陳 路，吳無畏，唐炳蘭，劉 鈺，董思，藍(lán)曉步△

（1. 廣西壯族自治區(qū)藥用植物園，廣西 南寧 530023； 2. 廣西壯族自治區(qū)南寧市第一人民醫(yī)院，廣西 南寧 530022）

板山崗顆粒是由板藍(lán)根Isatis indigoticaFort.、山芝麻Helicteres angustifoliaL.、崗梅Ilex asprella（Hook.et Arn.）Champ.ex Benth 3 味中藥組方，應(yīng)用中醫(yī)藥理論對大量臨床處方進(jìn)行篩選，結(jié)合廣西特有的各類中藥民族藥材，經(jīng)反復(fù)實踐而研發(fā)創(chuàng)制的醫(yī)院中藥復(fù)方制劑，具有清熱解毒、涼血功效，可用于治療風(fēng)熱感冒、咽炎、扁桃體炎等。由于研制初期的條件限制，原制劑未完善提取工藝的控制指標(biāo)。為了保證制劑質(zhì)量的穩(wěn)定性，提升制劑的安全性、可控性水平，本研究中將原方諸藥按現(xiàn)代中藥藥劑的制劑需求進(jìn)行了提取工藝的優(yōu)化[1]。以藥材干浸膏和（R，S）-告依春的收率為評價指標(biāo)，通過提取工藝的正交試驗，優(yōu)化板山崗顆粒的最佳生產(chǎn)工藝，為規(guī)模化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

VARIAN 210 型高效液相色譜儀（美國瓦里安公司）；CP114 型電子天平（奧豪斯儀器有限公司）；SB-5200D 型超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；N-1100 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司）。

1.2 試藥

（R，S）-告依春對照品（批號為11753-201505，中國食品藥品檢定研究院）；板藍(lán)根（批號為180501），山芝麻（批號為180801），崗梅（批號為180601），均購于南寧生源中藥飲片有限責(zé)任公司；乙醇為分析純，甲醇為色譜純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 正交試驗設(shè)計

原制劑工藝采用水提取乙醇沉淀法，僅對水提取時間（每次提取2 h）、次數(shù)（提取2 次）和濃縮程度（提取液濃縮至相對密度為1.25 ～1.30，醇沉濾液濃縮至相對密度為1.30 ～1.35）有規(guī)定。故以水作為提取溶劑，干浸膏收率、（R，S）-告依春收率為評價指標(biāo)，按原提取次數(shù)、提取時間，以水提取用量（A）、提取濃縮液醇沉?xí)r乙醇濃度（B）、醇沉?xí)r間（C）為3 個主要因素，開展3 個水平的正交試驗[2]。采用SPSSS 23.0 統(tǒng)計學(xué)軟件設(shè)計正交試驗因素水平表，見表1。

表1 正交試驗水平因素表

2.2 制備工藝正交試驗

按制劑處方比例各稱取板藍(lán)根50 g，山芝麻30 g，崗梅40 g，共9 份。按正交試驗表進(jìn)行水提醇沉工藝，藥材加水提取2 次，每次提取2 h，提取液合并濃縮至相對密度為1.25 ～1.30，加入相當(dāng)于濃縮液2倍體積的乙醇，醇沉后濾液濃縮至相對密度為1.30 ～1.35，得浸膏樣品，以考察各因素對藥材干浸膏和（R，S）-告依春收率的影響。

2.3 （R，S）-告依春含量測定

2.3.1 板藍(lán)根藥材處理

取板藍(lán)根藥材粉末（過4 號篩）約1 g，精密稱定，置100 mL 圓底燒瓶中，精密加水50 mL，稱定質(zhì)量，用電熱套回流提取2 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用水補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，以0.45 μm 微孔濾膜過濾，即得[3]。

2.3.2 溶液制備

稱取（R，S）-告依春對照品0.002 0 g，精密稱定，加水使其溶解并定容至50 mL 容量瓶中，搖勻，得質(zhì)量濃度為40 μg/mL 的對照品貯備液；精密吸取4 mL 置10 mL 容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，配制成16 μg/mL的（R，S）-告依春對照品溶液。分別稱取正交試驗項下浸膏樣品9 份，各0.5 g，精密稱定，置50 mL 具塞三角錐形瓶中，精密加水25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷至室溫，再稱定質(zhì)量，用水補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，以0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液[4-8]。

2.3.3 色譜條件[9]

色譜柱：Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水（12 ∶88）；檢測波長：244 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。在此條件下的色譜圖見圖1。

