔflfA單菌落接種于BHI 培養(yǎng)液中過夜培養(yǎng)，參考文獻[13]結(jié)晶紫半定量法進行生物被膜形成能力測定。每個菌株設(shè)置8 個重復(fù)，同時設(shè)不接菌的培養(yǎng)基為對照，試驗重復(fù)3 次取平均值計算。

1.10 缺失株RZΔgtxAΔflfA黏附能力測定 參照文獻[14-16]進行雞原代上皮細胞分離培養(yǎng)，培養(yǎng)至長滿單層，用無菌PBS 清洗3 遍，每孔細胞中分別加入 500 μL 濃度為 1.0×107cfu/mL (MOI 100)的G.anatisRZ 株、RZΔgtxA、RZΔgtxAΔflfA菌液。分別在感染 30 min、60 min、90 min、120 min 時用無菌PBS 清洗3 次，胰酶消化后離心收集部分細胞。經(jīng)500 μL 1 %的 TritionX-100 溶解混勻，采用瓊脂平板活菌計數(shù)法，計算每孔溶解液中的細菌數(shù)量。每個樣品設(shè)置4 個重復(fù)，試驗重復(fù)3 次。取每孔細菌黏附細胞數(shù)量的對數(shù)值作圖分析RZΔgtxAΔflfA對細胞的黏附能力。

1.11 缺失株 RZΔgtxAΔflfA的細胞毒性試驗 將G.anatisRZ 株、RZΔgtxA及 RZΔgtxAΔflfA分別在BHI 培養(yǎng)基中37 ℃振蕩培養(yǎng)6 h，收集并洗滌菌體，使其終濃度為1.0×107cfu/mL 并以 MOI 100 的量分別接種雞原代輸卵管上皮細胞，37 ℃培養(yǎng)24 h 后于每孔加入20 μL MTT 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h、4 h、6 h，分別測定其OD570nm。每株菌分別做8 個重復(fù)孔，并設(shè)立未接種G.anatis細胞孔為對照組。計算細胞死亡率[細胞死亡率(%)=(1- 實驗組 OD570nm/ 對照組OD570nm)×100 %]，作為檢測G.anatis對雞原代輸卵管上皮細胞的毒性指標。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒pUC18-S-K-X 的構(gòu)建與鑒定 對構(gòu)建的重組質(zhì)粒pUC18-S-K-X 分別采用BamHⅠ單酶切和EcoRⅠ/Hind Ⅲ雙酶切鑒定，酶切片段與預(yù)期片段大小一致(圖1)。測序結(jié)果顯示插入片段為flfA基因上下游同源臂、Kan+抗性基因，且序列無突變。表明重組質(zhì)粒pUC18-S-K-X 正確構(gòu)建。

圖1 pUC18-S-K-X 質(zhì)粒的酶切鑒定Fig.1 Identification of puc18-S-K-X plasmid by restriction enzyme digestion

2.2 缺失株RZΔgtxAΔflfA的PCR 鑒定結(jié)果 利用引物FlfA-T-F/FlfA-T-R 對篩選到的具有穩(wěn)定Kan+的G.anatis菌液進行PCR 鑒定。結(jié)果顯示，該菌液的PCR 擴增片段長度為1 326 bp，而RZΔgtxA的擴增片段為596 bp (圖2)，測序結(jié)果進一步證實缺失株ΔgtxA/ΔflfA的擴增片段為 Kan+抗性基因及flfA基因的兩端序列。表明RZΔgtxAΔflfA株構(gòu)建正確。

圖2 G.anatis RZΔgtxAΔflfA 的 PCR 鑒定Fig.2 Identification of G.anatis RZΔgtxAΔflfA mutant strain by PCR

2.3 缺失株 RZΔgtxAΔflfA的 western blot 鑒定結(jié)果利用 western blot 對構(gòu)建的 RZΔgtxAΔflfA進行蛋白水平的鑒定。結(jié)果顯示，RZΔgtxA在約20.1 ku 處出現(xiàn)目的蛋白條帶，而RZΔgtxAΔflfA在該處無目的蛋白條帶(圖3)。表明 RZΔgtxAΔflfA不表達 FlfA 菌毛，進一步表明RZΔgtxAΔflfA構(gòu)建正確。

2.4 缺失株RZΔgtxAΔflfA的遺傳穩(wěn)定性檢測結(jié)果將 RZΔgtxAΔflfA連續(xù)盲傳 10 代，挑取 2、4、6、8、10 代單菌落提取基因組后經(jīng)PCR 鑒定。結(jié)果顯示，各代次缺失菌株均能夠擴增出長度約為1 300 bp的目的條帶(圖4)，表明flfA基因缺失在RZΔgtxAΔflfA株中能夠穩(wěn)定遺傳。

