孫 瑜，田樹成

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院，遼寧 沈陽 110003）

烏頭湯出自《金匱要略》，由制川烏、麻黃、炙甘草、白芍、黃芪等中藥組方，具有溫經(jīng)散寒、祛濕鎮(zhèn)痛的功效，主要用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎及強(qiáng)直性脊柱炎等[1-2]。名老中醫(yī)李可在此基礎(chǔ)上配伍黑豆、防風(fēng)，以減少烏頭毒性[3-4]。制川烏為烏頭湯及改良烏頭湯的君藥，味辛、苦，性熱，有大毒，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)作用，臨床常用于治療風(fēng)濕類疾病。制川烏含有的單酯型生物堿既是活性成分，又是毒性成分，主要表現(xiàn)為對(duì)神經(jīng)、心臟的毒性[5-8]。本研究中采用超高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）技術(shù)分析烏頭湯及改良烏頭湯中單酯型生物堿化學(xué)成分在體內(nèi)的變化規(guī)律及差異，探討烏頭湯中制川烏不同配伍時(shí)單酯型烏頭生物堿含量的變化，并結(jié)合現(xiàn)代藥效學(xué)對(duì)配伍增效減毒的作用進(jìn)行闡述，為烏頭湯的配伍研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動(dòng)物

儀器：UPLC-MS/MS 分析系統(tǒng)（包括Agilent 1290型高效液相色譜儀和Agilent 6460 型質(zhì)譜檢測器）；LG16-B 型高速離心機(jī)（北京雷勃爾離心機(jī)有限公司）；Vortex-Genie2 型渦旋振蕩器（美國Scientific Industries公司）；1208BH 型超聲波清洗器（德國Bandelin Sonorex RK 公司）；HWS 24 型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；Miui-Q 型超純水機(jī)（美國Mililpore 公司）；AB265-S 型電子天平（瑞士Mettler Toledo）；PV-200 型足趾腫脹測定儀（成都泰盟軟件有限公司）。

試藥：甲醇、乙腈（美國ACS 恩科化學(xué)）；乙酸、乙酸銨（美國Sigma 公司），均為色譜純；水為超純水，其余試劑均為分析純；完全弗氏佐劑（CFA）、角叉菜膠（批號(hào)為021M0036V）均購自美國Sigma 公司，臨用時(shí)配成1%濃度的溶液。制川烏、麻黃、炙甘草、白芍、黃芪、黑豆、防風(fēng)購于沈陽遼河藥房，均經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院田樹成主任中藥師鑒定為正品。苯甲酰烏頭原堿對(duì)照品（批號(hào)為111794-201303），苯甲酰新烏頭原堿對(duì)照品（批號(hào)為111795-201303），苯甲酰次烏頭原堿對(duì)照品（批號(hào)為111796-201303），己酮可可堿對(duì)照品（批號(hào)為110736-201337），均購自中國食品藥品檢定研究院。

動(dòng)物：清潔級(jí)雄性SD 大鼠96 只，體質(zhì)量（270±30）g，許可證號(hào)為SCXK（黑）2013-001；昆明種小鼠48 只，普 通 級(jí)，體 質(zhì) 量（20±2） g，許 可 證 號(hào) 為SCXK（ 黑）2015-010，均購自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 方法

1.2.1 血液濃度檢測方法

1）溶液制備

對(duì)照品溶液：取各對(duì)照品適量，精密稱定，分別置容量瓶中，以甲醇溶解并定容，搖勻，得對(duì)照品溶液；精密吸取各對(duì)照品溶液置同一容量瓶中，甲醇定容至刻度，即得混合對(duì)照品溶液（苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿含量分別為5 ～5 000 ng/mL，2.5 ～2 500 ng/mL，2.5 ～2 500 ng/mL）。

供試品溶液：稱取過60 目篩的制川烏、炙甘草、麻黃、黃芪、白芍各3.0 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，混合均勻，加10 倍量水浸泡30 min，水浴加熱1 h（微沸），靜置10 min，8 層紗布濾過，合并濾液；殘?jiān)尤? 倍量水，水浴加熱1 h，靜置10 min，8 層紗布濾過，合并濾液；旋蒸濃縮至半流動(dòng)狀態(tài)，得提取浸膏，為烏頭湯浸膏（處方e）。改良烏頭湯處方，根據(jù)老中醫(yī)李可提出的在原烏頭湯處方基礎(chǔ)上配伍黑豆、防風(fēng)，稱取過60 目篩的制川烏、炙甘草、麻黃、黃芪、白芍、黑豆、防風(fēng)各3.0 g，精密稱定，制備方法同上，為改良烏頭湯浸膏（處方b）。

