孫晨陽，閆文朝，何 凱，王天奇

(河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河南洛陽471023)

結(jié)腸小袋纖毛蟲病是毛口亞綱(Trichostomatia)、前庭目(Vestibuliferida)、小袋科(Balantidiidae)、小袋屬(Balantioides)的結(jié)腸小袋纖毛蟲(Balantioides coli)，簡(jiǎn)稱小袋蟲寄生于豬、人和非人靈長(zhǎng)類等50 多種宿主的盲腸和結(jié)腸所引起的一種人獸共患寄生蟲病。小袋蟲是一種土源性寄生蟲，呈世界性分布[1-3]。豬的感染較普遍，感染率達(dá)20 %～100 %，主要引起斷奶仔豬腹瀉，小袋蟲性腹瀉會(huì)加重?cái)嗄套胸i的死亡率[1,4]。人感染主要是通過吞食被包囊污染的食物或飲水，表現(xiàn)腹痛、腹瀉、結(jié)腸潰瘍和穿孔等癥狀[1]，還可引起人泌尿生殖道、肺和肝臟等腸道外感染[1,5]。豬是小袋蟲最重要的天然宿主，人感染病例中，多數(shù)病人有與家豬、野豬或豬糞便有接觸史[1]。

目前小袋蟲病主要依靠硝基咪唑類藥物來控制，最常用的是甲硝唑，其它藥物對(duì)小袋蟲病的療效報(bào)道很少[1,6]。而甲硝唑也是治療人和動(dòng)物體內(nèi)厭氧菌、阿米巴蟲、滴蟲和賈第蟲等病原的常用藥物[6-7]，臨床上已經(jīng)報(bào)道賈第蟲、阿米巴蟲和芽囊原蟲對(duì)甲硝唑等硝基咪唑類藥物表現(xiàn)耐藥性[8]。在甲硝唑治療豬和靈長(zhǎng)類動(dòng)物的小袋蟲病例中，發(fā)現(xiàn)存在反復(fù)發(fā)作和療效不明顯的情況[6,8]。另外，甲硝唑具有致癌、致畸等毒副作用，相關(guān)法規(guī)規(guī)定禁止或限制使用此類物質(zhì)作為動(dòng)物食品的飼料添加劑[9]。因此，本研究選擇了阿奇霉素、兩性霉素、巴龍霉素、青蒿素和茴香霉素等10 種廣譜的抗細(xì)菌、真菌和原蟲藥物，通過體外藥物急性毒性試驗(yàn)篩選有效的抗小袋蟲藥物，為臨床上用藥物控制動(dòng)物和人小袋蟲病提供重要的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物與蟲株 替硝唑葡萄糖注射液(批號(hào)為國藥準(zhǔn)字H10960084)購自廣東彼迪藥業(yè)有限責(zé)任公司；青蒿素(Lot No.331D021)、鹽酸四環(huán)素(Cat No.T8180)和兩性霉素(Lot No.319A0544)均購自北京索萊寶科技有限公司；阿奇霉素(批號(hào)為國藥準(zhǔn)字H20063284)購自浙江亞太藥業(yè)股份有限公司；妥曲珠利(批號(hào)為獸藥字CN28776） 購自拜耳(四川)動(dòng)物保健公司；巴龍霉素(Lot No.H0522A)購自大連美侖生物技術(shù)有限公司；茴香霉素(Cat No.A102397)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；硫酸慶大霉素注射液(批號(hào)為國藥準(zhǔn)字H41020318)購自河南潤弘制藥股份有限公司；氫溴酸常山酮(CAS:55837-20-2)購自武漢大華偉業(yè)醫(yī)藥化工有限公司。

本研究所用蟲株來自洛陽市某養(yǎng)豬場(chǎng)，取自然感染仔豬的腹瀉糞便，鏡檢可見大量的、運(yùn)動(dòng)活躍的小袋蟲滋養(yǎng)體。培養(yǎng)前首先用適量生理鹽水懸浮陽性糞樣，用60 目和100 目篩網(wǎng)過濾除去體積比較大的雜質(zhì)，濾液靜置45 s，吸取懸浮液中間層含大量滋養(yǎng)體的液體，除去比重較大的雜質(zhì)和上層雜菌，然后用改進(jìn)型DMEM 培養(yǎng)基[10]進(jìn)行馴化培養(yǎng)，一般換液傳代2～3 次，滋養(yǎng)體純度和數(shù)量即可達(dá)到藥物篩選試驗(yàn)要求。

