肖 芳，嵇辛勤，李基棕，廖 政，毛 立，李文良，孫 敏，劉茂軍

(1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550025；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京210014)

山羊副流感病毒3 型(Caprine parainfluenza virus type 3，CPIV3)屬于副粘病毒科(Paramyxoviridea)，副粘病毒亞科(Paramyxovirinea)、呼吸道病毒屬(Respirvirus)成員，與其同屬的成員還包括人副流感病毒1 型(Human PIV1，HPIV1)和人副流感病毒3型 (Human PIV3，HPIV3)、 仙 臺(tái) 病 毒 (Sendai virus，SV)以及牛副流感病毒 3 型(Bovine PIV3，BPIV3)[1]，它們均是有囊膜的單股負(fù)鏈RNA 病毒[2]。2013 年，在江蘇省發(fā)病羊群中檢測(cè)出了CPIV3，患病羊群的呼吸道表現(xiàn)出不同程度的感染，通過(guò)RT-PCR 擴(kuò)增CPIV3 N、M、F、HN 和L 基因并測(cè)序，結(jié)果顯示該病毒與HPIV3、BPIV3 的同源性僅為76.9 %～83.5 %，在進(jìn)化樹上處于獨(dú)立分支[3]。隨后的致病性研究中顯示，用CPIV3 JS2013 株對(duì)山羊進(jìn)行感染試驗(yàn)，患病羊臨床表現(xiàn)以咳嗽、眼分泌物增多、流鼻涕、體溫升高等為主要特征。表明CPIV3 是威脅羊群健康的主要呼吸道病原之一，研究其致病機(jī)制和宿主細(xì)胞抗病毒免疫應(yīng)答意義較大。

SYBR GreenⅠ熒光定量PCR 廣泛應(yīng)用于細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平和病毒定量等方面的研究。細(xì)胞因子在機(jī)體的細(xì)胞免疫、抗感染免疫以及抗排斥反應(yīng)等方面均有積極作用[4]。干擾素刺激基因(Interferon stimulated genes，ISGs)作為抗病毒功能的執(zhí)行者，研究其對(duì)CPIV3 抗病毒作用具有十分重要的意義，對(duì)動(dòng)物機(jī)體內(nèi)ISGs 轉(zhuǎn)錄水平的準(zhǔn)確定量，對(duì)評(píng)價(jià)機(jī)體的免疫狀態(tài)，揭示動(dòng)物疾病的發(fā)病機(jī)理和探索機(jī)體免疫應(yīng)答規(guī)律有一定的科學(xué)意義。

本研究室在前期研究中將CPIV3 HA 2014-1 株感染MDBK 細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)有的ISGs 轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)，提示宿主細(xì)胞通過(guò)產(chǎn)生抗病毒因子來(lái)干擾CPIV3 增殖，但CPIV3 HA 2014-1 株無(wú)血凝性，致病性較弱。相比之下，CPIV3 JS2013 株有血凝性，致病性較強(qiáng)。因此，為深入研究該株病毒的致病機(jī)制，本研究首先建立 7 種 ISGs：IFI6、ISG15、OAS1Y、OAS1Z、Mx1、Mx2和RSAD2基因 SYBR GreenⅠ熒光定量PCR 檢測(cè)方法，并應(yīng)用所建立的方法檢測(cè)CPIV3 JS2013 株感染MDBK 細(xì)胞和氣管上皮細(xì)胞(BECs)不同時(shí)間點(diǎn)該7 種ISGs 的轉(zhuǎn)錄水平。為深入研究宿主細(xì)胞免疫防御機(jī)制提供技術(shù)支持，并為進(jìn)一步探究ISGs 的抗病毒作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 MDBK 細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；BECs 為本實(shí)驗(yàn)室保存；pEGFP-N1 載體購(gòu)自優(yōu)寶公司；CPIV3 JS2013 株為本實(shí)驗(yàn)室分離并保存；質(zhì)粒提取和DNA 凝膠回收試劑盒等購(gòu)自AxyGEN 公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及其它PCR 試劑購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 檢測(cè)各目的基因的熒光定量PCR 方法的建立

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank 登錄的7種ISGs 基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物用于擴(kuò)增目的基因和熒光定量PCR 檢測(cè)(表1)。引物均由南京擎科生物科技有限公司合成。

1.2.2 各目的基因質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建與鑒定 利TRIzol試劑盒提取MDBK 細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA 后以其為模板PCR 擴(kuò)增各目的基因。分別將擴(kuò)增片段純化后克隆于pEGFP-N1 載體，構(gòu)建的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)酶切鑒定后測(cè)序分析。