標(biāo)準(zhǔn)曲線血漿樣品及質(zhì)控樣品：精密吸取上述混合對(duì)照品溶液5 μL，加入空白血漿45 μL，渦旋30 s，配制成標(biāo)準(zhǔn)曲線血漿樣品，苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿含量分別為0.5 ～500 ng/mL，0.25 ～250 ng/mL，0.25 ～250 ng/mL。

2）色譜條件

色譜柱：Waters ACQULTY UPLC C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：0.1%甲酸水溶液（流動(dòng)相A）-乙腈（流動(dòng)相B），梯度洗脫（0 ～2 min 時(shí)流動(dòng)相A為95%→80%，2 ～3 min 時(shí)流動(dòng)相A 為80%→70%，3 ～4 min 時(shí)流動(dòng)相A 為70%→50%，4 ～5 min 時(shí)流動(dòng)相A 為50；流速：0.35 mL/min；進(jìn)樣量：1 μL；柱溫：30 ℃。

3）質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI 源），正離子檢測。掃描方式：多反應(yīng)離子監(jiān)測（MRM）；檢測離子質(zhì)荷比：苯甲酰新烏頭原堿590.3→105.1，苯甲酰烏頭原堿604.1→105.1，苯甲酰次烏頭原堿574.3→105.1，己酮可可堿278.3→180.1；干燥氣（N2）流速：11.0 L/min；Nebulizer：0.103 35 Mpa；干燥氣溫度：300 ℃；檢測器電壓：4 000 V。

4）血漿樣品處理方法

取大鼠血漿50 μL，加入200 μL 己酮可可堿溶液（20.0 ng / mL）渦旋1 min，于4 ℃、15 000 r / min 離心10 min，取上清液置離心管中，氮吹儀下氮?dú)獯蹈桑瑲埩粑镉?0 μL 甲醇-水（50 ∶50，V / V）溶解，于4 ℃、15 000 r / min 離心10 min，取上清液置進(jìn)樣瓶中，取1 μL 進(jìn)樣。

1.2.2 藥代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)

烏頭湯組和改良烏頭湯組SD 大鼠（各6 只）自由飲水，給藥前禁食12 h，灌胃給予提取液（給藥體積為20 mL/kg）。分別于給藥后0.083，0.25，0.5，1，1.5，2，4，6，8，12，24 h 時(shí)眼底靜脈叢毛細(xì)管取血約每只0.1 mL，肝素鈉抗凝，4 500 r/min 離心10 min，分離上層血漿，-40 ℃保存，備用。

1.2.3 大鼠足腫脹藥效學(xué)試驗(yàn)

藥物配制：依據(jù)給藥體積為20 mL/kg，處方b、處方e 臨用前以0.3% CMC -Na 配制成不同質(zhì)量濃度的混懸液，吲哚美辛以0.3% CMC - Na 配制成0.625 mg/mL 的混懸液，攪拌，超聲振蕩，混勻，給藥過程中不斷混勻。

大鼠足腫脹模型建立：取清潔級(jí)雄性SD 大鼠，試驗(yàn)前于試驗(yàn)環(huán)境適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后單次口服給藥，3 h 后足跖內(nèi)注射1%λ-角叉菜膠溶液。分別在致炎前（0 h）及致炎后1，2，3，4 h 時(shí)采用足趾測量儀測致炎足容積，計(jì)算足腫脹百分率。

腫脹度=致炎后足容積-致炎前足容積

腫脹率（%）= [（致炎后足容積-致炎前足容積）/致炎前足容積] ×100%

1.2.4 小鼠醋酸扭體鎮(zhèn)痛藥效學(xué)試驗(yàn)

藥物配制：依據(jù)給藥體積為20 mL/kg，處方b 臨用前以0.3% CMC-Na 配制成1.60，0.80，0.40 g/mL 的混懸液，處方e 臨用前以0.3% CMC-Na 配制成1.28，0.64，0.32 g/mL 的混懸液，羅通定片（山西三裕制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H14022278，規(guī)格為每片30 mg）研碎后以0.3% CMC-Na 配制成4.5 g/L 的混懸液，攪拌，超聲振蕩，混勻，給藥過程中不斷混勻。

小鼠醋酸扭體模型建立：處方b、處方e 單次灌胃給藥后3 h，羅通定混懸液單次灌胃給藥后0.5 h，空白對(duì)照組給予等體積0.3% CMC-Na，每只小鼠腹腔注射0.8%冰醋酸0.1 mL/10 g。由于刺激腹膜可引起扭體反應(yīng)，表現(xiàn)為腹部收縮、軀體扭曲、后肢伸展及蠕動(dòng)等。觀察并記錄注射致痛劑后20 min 內(nèi)各小鼠的扭體次數(shù)。