1.2 主要試劑 青霉素(批號(hào)為國藥準(zhǔn)字H180101)、鏈霉素(批號(hào)為國藥準(zhǔn)字H01171003)、可溶性淀粉購自北京市海淀區(qū)微生物培養(yǎng)基制品廠；特級(jí)馬血清(用前56 ℃滅活30 min)購自賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 小袋蟲滋養(yǎng)體體外擴(kuò)增培養(yǎng) 利用改進(jìn)型DMEM 培養(yǎng)基進(jìn)行體外培養(yǎng)[10]，向每個(gè)高壓滅菌的10 mL 西林瓶?jī)?nèi)加入2 mL DMEM 培養(yǎng)液和青霉素、鏈霉素1×104IU/mL、淀粉10 mg、特級(jí)馬血清0.5 mL和含有大量結(jié)腸小袋纖毛蟲滋養(yǎng)體糞便樣品約0.5 mL，混勻后編號(hào)，在28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h 后，鏡檢可觀察到大量的、運(yùn)動(dòng)活躍的小袋蟲滋養(yǎng)體即可進(jìn)行藥物篩選試驗(yàn)。

1.4 小袋蟲滋養(yǎng)體抑殺藥物的篩選 選取替硝唑、阿奇霉素、妥曲珠利、四環(huán)素、青蒿素、常山酮、兩性霉素、巴龍霉素、慶大霉素和茴香霉素共10 種不同類型藥物作為抗小袋蟲的體外試驗(yàn)用藥。除青蒿素不溶于水外，其它9 種藥物均可用滅菌蒸餾水配制儲(chǔ)存液。因此，采用二甲基亞砜溶解青蒿素制備儲(chǔ)存液。

因大部分藥物對(duì)小袋蟲抑殺效果沒有文獻(xiàn)報(bào)道，本研究參考這些藥物對(duì)細(xì)菌、真菌或原蟲的治療劑量，每一種藥通過設(shè)置高、中、低3 個(gè)劑量組和不加藥對(duì)照組(表1)來確定藥物是否有效[11-13]。在改進(jìn)型DMEM 培養(yǎng)基中加入數(shù)量相等的小袋蟲滋養(yǎng)體(2 000 個(gè)/ 瓶)和高、中、低劑量的藥物，混合作用6 h、12 h 和24 h 后，分別制片在顯微鏡下觀察滋養(yǎng)體運(yùn)動(dòng)活性和數(shù)量的變化，滋養(yǎng)體計(jì)數(shù)方法參考本實(shí)驗(yàn)室已建立的方法[10]。另外，為了排除二甲基亞砜對(duì)滋養(yǎng)體的毒性作用，在篩選青蒿素的抑殺效果試驗(yàn)中，額外設(shè)置加二甲基亞砜組。每個(gè)組設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。

加入藥物后6 h、12 h 和24 h 觀察，將小西林瓶?jī)?nèi)液體充分混勻，吸取10 μL 滴于載玻片上，于4 倍物鏡下觀察滋養(yǎng)體運(yùn)動(dòng)活性并計(jì)數(shù)。若連續(xù)觀察兩張玻片未見滋養(yǎng)體，則記錄蟲體數(shù)為0，第一次觀察未見滋養(yǎng)體的培養(yǎng)瓶需在加入藥物后12 h 和24 h 時(shí)再觀察，以證實(shí)判定。通過觀察不同濃度藥物中滋養(yǎng)體的運(yùn)動(dòng)活性、數(shù)量變化和藥物作用快慢等指標(biāo)來判定藥物對(duì)小袋蟲的抑殺效果，加入藥物后不同時(shí)間點(diǎn)滋養(yǎng)體運(yùn)動(dòng)越緩慢，數(shù)量減少越明顯，說明藥物的抑殺效果越強(qiáng)[14-15]。