1.2.3 檢測(cè)各目的基因的熒光定量PCR 方法的優(yōu)化及各標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 將20 μL 的反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化：10 μmol/L 上、下游引物各 0.2 μL～1.0 μL (每0.2 μL 為一個(gè)梯度)、2×TransStartqPCR SuperMix 10 μL、50×Dye 0.4 μL、模板 2.0 μL、無(wú)核酶水補(bǔ)至20 μL。同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃30 s；94 ℃ 5 s，50 ℃～60 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，40～45 個(gè)循環(huán)。將構(gòu)建的7 種質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定濃度并換算為拷貝數(shù)后，將其10 倍倍比稀釋后分別作為模板，經(jīng)建立的熒光定量化R 擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后，繪制各標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.2.4 特異性和敏感性試驗(yàn) 通過(guò)溶解曲線，分析建立的各目的基因熒光定量PCR 方法的特異性。將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品10 倍倍比稀釋后為作為模板進(jìn)行SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR 擴(kuò)增，并設(shè)空白對(duì)照以評(píng)價(jià)該方法的敏感性。

1.3 MDBK 細(xì)胞接種 CPIV3 JS2013 株后 7 種 ISGs 基因mRNA 轉(zhuǎn)錄水平的變化 將形態(tài)良好的MDBK 細(xì)胞傳代至12 孔板中，待細(xì)胞匯合度達(dá)到60 %～80 % 時(shí)接種 MOI 1 的 CPIV3 JS2013 株病毒液，同時(shí)用正常細(xì)胞做對(duì)照。在接種24 h、48 h 和72 h 后分別收獲感染細(xì)胞和正常細(xì)胞，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA 后以其為模板，采用建立的熒光定量PCR 方法檢測(cè)接種不同時(shí)間的細(xì)胞和正常細(xì)胞中的IFI6、ISG15、OAS1Y、OAS1Z、Mx1、Mx2和RSAD2基因轉(zhuǎn)錄水平。

1.4 BECs 接種 CPIV3 JS2013 株后 7 種因 mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化 按1.3 方法培養(yǎng) BECs 并接種CPIV3 JS2013 株病毒，提取接種病毒24 h、48 h、72 h 后細(xì)胞與對(duì)照細(xì)胞的PNA 并反轉(zhuǎn)錄為cDNA 后作為模板，采用建立的SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR 方 法 進(jìn) 行IFI6、ISG15、OAS1Y、OAS1Z、Mx1、Mx2和RSAD2基因 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平的定量檢測(cè)。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 本研究所有數(shù)據(jù)均采用SAS 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，通過(guò)ANOVA、Least significance difference (LSD) 方法進(jìn)行計(jì)算。*：p＜0.05 為差異顯著；**：p＜0.01、 ***：p＜0.001 表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 各目的基因質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建與鑒定 各目的基因經(jīng)PCR 擴(kuò)增，結(jié)果顯示均與預(yù)期大小相符(圖略)。重組質(zhì)粒pEGFP-IFI6、pEGFP-ISG15、pEGFPOAS1Y、pEGFP-OAS1Z、pEGFP-Mx1、pEGFP-Mx2和pEGFP-RSAD2 通過(guò)雙酶切鑒定顯示所得片段大小與預(yù)期結(jié)果一致(圖1)。表明，含各目的基因的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品正確構(gòu)建。

圖1 各目的基因重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的酶切鑒定結(jié)果Fig.1 Restriction enzyme identification of recombinant plasmid standards

2.2 熒光定量PCR 方法的優(yōu)化及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立通過(guò)對(duì)反應(yīng)條件的優(yōu)化，最終確定引物濃度為10 μmol/L，退火溫度為50 ℃時(shí)Ct 值最小及熒光值最高，且沒(méi)有引物二聚體產(chǎn)生。最終優(yōu)化的反應(yīng)體系：模板 2 μL (1×105copies/μL)，2×TransStartqPCR SuperMix 10 μL，上、下游引物各 0.4 μL，50×Dye 0.4 μL，無(wú)核酶水 6.8 μL；反應(yīng)程序?yàn)?94 ℃30 s；94 ℃ 5 s、50 ℃ 15 s、72 ℃ 10 s，40 個(gè)循環(huán)。

將7 種質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定濃度并換算為拷貝數(shù)后，將其均稀釋到5×1010拷貝/μL，再10 倍倍比稀釋6個(gè)濃度后作為模板進(jìn)行各熒光定量PCR 擴(kuò)增。結(jié)果顯示擴(kuò)增曲線良好(圖2)，表明建立了檢測(cè)IFI6、ISG15、OAS1Y、OAS1Z、Mx1、Mx2和RSAD2基因的SYBR GreenⅠ熒光定量PCR 方法。