圖3 RZΔgtxAΔflfA 和 RZΔgtxA 的 western blot 鑒定結(jié)果Fig.3 Identification of mutant RZΔgtxA and mutant RZΔgtxAΔflfA by western blot

圖4 缺失株體外遺傳穩(wěn)定性分析Fig.4 Analysis of the heredity stability of the mutations in vitro

2.5 缺失株 RZΔgtxAΔflfA生長特性的檢測結(jié)果將G.anatisRZ 株、RZΔgtxA株和 RZΔgtxAΔflfA株分別劃線接種于5 %綿羊血平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h后均長出半透明、灰白色、有完整邊緣、直徑1 mm～2 mm 的圓形菌落；兩突變株相比RZ 株菌落形態(tài)、大小無顯著變化，但二者溶血環(huán)均消失，表明gtxA基因的缺失改變了G.anatis的溶血活性，但gtxA和flfA基因的缺失并未導(dǎo)致缺失株與親本株菌落形態(tài)及大小出現(xiàn)明顯的差異。

在相同的條件下培養(yǎng)G.anatisRZ 株、RZΔgtxA和 RZΔgtxAΔflfA株，每隔 1 h 測定其 OD600nm值，繪制生長曲線。結(jié)果顯示，三者生長速率和生長狀態(tài)均相似且無明顯差別(圖5)。表明gtxA和flfA基因的缺失并未改變G.anatis的生長特性。

2.6 缺失株RZΔgtxAΔflfA生物被膜形成能力測定結(jié)果 分別取該3 株菌過夜培養(yǎng)物于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，采用結(jié)晶紫半定量法測定3 株菌的OD595nm，比較3 種菌的生物被膜形成能力。結(jié)果顯示，相比G.anatisRZ 株，RZΔgtxA株和 RZΔgtxAΔflfA株生物被膜形成能力均顯著降低(p＜0.001)，但 RZΔgtx-AΔflfA株相比RZΔgtxA株生物被膜形成能力稍提高，但二者無顯著差異(p＞0.05) (圖6)。表明gtxA基因的缺失使G.anatis生物被膜形成能力顯著下降，但flfA基因的缺失則對生物被膜的形成能力無明顯影響。

圖5 G.anatis RZ 株、RZΔgtxA 株和 RZΔgtxAΔflfA 株生長曲線的測定結(jié)果Fig.5 The determination of growth curves of wild type G.anatis RZ,RZΔgtxA and RZΔgtxAΔflfA

圖6 G.anatis RZ 株、RZΔgtxA 株和 RZΔgtxAΔflfA 株生物被膜形成能力的檢測結(jié)果Fig.6 Detection results of biofilm formation of strain G.anatis RZ,RZΔgtxA and RZΔgtxAΔflfA

2.7 缺失株RZΔgtxAΔflfA黏附能力測定結(jié)果 將該3 株菌分別以相同的感染量接種于生長至單層的雞原代輸卵管上皮細胞，取每孔黏附細胞的細菌數(shù)量的對數(shù)值作為結(jié)果，測定各菌株對細胞的黏附能力。結(jié)果顯示，3 株G.anatis黏附能力隨時間延長而增強，在感染細胞90 min 時達到最大值；但RZΔgtxA株和 RZΔgtxAΔflfA株的黏附能力始終低于G.anatisRZ 株，RZΔgtxAΔflfA株的黏附能力始終低于RZΔgtxA株，且在感染細胞90 min 時差異顯著(p＜0.05)；感染120 min 后，三者黏附雞原代輸卵管上皮細胞的數(shù)量均下降(p＜0.05) (圖7)。表明gtxA基因和flfA基因的缺失均能夠使G.anatis的黏附能力下降。

圖7 G.anatis RZ、RZΔgtxA 和 RZΔgtxAΔflfA 株對雞原代輸卵管上皮細胞黏附能力的檢測結(jié)果Fig.7 Adhesion of G.anatis RZ, RZΔgtxA and RZΔgtxAΔflfA on primary chicken oviduct epithelial cells

2.8 缺失株 RZΔgtxAΔflfA的細胞毒性測定結(jié)果參照文獻[13]采用 MTT 法檢測 RZΔgtxAΔflfA感染雞原代輸卵管上皮細胞后不同時間點的細胞死亡率。結(jié)果顯示，各菌株感染該細胞后，其死亡率隨培養(yǎng)時間延長而升高，但 RZΔgtxA株和RZΔgtxAΔflfA株感染該細胞的死亡率始終低于G.anatisRZ株(圖8)。表明gtxA基因和flfA基因的缺失降低了G.anatis對雞原代輸卵管上皮細胞的毒性。