1.5 不同梯度濃度藥物的急性毒性試驗(yàn) 經(jīng)1.4 初步篩選出對(duì)小袋蟲滋養(yǎng)體有抑殺效果的藥物，進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行濃度梯度的藥物急性毒性試驗(yàn)[14-15]，觀察其半數(shù)致死濃度(LC50)和最小殺蟲濃度(MIC)。每一種有抑殺效果的藥物設(shè)置6～10 個(gè)不同濃度(表1)和1 個(gè)不加藥對(duì)照組，各實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組加入的蟲體數(shù)量一致(2 000 個(gè)/ 瓶)，加蓋后28 ℃恒溫培養(yǎng)，分別于6 h、12 h 和24 h 鏡檢觀察和計(jì)數(shù)。

表1 篩選抗小袋蟲藥物的試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Experimental design for screening drugs against B.coli

1.5.1 藥物抑殺小袋蟲相對(duì)死亡率的計(jì)算 以不加藥對(duì)照組的平均蟲體數(shù)目為A，以該藥物各個(gè)濃度梯度的平均活蟲體數(shù)目為B，計(jì)算(A-B)/A 的數(shù)值，并轉(zhuǎn)換為百分?jǐn)?shù)，即不同濃度時(shí)的蟲體相對(duì)死亡百分率。對(duì)照死亡機(jī)率單位轉(zhuǎn)換表，將不同濃度下的相對(duì)死亡百分率轉(zhuǎn)換成死亡機(jī)率單位[15]。

1.5.2 LC50及其95 %置信限的計(jì)算 利用Excel 軟件，以濃度對(duì)數(shù)為橫軸，以死亡機(jī)率單位為縱軸，作X-Y 散點(diǎn)圖，添加趨勢(shì)線并獲得該線的回歸方程及R2。將各個(gè)濃度對(duì)數(shù)代入回歸線方程計(jì)算出期望死亡機(jī)率，根據(jù)死亡百分率與機(jī)率單位值的轉(zhuǎn)換表，將期望死亡機(jī)率轉(zhuǎn)換成期望死亡率(p)。對(duì)照組蟲體數(shù)目(n)與各個(gè)濃度蟲體數(shù)目的差值為死亡蟲體數(shù)(r)。將所有不同濃度梯度的(r-np)2/np (1-p)相加得到X2，如果＞X2時(shí)所作回歸線完全符合要求，如果X2≥，則應(yīng)重新做試驗(yàn)，獲得新的回歸線，并繼續(xù)進(jìn)行X2檢驗(yàn)。經(jīng)X2檢驗(yàn)回歸線符合要求后，利用回歸方程求出死亡機(jī)率單位為5 (死亡率為50 %)時(shí)的藥物濃度對(duì)數(shù)logLC50，查反對(duì)數(shù)表就可獲得LC50[15]。

2 結(jié) 果

2.1 10 種藥物對(duì)小袋蟲滋養(yǎng)體的抑殺效果 在體外藥物與滋養(yǎng)體作用不同時(shí)間點(diǎn)，通過觀察滋養(yǎng)體的運(yùn)動(dòng)活性和數(shù)量變化來評(píng)定藥物對(duì)小袋蟲的抑殺效果。結(jié)果顯示，10 種藥物中，有6 種藥物是有效的，分別是替硝唑、阿奇霉素、妥曲珠利、常山酮、青蒿素和四環(huán)素。替硝唑(8 μg/mL)和阿奇霉素(5 mg/mL)在低濃度下作用6 h 就可以看到明顯殺蟲效果，鏡檢觀察到滋養(yǎng)體運(yùn)動(dòng)明顯緩慢且部分滋養(yǎng)體表膜塌陷或破裂，內(nèi)容物崩解釋放，伸縮泡體積增大等異常現(xiàn)象(圖1)，蟲體數(shù)量減少明顯，與對(duì)照組差異顯著(p＜0.01)；妥曲珠利(1 mg/mL)、常山個(gè)酮(1 mg/mL)和青蒿素(5 mg/mL)在中濃度作用6 h～12 h 可以看到明顯殺蟲效果，其中青蒿素試驗(yàn)中添加二甲基亞砜組的滋養(yǎng)體活性和數(shù)量與不加藥對(duì)照組無明顯差別(p＞0.05)，表明二甲基亞砜對(duì)小袋蟲滋養(yǎng)體無明顯毒性，用其溶解青蒿素不影響青蒿素對(duì)滋養(yǎng)體的抑殺效果；四環(huán)素在中、高濃度下作用12 h 以上才能觀察到滋養(yǎng)體數(shù)量和活性明顯下降(p＜0.05)。而茴香霉素、兩性霉素、巴龍霉素和慶大霉素即使在高濃度作用下小袋蟲滋養(yǎng)體活性和數(shù)量與對(duì)照組無顯著差異(p＞0.05)，表明這4 種藥物對(duì)小袋蟲滋養(yǎng)體無抑殺效果。