2.3 特異性和敏感性試驗(yàn)結(jié)果 各溶解曲線顯示IFI6、ISG15、OAS1Y、OAS1Z、Mx1、Mx2和RSAD2基因擴(kuò)增產(chǎn)物均出現(xiàn)特異性單峰(圖3)。以7 種質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品10 倍倍比稀釋后作為模板進(jìn)行該SYBR GreenⅠ熒光定量PCR 反應(yīng)，結(jié)果顯示，各質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為5×101拷貝/μL。結(jié)果表明，建立的SYBR GreenⅠ熒光定量PCR 方法特異性較強(qiáng)、敏感性較高。

2.4 MDBK 細(xì)胞接種 CPIV3 JS2013 株后 7 種 ISGs 基因mRNA 轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)結(jié)果 采用建立的熒光定量 PCR 方法檢測(cè) MDBK 細(xì)胞接種 CPIV3 JS2013 株各時(shí)間點(diǎn)各基因mRNA 的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示，接種病毒后，感染組細(xì)胞7 種ISGs基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平隨感染時(shí)間延長(zhǎng)而提高，與對(duì)照組中相比，感染組細(xì)胞7 種ISGs轉(zhuǎn)錄水平至少上調(diào)了3倍以上，其中ISG15、Mx1、Mx2和RSAD2基因的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)量持續(xù)高于IFI6、OAS1Y和OAS1Z基因的轉(zhuǎn)錄水平(圖4)。結(jié)果表明，MDBK 細(xì)胞在受到CPIV3 刺激后ISGs 的轉(zhuǎn)錄水平會(huì)顯著上調(diào)。

2.5 BECs 接種 CPIV3 JS2013 株后 7 種 ISGs 基因mRNA 轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)結(jié)果 采用建立的熒光定量PCR 方法檢測(cè)BECs 接種CPIV3 JS2013 株各時(shí)間點(diǎn)各基因mRNA 的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示，接種病毒后，感染組細(xì)胞7 種ISGs基因mRNA 轉(zhuǎn)錄水平均上調(diào)，其中ISG15、Mx2和RSAD2的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)量明顯高于IFI6、OAS1Y、OAS1Z和Mx1基因的轉(zhuǎn)錄水平(圖5)。結(jié)果表明，CPIV3 刺激BECs 后ISGs的轉(zhuǎn)錄水平雖會(huì)出現(xiàn)上調(diào)，但是不同ISGs 的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)量有所差異。

圖2 7 種SYBR GreenⅠ熒光定量PCR 擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Amplification curves and stand curves of 7 standard plasmid by SYBR GreenⅠreal-time PCR

圖3 7 種SYBR GreenⅠ熒光定量PCR 溶解曲線Fig.3 Melting curves of 7 standard plasmid by SYBR GreenⅠreal-time PCR

圖4 MDBK 細(xì)胞接種CPIV3 JS2013 株后7 種ISGs 的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)結(jié)果Fig.4 Transcription levels of seven ISGs mRNAs in MDBK cells infected CPIV3 JS2013 strain

圖5 BECs 接種CPIV3 JS2013 株后7 種ISGs 的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)結(jié)果Fig.5 Transcription levels of seven ISGs mRNAs in BECs infected CPIV3 JS2013 strain

3 討 論

對(duì)CPIV3 的研究水平還處在初步階段。由于CPIV3 在MDBK 細(xì)胞中生長(zhǎng)速度快，且可穩(wěn)定傳代，所以在前期研究中，本研究室一直使用MDBK細(xì)胞做各項(xiàng)研究，但CPIV3 的靶器官是呼吸器官，使用MDBK 細(xì)胞具有一定局限性。后來(lái)發(fā)現(xiàn)，CPIV3 能夠感染BECs，且能夠有效增殖。因此本研究將CPIV3 分別接種于MDBK 細(xì)胞和BECs，比較兩種不同細(xì)胞系感染CPIV3 后的ISGs 轉(zhuǎn)錄水平差異。

Ⅰ型干擾素(IFN-Ⅰ)反應(yīng)是由病原體感染宿主后產(chǎn)生的，在宿主防御體系中起著重要作用[6-7]。IFNs產(chǎn)生后會(huì)結(jié)合細(xì)胞表面的IFNs 受體，從而啟動(dòng)JAK-STAT 信號(hào)通路，大量的ISGs 被誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄。IFNs 誘導(dǎo)的ISGs 多達(dá)300 個(gè)，只有部分ISGs 的抗病毒活性和相關(guān)機(jī)制得以闡明，絕大多數(shù)ISGs 的相關(guān)生物學(xué)和抗病毒作用機(jī)制還有待于深入探究。

