馬睿霄等

摘要：用70%乙醇對(duì)雙齒圍沙蠶進(jìn)行熱浸提后，得到雙齒圍沙蠶浸膏。然后對(duì)得到的浸膏依次用石油醚、乙酸乙酯及正丁醇進(jìn)行萃取，得到3部分萃取物。對(duì)雙齒圍沙蠶浸膏及各有機(jī)溶劑萃取部分進(jìn)行抑菌試驗(yàn)和血管緊張肽I轉(zhuǎn)化酶（ACE）抑制測(cè)試。結(jié)果表明，雙齒圍沙蠶浸膏及各有機(jī)溶劑萃取部分均具有抑制ACE作用，且具有劑量依賴性。雙齒圍沙蠶石油醚萃取部分對(duì)枯草芽孢桿菌和大腸桿菌有抑菌活性，乙酸乙酯萃取部分對(duì)枯草芽孢桿菌、希瓦氏菌以及金黃色葡萄球菌具有抑菌活性，正丁醇萃取部分對(duì)希瓦氏菌具有抑菌活性。

關(guān)鍵詞：雙齒圍沙蠶；浸膏；抑菌作用；血管緊張肽I轉(zhuǎn)化酶

雙齒圍沙蠶（Perinereis aibuhitensis），又名沙蟲、海蟲、海蜈蚣等，分類學(xué)上屬于環(huán)節(jié)動(dòng)物門、多毛綱、沙蠶科、圍沙蠶屬[1]。雙齒圍沙蠶廣泛分布于我國(guó)渤海、黃海、東海。南海沿海灘涂[2]。雙齒圍沙蠶具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，含有豐富的粗脂肪、粗蛋白、不飽和脂肪酸，人體必需的八種氨基酸以及多種礦物質(zhì)和維生素，享有海中“冬蟲夏草”的美稱[3-4]。因?yàn)樯承Q養(yǎng)殖成本低，經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，被廣泛用于魚、蝦、蟹人工育苗和養(yǎng)殖。

海洋無脊椎動(dòng)物因其特殊的生活環(huán)境，代謝產(chǎn)物具有結(jié)構(gòu)新穎獨(dú)特、生物活性較強(qiáng)的特點(diǎn)。本研究中，制備雙齒圍沙蠶浸膏并對(duì)其抗菌活性及ACE酶抑制活性進(jìn)行研究，旨在為雙齒圍沙蠶的開發(fā)利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1材料和方法

1.1材料

雙齒圍沙蠶（Perinereis aibuhitensis）于2013年在遼寧省大連市長(zhǎng)興市場(chǎng)購買；抑菌試驗(yàn)菌種：大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、產(chǎn)氣桿菌（Aerobacter aerogenes）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、希瓦氏菌（Shewanella sp.）5種細(xì)菌由大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

馬尿酸、血管緊張肽I轉(zhuǎn)化酶（ACE）、馬尿酰-組氨酰-亮氨酸（Hip-His-Leu）購于美國(guó)Sigma公司；甲醇，色譜純；冰乙酸、三氟乙酸為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2方法

1.2.1雙齒圍沙蠶浸膏的制備1 354 g新鮮雙齒圍沙蠶，勻漿粉碎后置于圓底燒瓶中，加入4倍體積（V/W）70%乙醇熱浸提2 h，濾出提取液，殘?jiān)欣^續(xù)加4倍體積（V/W）70%乙醇提取，重復(fù)3次。合并浸提液，離心取上清液進(jìn)行減壓濃縮，將濃縮液凍干后得雙齒圍沙蠶總浸膏。

將上述得到的總浸膏依次用等體積的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進(jìn)行萃取，每種溶劑萃取3次。將萃取液減壓濃縮，自然風(fēng)干，得到石油醚層浸膏（7.06 g），乙酸乙酯層浸膏（3.77 g），正丁醇層浸膏（11.44 g）。

1.2.2ACE抑制活性測(cè)試ACE抑制活性的測(cè)定參照朱曉杰的方法[5]。用含有6.8 mmol·L-1 NaCl的0.2 mol·L-1硼酸鹽緩沖液（pH=8.3），將Hip-His-Leu配成7.6 mmol·L-1的溶液。ACE配置成60 mu/L后冷凍保藏備用。