圖8 G.anatis RZ 株、RZΔgtxA 株和 RZΔgtxAΔflfA 株對雞輸卵管上皮細胞毒性的檢測結(jié)果Fig.8 The toxic test of G.anatis RZ, RZΔgtxA and RZΔgtxAΔflfA on chicken oviduct epithelial cells

3 討 論

自然環(huán)境中某些細菌為適應(yīng)環(huán)境變化而擁有自然轉(zhuǎn)化能力，借此獲得外源DNA 從而得到穩(wěn)定遺傳的新性狀。2012 年Kristensen 等發(fā)現(xiàn)G.anatis也存在自然感受性，其自然轉(zhuǎn)化效率優(yōu)于電轉(zhuǎn)化，并且環(huán)形質(zhì)粒DNA 轉(zhuǎn)化G.anatis的效率明顯低于線性DNA 的轉(zhuǎn)化效率，同時電轉(zhuǎn)化法對染色體整合無效[17]。鑒于此，本研究借助G.anatis自然感受性，利用自然轉(zhuǎn)化法將帶有flfA基因的上下游同源臂及Kan+基因的線性片段轉(zhuǎn)化入RZΔgtxA基因組構(gòu)建了flfA基因缺失的RZΔgtxAΔflfA，并對其進行相關(guān)特性分析。結(jié)果顯示，相比RZ 株、RZΔgtxA株和RZΔgtxAΔflfA株菌落形態(tài)、生長特性無顯著變化、溶血活性消失；RZΔgtxA和 RZΔgtxAΔflfA生物被膜形成能力明顯下降，黏附能力和毒性作用均降低。相比RZΔgtxA，RZΔgtxAΔflfA生物被膜形成能力稍有升高但二者差異不明顯，其黏附能力及毒性作用下降。然而，環(huán)形質(zhì)粒雖然也能通過電轉(zhuǎn)化或自然轉(zhuǎn)化法低效率進入G.anatis，但該菌自身含有一個或者多個質(zhì)粒，可能存在其與常見表達載體的不相容性，且該菌具有傾向于攝取其自身DNA 的特性(常用質(zhì)粒往往不能經(jīng)轉(zhuǎn)化進入G.anatis菌體)，目前尚未有G.anatis回補株構(gòu)建成功的報道[18]。本研究過程中嘗試用與G.anatis同科的豬胸膜肺炎放線桿菌的穿梭載體用于轉(zhuǎn)化但未成功，因此暫未能構(gòu)建回補株。

細菌的黏附力是決定細菌致病性的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。對細菌黏附機制的報道除了細菌黏附素- 受體特異性黏附機制外[19]，還包括細菌疏水性和生物被膜在細菌非特異性黏附過程中的作用機制研究[20]。本研究中，比較了 RZΔgtxAΔflfA與 RZΔgtxA及野生株RZ 3 株菌生物被膜的形成能力，結(jié)果顯示當gtxA基因缺失時，G.anatis生物被膜形成能力顯著下降(p＜0.001)，相應(yīng)的黏附力出現(xiàn)一定程度的下降(p＜0.05)，表明gtxA基因在G.anatis生物被膜形成過程中起重要作用，并影響G.anatis對雞原代輸卵管上皮細胞的黏附，這與霍亂弧菌RTXA、嗜肺軍團菌RTXA和腸道沙門氏菌RTXA 均促進細菌生物被膜形成且發(fā)揮黏附作用的結(jié)果一致[21]。當在RZΔgtxA基礎(chǔ)上進一步缺失菌毛flfA基因時，RZΔgtxAΔflfA的黏附能力有所降低，生物被膜形成能力幾乎無變化，這與大腸桿菌F18ac 的Ⅰ型菌毛亞基fimA缺失造成生物被膜形成下降有一定差異[22]，推測可能由于體外培養(yǎng)的G.anatis菌毛表達受到嚴格調(diào)控，與其僅表達FlfA 菌毛亞基有關(guān)。以上研究表明，G.anatisGtxA 和菌毛在其感染雞原代輸卵管上皮細胞過程中均發(fā)揮毒性和黏附作用，且呈現(xiàn)明顯的協(xié)同作用。鑒于G.anatis的感染需要多種毒力因子共同發(fā)揮作用，其具體作用機制還需要結(jié)合其他重要毒力因子的相關(guān)試驗來進一步分析。本研究為G.anatis感染機制的研究奠定基礎(chǔ)。