IFI6 是被 IFN-α 和 IFN-β 誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)的 ISGs之一。目前，在IFI6mRNA 轉(zhuǎn)錄水平的研究方面未有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)中不同時(shí)間點(diǎn)正常MDBK 細(xì)胞mRNA 轉(zhuǎn)錄水平基本趨于一致，但經(jīng)CPIV3 JS2013 株刺激后細(xì)胞中IFI6基因會(huì)被大量誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄；正常BECs mRNA 轉(zhuǎn)錄水平有所差異，這可能與細(xì)胞匯合度有關(guān)，經(jīng)CPIV3 JS2013 株刺激后IFI6基因會(huì)被誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄，且與對(duì)照細(xì)胞相比二者差異倍數(shù)至少在3 倍以上。由于CPIV3 JS2013 株刺激后兩種細(xì)胞IFI6mRNA 轉(zhuǎn)錄水平均出現(xiàn)上調(diào)，表明兩種細(xì)胞抵抗CPIV3 感染的過(guò)程基本一致。

本實(shí)驗(yàn)中在感染病毒的24 h、48 h 和72 h 3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)，隨著感染時(shí)間延長(zhǎng)，兩種細(xì)胞中ISG15mRNA 轉(zhuǎn)錄水平持續(xù)上調(diào)，與楊晶等認(rèn)為JEV 接種ST 細(xì)胞 24 h 后ISG15的相對(duì)mRNA 轉(zhuǎn)錄水平有明顯升高結(jié)果基本一致[8]。表明病毒的增殖可以誘導(dǎo)MDBK 細(xì)胞和 BECs 中ISG15mRNA 的轉(zhuǎn)錄。

OAS 最先在人體細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，后來(lái)在小鼠、牛和豬等其他動(dòng)物體內(nèi)也相繼被發(fā)現(xiàn)[9]。由于OAS能直接行使抗病毒功能，研究其mRNA 的轉(zhuǎn)錄水平尤為重要。接種病毒24 h 時(shí)MDBK 細(xì)胞中OAS1Y和OAS1ZmRNA 轉(zhuǎn)錄水平相差不大，但在接種病毒 48 h 和 72 h 時(shí)OAS1Y和OAS1ZmRNA 轉(zhuǎn)錄水平的差異倍數(shù)越來(lái)越大。這表明OAS1Y 和OAS1Z雖屬于同一家族，但被病毒感染后其mRNA 轉(zhuǎn)錄水平會(huì)有所差異，這可能會(huì)影響后續(xù)其的抗病毒效果。

Zurcher T 證實(shí)Mx 在病毒侵入機(jī)體后能夠阻礙其核酸在細(xì)胞中的早期轉(zhuǎn)錄[10]。無(wú)論是接種病毒24 h、48 h 還是 72 h，BECs 中Mx1和Mx2mRNA 轉(zhuǎn)錄水平差異倍數(shù)均低于二者在MDBK 細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄水平差異。推測(cè) CPIV3 JS2013 株感染 MDBK 細(xì)胞和BECs 后，宿主細(xì)胞會(huì)誘導(dǎo)大量的ISGs 來(lái)抑制病毒增殖，但不同細(xì)胞誘導(dǎo)的ISGs 水平存在差異，推測(cè)這可能是機(jī)體和病毒長(zhǎng)期進(jìn)化互相適應(yīng)生存產(chǎn)生的結(jié)果。

RSAD2 也稱Viperin，最早發(fā)現(xiàn)于感染人細(xì)胞巨化病毒的成纖維細(xì)胞中[11]。MDBK 細(xì)胞和 BECs 接種 CPIV3 JS2013 株后 48 h 和 72 h，RSAD2mRNA轉(zhuǎn)錄水平的差異倍數(shù)最大，且感染時(shí)間和RSAD2mRNA 轉(zhuǎn)錄水平具有相關(guān)性，這與曲靖格的研究結(jié)果類似[12]。

大量文獻(xiàn)報(bào)道IFI6、ISG15、OAS1Y、OAS1Z、Mx1、Mx2和RSAD2基因所編碼的蛋白可以直接抑制病毒的增殖，從而起到抗病毒作用[13-17]。因此，檢測(cè)IFI6、ISG15、OAS1Y、OAS1Z、MX1、MX2和RSAD2基因在MDBK 細(xì)胞和BECs 中的轉(zhuǎn)錄水平，為進(jìn)一步研究它們?cè)诳笴PIV3 方面的功能提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。