將5 μL樣品加入到15 μm/L的ACE中37 ℃預(yù)熱5 min，之后加入25 mL HHL，37 ℃下反應(yīng)30 min，后加入5 μL 10%的三氟乙酸終止反應(yīng)，將反應(yīng)液加入到高效液相中進(jìn)行檢測(cè)分析，定量測(cè)定馬尿酸的峰面積。將得到的峰面積與空白試驗(yàn)的馬尿酸峰面積進(jìn)行比較。（空白試驗(yàn)只將樣品換做蒸餾水，其他操作均相同）

HPLC流動(dòng)相為含有0.1%TFA和0.05%乙酸的30%的甲醇溶液。流速為1 mL/min。

1.2.3抑菌活性測(cè)試抑菌試驗(yàn)采用濾紙片法，結(jié)果以抑菌圈直徑的大小來鑒定。固體培養(yǎng)基采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，每1 000 mL培養(yǎng)基內(nèi)分別加入NaCl 5.0 g、牛肉膏3.0 g、蛋白胨10.0 g。并且以每200 mL加入4 g的比例加入瓊脂粉，配制好以后將pH調(diào)至7.2～7.4之間。放入到高壓滅菌鍋內(nèi)120 ℃滅菌20 min，并趁熱在無菌操作臺(tái)中倒入平板培養(yǎng)皿中備用。液體培養(yǎng)基同固體培養(yǎng)基相比除不加瓊脂粉以外，其他成分相同。

將雙齒圍沙蠶石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取部分溶于生理鹽水中，空白對(duì)照組則為生理鹽水。陽性對(duì)照樣品為青霉素。

菌液的配制：分別將大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、產(chǎn)氣桿菌、希瓦氏菌，各自取一接菌環(huán)，放入到液體培養(yǎng)基中，放入后在搖床中37 ℃搖床培養(yǎng)2 h。在無菌操作臺(tái)中，將事先配置好的菌液每個(gè)吸取80 μL均勻涂布在培養(yǎng)皿中，并做3個(gè)平行對(duì)照，然后將濾紙片分別蘸取事先配制好的樣品放置于涂布好菌液的平板培養(yǎng)皿中，放入培養(yǎng)箱中，36 ℃培養(yǎng)24 h。

2結(jié)果與討論

2.1雙齒圍沙蠶浸膏的ACE抑制活性

雙齒圍沙蠶浸膏對(duì)ACE酶具有抑制作用。總浸膏以及正丁醇層浸膏表現(xiàn)出了隨濃度增加而抑制率升高的規(guī)律，而石油醚和乙酸乙酯萃取部分沒有明顯的劑量依賴性。由圖1可知，100 mg/mL的沙蠶總浸膏提取物對(duì)ACE酶抑制率最高，高達(dá)84.07%。10 mg/mL的石油醚層提取物抑制率最低，為44.72%。石油醚層萃取部分的抑制率最高體現(xiàn)在50 mg/mL劑量組，抑制率為53.26%。乙酸乙酯萃取部分的最高抑制率在20 mg/mL，抑制率為62.72%。正丁醇萃取部分的最高抑制率在50 mg/mL，抑制率為61.79%。

ACE抑制劑不僅僅具有降低血壓，擴(kuò)張血管的作用，還能增加機(jī)體對(duì)胰島素的敏感性，對(duì)人體具有改善糖代謝紊亂的作用[6]。海洋無脊椎動(dòng)物的提取物很多都具有降血壓以及治療和預(yù)防心腦血管疾病的的作用，例如從海星體壁中提取出來的一種酸性粘多糖，可以顯著降低血清中膽固醇的含量，改善微循環(huán)，而且還可以抑制紅細(xì)胞的聚集從而防止血栓形成，對(duì)治療冠心病，腦血栓等心腦血管疾病很有幫助[7]。從海洋無脊椎動(dòng)物海燕中提取法得到的海燕皂苷樣品也具有一定的抑制ACE的活性[8]。因此從雙齒圍沙蠶中分離安全而有效的降血壓活性成分，具有潛在的進(jìn)一步研究?jī)r(jià)值。