2.2 有效藥物的LC50和MIC 測(cè)定結(jié)果 根據(jù)不同濃度梯度藥物的急性毒性試驗(yàn)的方法，進(jìn)行藥物L(fēng)C50和MIC 的測(cè)定，結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)替硝唑、阿奇霉素、妥曲珠利、常山酮、青蒿素和四環(huán)素能明顯抑制小袋蟲滋養(yǎng)體的生長(zhǎng)，作用6 h～24 h 滋養(yǎng)體數(shù)量明顯減少，運(yùn)動(dòng)活性明顯降低。6 種藥物在作用6 h、12 h 和24 h 的 MIC 具體見表2。結(jié)果表明替硝唑和阿奇霉素抑殺小袋蟲的效果最明顯，四環(huán)素抑殺效果比較緩慢。

由于部分藥物與蟲體作用12 h 后，蟲體已全部死亡，因此本研究選擇藥物與蟲體作用6 h 這個(gè)時(shí)間點(diǎn)來繪制回歸直線和回歸方程，計(jì)算其LC50(LC50,6h)。首先利用死亡機(jī)率單位法獲得回歸方程，經(jīng)X2檢驗(yàn)回歸方程符合要求，然后計(jì)算出替硝唑、阿奇霉素、妥曲珠利、常山酮、青蒿素和四環(huán)素這6 種藥物的 LC50,6h，分別是 5.061 μg/mL、1.065 mg/mL、0.598 mg/mL、1.527 mg/mL、1.308 mg/mL、0.557 mg/mL(表2～表5，圖2～圖4)。替硝唑的 LC50,6h最小，常山酮和青蒿素的LC50,6h相對(duì)較高，阿奇霉素的LC50,6h雖然不低，但是蟲體活性明顯下降。表明藥物對(duì)小袋蟲的LC50,6h與其殺蟲效力不呈正相關(guān)，可能與藥物作用機(jī)理有關(guān)。

圖1 替硝唑和阿奇霉素作用6 h～12 h 對(duì)小袋蟲滋養(yǎng)體的影響Fig.1 Efficacy of Tinidazole and Azithromycin against B.coli trophozoites 6 to 12 hours after incubation

表2 替硝唑作用6 h 對(duì)小袋蟲急性毒性試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Acute toxicity test results of Tinidazole against B.coli for 6 h

圖2 替硝唑作用6 h 對(duì)小袋蟲急性毒性反應(yīng)的濃度對(duì)數(shù)-死亡機(jī)率單位曲線Fig.2 Logarithmic of concentration-death odds unit curve of acute toxic response of B.coli to Tinidazole for 6 h

表3 阿奇霉素作用6 h 對(duì)小袋蟲急性毒性試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Acute toxicity test results of Azithromycin on B.coli for 6 h

圖3 阿奇霉素作用6 h 對(duì)小袋蟲對(duì)急性毒性反應(yīng)的濃度對(duì)數(shù)-死亡機(jī)率單位曲線Fig.3 Logarithmic of concentration-death odds unit curve of acute toxic response of B.coli to Azithromycin for 6 h

3 討 論

由于寄生于豬、人、非人靈長(zhǎng)類等宿主的小袋蟲在滋養(yǎng)體形態(tài)特征、分子遺傳進(jìn)化關(guān)系上與寄生于蛙類、較早命名的Balantidium entozoon(Ehrenberg，1838)差異太大，根據(jù)國際動(dòng)物系統(tǒng)命名法，最近有多位學(xué)者建議小袋蟲應(yīng)列為另外一個(gè)屬BalantioidesAlexeieff，1931。因此，小袋蟲的拉丁名稱由原來的Balantidium coli改為Balantioides coli(Malmstein，1857)[2-3]。小袋蟲能感染50 多種宿主，其中對(duì)豬和人具有明顯的致病性[1]。篩選出多種有效的抗小袋蟲藥物，將為臨床上控制豬和人的小袋蟲病提供更多有效手段。