圖1 超高效液相提取色譜圖

2 結(jié)果

2.1 方法學(xué)考察

專屬性考察：取大鼠空白血漿、空白血漿+內(nèi)標(biāo)溶液+對(duì)照品、血漿樣品，按1.2.1 項(xiàng)下血漿樣品處理方法處理，依法進(jìn)樣。結(jié)果血漿的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾各成分和內(nèi)標(biāo)的測定，表明液質(zhì)行為及專屬性良好。色譜圖見圖1。

線性關(guān)系考察：取大鼠空白血漿，每份45 μL，加入混合對(duì)照品溶液5 μL，渦旋30 s，精密吸取各標(biāo)準(zhǔn)曲線血漿樣品50 μL，依法處理，按擬訂條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。采用加權(quán)（1/X2）最小二乘法，以待測成分峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值（Y）對(duì)樣品質(zhì)量濃度（X）進(jìn)行曲線擬合回歸，得回歸方程，定量限以信噪比（S/N）≥10計(jì)。結(jié)果見表1。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果

準(zhǔn)確度和精密度試驗(yàn)：配制低、中、高3 個(gè)質(zhì)量濃度的對(duì)照品血漿樣品，依法處理，每個(gè)質(zhì)量濃度取6 份樣品，1 d 內(nèi)分別測定6 份樣品，并各取1 份樣品連續(xù)測定3 d，計(jì)算日內(nèi)、日間精密度。結(jié)果見表2，表明方法準(zhǔn)確度好，儀器精密度好。

表2 在血漿中化合物回收率、基質(zhì)效應(yīng)及日內(nèi)與日間精密度試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

回收率試驗(yàn)與基質(zhì)效應(yīng)測定：分別制備低、中、高質(zhì)量濃度的含藥質(zhì)控樣品，依法進(jìn)樣分析，記錄峰面積，每個(gè)質(zhì)量濃度平行測定6 份，記錄待測物和內(nèi)標(biāo)的峰面積比值（A）；另取空白血漿，依法加入對(duì)應(yīng)的低、中、高濃度的系列對(duì)照品溶液進(jìn)樣分析，記錄待測物和內(nèi)標(biāo)的峰面積比值（B），每個(gè)質(zhì)量濃度平行測定6 份，提取回收率（% ） =A/B×100%。另用流動(dòng)相將標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制成與上述理論濃度相同的低、中、高質(zhì)量濃度溶液直接進(jìn)樣分析，每個(gè)質(zhì)量濃度平行測定6 份，記錄待測物和內(nèi)標(biāo)的峰面積比值（C），基質(zhì)效應(yīng)（% ） = B/C×100%。低、中、高質(zhì)量濃度的回收率和基質(zhì)效應(yīng)見表2。結(jié)果表明，所建方法能滿足生物樣品的測定要求。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取各成分低、中、高3 個(gè)質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品室溫放置、自動(dòng)進(jìn)樣器內(nèi)、-40 ℃長期冷凍、冷凍-解凍3 個(gè)循環(huán)等不同存儲(chǔ)條件下的穩(wěn)定性。結(jié)果見表3。表明，血漿樣品室溫放置4 h、血漿樣品處理后在自動(dòng)進(jìn)樣器內(nèi)放置24 h、血漿樣品冷凍-解凍循環(huán)3 次、血漿樣品長期冷凍于-40 ℃冰箱內(nèi)30 d，各成分的RSD均小于15%。

2.2 藥代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)

烏頭堿類化合物在大鼠體內(nèi)的平均藥-時(shí)曲線見圖2。血藥濃度數(shù)據(jù)采用PKSolver V 2.0 軟件計(jì)算，以藥物半衰期（t1/2）、達(dá)峰濃度（Cmax）、達(dá)峰時(shí)間（tmax）和藥-時(shí)曲線下面積（AUC）等參數(shù)表征該藥物的藥代動(dòng)力學(xué)特征（各時(shí)間點(diǎn)血漿中均能檢測到，具有完整的體內(nèi)過程），運(yùn)用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。結(jié)果見表4。烏頭湯配伍黑豆、防風(fēng)后，苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿的Cmax，AUC0-t，AUC0-∞均顯著下降。

表3 化合物在大鼠血漿的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.3 大鼠足腫脹藥效學(xué)評(píng)價(jià)

處方b 和處方e 不同濃度對(duì)角叉菜膠誘導(dǎo)大鼠足腫脹的影響以足腫脹率進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果見圖3。給藥后，與模型組相比，吲哚美辛具有明顯的抑制足腫脹作用。同時(shí)，處方b、處方e 也能劑量依賴性地抑制角叉菜膠誘導(dǎo)大鼠的足腫脹，其中處方b 高、中、低3 個(gè)質(zhì)量濃度水平的效果都優(yōu)于處方e。

2.4 小鼠醋酸扭體鎮(zhèn)痛效果評(píng)價(jià)