2.2雙齒圍沙蠶浸膏的抑菌活性

由表1可知，雙齒圍沙蠶的乙醇萃取部分對(duì)產(chǎn)氣桿菌沒有抑制活性，對(duì)大腸桿菌具有抑制作用的只有石油醚萃取部分；對(duì)金黃色葡萄球菌只有乙酸乙酯萃取部分有一定抑制活性；枯草芽孢桿菌則是石油醚層與乙酸乙酯萃取部分有抑制活性，且石油醚萃取部分抑制活性程度高于乙酸乙酯萃取部分和總浸膏；希瓦氏菌則是乙酸乙酯與正丁醇萃取部分有一定抑菌活性。不同有機(jī)溶劑提取的浸膏具有不同的抑菌活性，表明它們含有的化學(xué)成分不同。

很多海洋無脊椎動(dòng)物提取物都具有抑制微生物的生物活性。從海參中分離的皂苷Holotoxin A和B表現(xiàn)出了對(duì)多種病原微生物的生長(zhǎng)抑制活性[9]。從玉足海參中分離得到的玉足海參素也具有抗菌作用[10]。海參皂苷Scabraside A、B對(duì)7種真菌都有較強(qiáng)的抑制活性[11]。從羅氏海盤車中分離得到的SF-3、SF-4對(duì)白色念珠球菌和裂殖酵母菌都有較強(qiáng)的抑制作用[12]。因此，海洋無脊椎動(dòng)物是抑菌活性物質(zhì)的重要來源。

3結(jié)論

70%乙醇浸提所獲得的雙齒圍沙蠶浸膏以及石油醚、乙酸乙酯及正丁醇萃取部分均有抑制血管緊張肽I轉(zhuǎn)化酶（ACE）活性。石油醚萃取部分對(duì)枯草芽孢桿菌和大腸桿菌有抑菌活性，乙酸乙酯萃取部分對(duì)枯草芽孢桿菌、希瓦氏菌以及金黃色葡萄球菌具有抑菌活性，正丁醇萃取部分對(duì)希瓦氏菌具有抑菌活性。不同有機(jī)溶劑萃取部分具有不同的抑菌活性，表明它們含有的化學(xué)成分不同。

參考文獻(xiàn)：

[1] 蔣霞敏，柳敏海.沙蠶科的研究進(jìn)展[J].海洋科學(xué)，2008，32（4）： 82-86

[2]吳寶玲，孫瑞平，楊德漸.中國(guó)近海沙蠶科研究[M].北京：海洋出版社，1981：13-19，171-172

[3] 楊士平，劉慧玲，邱德全.天然和養(yǎng)殖沙蠶營(yíng)養(yǎng)成分分析[J].飼料工業(yè)，2013，34（10）：53-55

[4] 朱國(guó)萍，陳子騰，葉寧.湛江養(yǎng)殖雙齒圍沙蠶營(yíng)養(yǎng)成分的測(cè)定[J].當(dāng)代水產(chǎn)，2014（8）：76-77

[5] 朱曉杰，曾名湧，趙元暉，等.海地瓜蛋白酶解物類蛋白反應(yīng)修飾及其對(duì)ACE活性的影響[J].中國(guó)海洋藥物，2011，30（6）：6-12

[6] 郭承華，董新偉，賀君，等.海燕皂苷的抗炎活性的初步研究[J].中國(guó)生化藥物雜志，2010，31（4）：259-260

[7] 郭承華.海星資源的開發(fā)利用[J].生物學(xué)通報(bào)，1989（1）：7

[8] 李敏晶，韓艷玲，譚成玉，等.海燕皂苷抑制ACE活性的研究[J].廣東化工，2011，10（38）：9-10

[9] 劉雪莉，錢伯初.日本海洋天然活性物質(zhì)研究簡(jiǎn)況[J].中國(guó)海洋藥物，1997（1）：46-49

[10] 周清凱，楊惠英，蔡云見，等.玉足海參素的抗真菌作用及其臨床應(yīng)用[J].海洋藥物，1985，41（2）：37-39

[11] 韓華，易楊華，喇明平，等.糙海參皂苷Seabraside A、B的抗真菌和抗腫瘤活性[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2008，24（8）：1111-1112

[12] 周燕霞，趙麗華，邢翔，等.多棘海盤車多糖的提取及體外抑菌活性初探[J].中國(guó)海洋藥物，2009，28（3）：58-60