表4 青蒿素作用6 h 對(duì)小袋蟲急性毒性試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Acute toxicity of Artemisinin on B.coli for 6 h

圖4 青蒿素作用6 h 對(duì)小袋蟲急性毒性反應(yīng)的濃度對(duì)數(shù)-死亡幾率單位曲線Fig.4 Logarithmic of concentration-death odds unit curve of acute toxic response of B.coli to Artemisinin for 6 h

表5 6 種有效藥物對(duì)小袋蟲滋養(yǎng)體的抑殺效果Table 5 Inhibitory efficacy of six effective drugs against B.coli

本研究首次檢測(cè)了阿奇霉素、巴龍霉素、茴香霉素、兩性霉素B、妥曲珠利、慶大霉素對(duì)小袋蟲滋養(yǎng)體體外抑殺效果。阿奇霉素屬于大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，對(duì)衣原體、嗜血桿菌、淋球菌、鏈球菌和隱孢子蟲等多種病原微生物和原蟲有明顯的治療效果[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，新鮮配制的阿奇霉素對(duì)小袋蟲滋養(yǎng)體具有明顯而快速的抑殺效果，但是配制的儲(chǔ)存液于4 ℃放置超過24 h，其療效明顯下降，其原因有待進(jìn)一步研究。巴龍霉素是氨基糖甙類廣譜抗生素，對(duì)革蘭氏陰性菌、抗酸桿菌、阿米巴原蟲、隱孢子蟲和絳蟲具有抑殺作用[12]。在本研究中，巴龍霉素對(duì)小袋蟲沒有明顯抑殺效果。茴香霉素是一種鏈霉菌提取物，具有抗真菌、阿米巴原蟲和賈第蟲以及抑制T 細(xì)胞活化等功效；兩性霉素B 是多烯類抗真菌藥物[13]；慶大霉素為氨基糖苷類抗生素，對(duì)革蘭氏陰性菌和部分革蘭氏陽性菌具有很好療效。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，這3 種藥物對(duì)小袋蟲均沒有治療效果。妥曲珠利是一種高效的三嗪酮類抗球蟲藥物，其對(duì)小袋蟲滋養(yǎng)體具有較明顯的抑制作用。另外，本研究發(fā)現(xiàn)替硝唑和四環(huán)素對(duì)小袋蟲具有抑殺效果，特別是替硝唑?qū)π〈x的抑殺速度和效果最明顯，而四環(huán)素的抑殺作用比較緩慢，與相關(guān)研究結(jié)果一致[1,14]。

除了西藥外，尋找中藥或中藥提取物作為治療細(xì)菌、真菌和寄生蟲病的替代藥物，成為國際獸醫(yī)學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究焦點(diǎn)。張夢(mèng)等發(fā)現(xiàn)常山和青蒿的熬制液對(duì)小袋蟲滋養(yǎng)體具有較明顯的抑制作用，由于中草藥熬制液中成分較多，發(fā)揮療效的是不是青蒿素或常山酮，還不能證明[15]。本研究用青蒿素和常山酮的單一成分檢測(cè)了對(duì)小袋蟲滋養(yǎng)體的作用效果，發(fā)現(xiàn)常山酮和青蒿素能明顯抑殺小袋蟲滋養(yǎng)體。說明常山酮和青蒿素可以作為治療小袋蟲病的候選藥物。

在建立小袋蟲滋養(yǎng)體體外培養(yǎng)方法的基礎(chǔ)上[10]，本研究查閱阿奇霉素等10 種藥物的用藥劑量和水生生物毒性試驗(yàn)方法[11-14]，先按照2～10 倍藥物常規(guī)劑量預(yù)設(shè)高、中、低3 個(gè)劑量，來檢測(cè)每種藥物對(duì)小袋蟲滋養(yǎng)體是否有抑殺效果，如果有效，進(jìn)一步進(jìn)行藥物不同濃度急性毒性試驗(yàn)來篩選該種藥物的MIC 和LC50，最后綜合評(píng)價(jià)藥物對(duì)小袋蟲滋養(yǎng)體的抑殺效果。利用該方法從10 種藥物中篩選出阿奇霉素、妥曲珠利、四環(huán)素、青蒿素、常山酮和替硝唑6 種藥物對(duì)小袋蟲滋養(yǎng)體具有抑殺效果，為進(jìn)一步臨床治療試驗(yàn)提供重要參考。