2.3.4 含量測定

按照板山崗顆粒中（R，S）-告依春含量測定方法[9]測得板藍(lán)根藥材中（R，S）-告依春含量為0.375 8 mg/g。

2.4 正交試驗結(jié)果

圖1 高效液相色譜圖

表2 正交試驗結(jié)果

表3 干浸膏收率方差分析

9 份樣品中的藥材干浸膏收率和板藍(lán)根中（R，S）-告依春含量測定結(jié)果見表2。根據(jù)正交試驗結(jié)果，采用SPSSS23.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3 和表4。由表2 可知，以干浸膏收率為評價指標(biāo)時，影響因素順序為水提取用量（因素A）＞醇沉?xí)r間（因素C）＞醇沉?xí)r乙醇濃度（因素B）；以（R，S）-告依春收率為評價指標(biāo)時，影響因素順序為：水提取用量（因素A）＞醇沉?xí)r乙醇濃度（因素B）＞醇沉?xí)r間（因素C）。經(jīng)方差分析可知，以干浸膏收率和（R，S）-告依春收率為評價指標(biāo)時，水提取用量（A）均為顯著性因素（P＜0.05），而醇沉?xí)r間、醇沉?xí)r乙醇濃度均不具有顯著性（P＞0.05），即水提取用量是最重要因素，即最佳工藝為水提取溶劑用量為（8+6）倍，醇沉?xí)r乙醇濃度為95%，醇沉?xí)r間為48 h。故選定最佳制備工藝為A2B3C1，即按處方量稱取處方藥材飲片，加水提取2 次，首次加水8 倍量提取2 h，第2次加水6 倍量提取2 h，提取液濃縮至相對密度為1.25 ～1.30，加入相當(dāng)于濃縮液2 倍體積的95%乙醇，醇沉48 h 后濾液濃縮成相對密度為1.30 ～1.35 的浸膏。2.5 驗證試驗

表4 （R，S）-告依春收率方差分析

按制劑處方比例各稱取板藍(lán)根50 g，山芝麻30 g，崗梅40 g，共3 份。按上述最佳提取工藝進(jìn)行重復(fù)驗證試驗。結(jié)果干浸膏收率分別為4.65% ，4.58% ，4.62%，（R，S）-告依春測得量分別為0.324 9 mg/g，0.326 7 mg/g，0.325 0 mg/g。可見，該工藝不僅干浸膏和代表性成分收率高，而且收率穩(wěn)定，為最佳提取工藝。

3 討論

方中板藍(lán)根為君藥，性味苦寒，功能清熱解毒，預(yù)防感冒、利咽，主要用于發(fā)熱咽痛、溫毒發(fā)斑、痄腮和爛喉丹痧等[3]；山芝麻和崗梅共為臣藥，兼具解表清熱、解毒消腫，同時生津止渴、利咽消腫，以輔佐宣濕解表，透達(dá)膜原[10-12]。（R，S）-告依春為方中君藥板藍(lán)根的主要化學(xué)成分，抗病毒作用明顯，為板藍(lán)根抗病毒作用的代表性化合物[13-14]，反映板藍(lán)根及其制劑質(zhì)量的重要指標(biāo)。目前，方中的山芝麻和崗梅2 味藥材在法定藥材標(biāo)準(zhǔn)中尚無含量檢測項，無法確定這2 味藥材的有效成分或代表性成分的含量測定方法，故本研究中采用板藍(lán)根藥材中代表性成分（R，S）-告依春的收率作為評價指標(biāo)。

本研究中采用高效液相色譜法測定板山崗顆粒中（R，S）-告依春的含量[9]，對樣品制備方法摸索、層析條件的試驗、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制和方法學(xué)考察等開展了研究工作，方法簡便快捷，準(zhǔn)確度高，專屬性強(qiáng)，故作為本研究的正交試驗及驗證試驗中（R，S）-告依春的測定方法。

本研究中主要對原有制劑配制工藝進(jìn)行優(yōu)化，對原工藝不明確的藥材提取工藝部分開展了研究。原制劑工藝（水煮提2 次，每次2 h，水提液合并濃縮后加入2 倍體積乙醇沉淀，濃縮成浸膏），未對水煮提的用水量作明確規(guī)定，濃縮醇沉?xí)r濃縮液配制成醇沉溶液時加入乙醇倍數(shù)雖有規(guī)定，但未對加入乙醇濃度和醇沉?xí)r間作規(guī)定，當(dāng)時的制劑配制研究人員也表示未開展相應(yīng)研究。為使恢復(fù)生產(chǎn)的配制工藝更加科學(xué)合理，以藥材提取干浸膏和（R，S）-告依春的收率為評價指標(biāo)，按原工藝的提取時間，以水煮提時的加水量、醇沉?xí)r加入乙醇濃度、醇沉?xí)r間為3 個主要因素，開展了3 個水平的正交試驗和驗證試驗，確定了該制劑藥材的最佳提取工藝。本研究結(jié)果表明，藥材提取干浸膏和（R，S）-告依春的收率最高，且提取方法穩(wěn)定可行，適用于板山崗顆粒的工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)，并為其質(zhì)量控制提供了有力依據(jù)，為進(jìn)一步開發(fā)中藥新藥奠定了基礎(chǔ)。