處方b 和處方e 不同質(zhì)量濃度對(duì)醋酸誘導(dǎo)小鼠腹部疼痛的影響，以一定時(shí)間內(nèi)小鼠扭體次數(shù)進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果見圖4。處方b 和處方e 都對(duì)醋酸誘導(dǎo)小鼠的扭體次數(shù)有一定的抑制作用，其中處方b 高、中、低3 個(gè)質(zhì)量濃度水平的扭體次數(shù)較處方e 的更低，抑制效果明顯，且相對(duì)穩(wěn)定。

圖2 灌胃處方后3 種單酯型烏頭堿的藥-時(shí)曲線圖

表4 大鼠灌胃提取液后烏頭堿類化合物的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)（± s，n=6）

表4 大鼠灌胃提取液后烏頭堿類化合物的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)（± s，n=6）

注：與烏頭湯比較，*P ＜0.05。MRT 為平均駐留時(shí)間。

化合物A B C處方烏頭湯改良烏頭湯烏頭湯改良烏頭湯烏頭湯改良烏頭湯t1 /2（min）654±39 634±28 416±24 439±16 459±42 461±26 Cmax（ng/mL）40.8±12.4 30.2±8.04*21.6±3.5 20.2±2.1 32.5±10.8 23.8±5.63*Tmax（min）30（30，45）30（30，45）30（30，45）30（30，45）30（30，45）30（30，45）AUC0 -t[ng/ （h·mL）]5 016±453 3 653±146*3 126±246 2 916±198 3 045±146 2 039±117*AUC0 -∞[ng/ （h·mL）]6 054±503 4 716±294*3 894±164 3 593±108 4 015±126 3 025±116*MRT0 -t（min）572±15 554±12 314±26 325±19 367±28 385±27

圖3 處方b 和處方e 不同質(zhì)量濃度對(duì)角叉菜膠誘導(dǎo)大鼠足腫脹的影響

圖4 不同質(zhì)量濃度處方b 和處方e 對(duì)小鼠醋酸扭體鎮(zhèn)痛效果的影響

3 討論

高靈敏度的UPLC-MS/MS 檢測手段逐漸應(yīng)用到中藥復(fù)雜成分的分析及血漿中化學(xué)成分的研究[9-11]。本研究結(jié)果顯示，本方法準(zhǔn)確度、精密度、靈敏度和專屬性較高，符合生物樣品分析方法要求。己酮可可堿性質(zhì)穩(wěn)定，易溶于甲醇，在正電離模式下響應(yīng)良好，不干擾其他內(nèi)源性成分的測定，可滿足測試需要。

處方b 血漿中發(fā)現(xiàn)，黑豆、防風(fēng)的配伍抑制了苯甲酰新烏頭原堿和苯甲酰次烏頭原堿的吸收，Cmax值和AUC0-t值明顯下降。制川烏配伍防風(fēng)、黑豆均可明顯降低制川烏中的單酯型烏頭生物堿在體內(nèi)的含量，說明配伍防風(fēng)、黑豆可有效地降低烏頭湯的毒性。烏頭堿型二萜生物堿既是川烏的活性成分，也是其毒性成分[12-13]，治療量與中毒量非常接近，極易發(fā)生中毒事件，配伍防風(fēng)、黑豆后降低了烏頭堿型二萜生物堿在體內(nèi)的濃度，達(dá)到了減毒的效果。

角叉菜膠致大鼠足腫脹模型常用于評(píng)價(jià)或篩選藥物抗炎作用的經(jīng)典急性炎癥模型，在新藥評(píng)價(jià)中應(yīng)用非常廣泛。本研究中通過藥物作用于角叉菜膠致大鼠足腫脹模型后，發(fā)現(xiàn)處方b、處方e 對(duì)角叉菜膠引起的足腫脹均有明顯的抗炎作用[14-15]。小鼠醋酸扭體模型是通過于小鼠的腹膜內(nèi)腔內(nèi)注射乙酸誘導(dǎo)急性炎癥疼痛，其特征在于經(jīng)后肢牽張腹部肌肉系統(tǒng)的收縮波，稱之為扭體反應(yīng)，扭體發(fā)作次數(shù)的多少可反映動(dòng)物對(duì)乙酸引起疼痛的反應(yīng)強(qiáng)弱[16-17]。本研究結(jié)果顯示，處方b、處方e 對(duì)乙酸刺激小鼠誘導(dǎo)的疼痛反應(yīng)有明顯的抑制作用，處方b 的鎮(zhèn)痛作用優(yōu)于處方e。

綜上所述，處方b（即改良烏頭湯）達(dá)到了減毒增效的效果，有利于關(guān)節(jié)炎的治療。該結(jié)論可為下一步開展烏頭湯減毒增效配伍的機(jī)制研究提供了參考。