覃 曉，李 炎△，王 玲，饒偉文，向梵

（1. 廣西壯族自治區(qū)桂林市食品藥品檢驗(yàn)所，廣西 桂林 541012； 2. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530000）

楓香脂為金縷梅科楓香屬植物楓香樹Liquidambar formosanaHance 的干燥樹脂，作為傳統(tǒng)中藥，收載于2015 年版《中國(guó)藥典（一部）》[1]，有活血止痛、解毒生肌功效，用于治療跌打損傷、癰疽腫痛、內(nèi)外出血等。楓香脂含有樹脂和揮發(fā)油兩大類成分，其中樹脂部分含五環(huán)三萜類酸及酯類化合物，如齊墩果酮酸、羽扇豆酮酸、齊墩果酮醇，肉桂酸肉桂酯、肉桂酸肉桂醇等；揮發(fā)油部分含石竹烯、蒎烯、莰烯、松油烯、乙酸龍腦酯等數(shù)10 種化合物[2-6]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，楓香脂中揮發(fā)油有提高心肌耐缺氧能力、降低小鼠室顫發(fā)生率、提高冠脈流量、舒張血管、抑制血栓形成等[7-10]，以及抗腫瘤等作用[11-14]。此外，從楓香葉提取的揮發(fā)油還有明顯的抑菌作用，用于枇杷、砂糖橘、圣女果的防腐保鮮也有較好的效果[15-17]。楓香樹在我國(guó)分布廣泛，資源豐富。楓香脂中的揮發(fā)油常溫放置分層為兩部分：上層液體部分為楓香精油，下層半固體部分為楓香重油。為了進(jìn)一步開發(fā)楓香樹的利用價(jià)值，本研究中將這兩部分分別進(jìn)行抑菌性試驗(yàn)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料

1.1 儀器

BD240 型微生物培養(yǎng)箱，KB240 型生化培養(yǎng)箱，均購(gòu)自德國(guó)Binder 公司；AC2-4S1 型生物安全柜（新加坡Esco 公司）；Sup G6R 型菌落計(jì)數(shù)/篩選/抑菌圈測(cè)量聯(lián)用儀（杭州迅數(shù)科技有限公司）。

1.2 試藥

揮發(fā)油樣品（以液態(tài)楓香樹脂通過蒸餾法提取得到，收率為16% ），原植物經(jīng)檢驗(yàn)所饒偉文主任藥師鑒定為正品。慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)為130326-201716，含量每1 mg 相當(dāng)于637 U），環(huán)吡酮胺對(duì)照品（批號(hào)為100232-201402，含量99.8%），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。胰酪胨大豆蛋白瓊脂培養(yǎng)基（TSA，批號(hào)為180820），胰酪胨大豆蛋白液體培養(yǎng)基（TSB，批號(hào)為170722），沙 氏 葡 萄 糖 瓊 脂 培 養(yǎng) 基（SDA，批 號(hào) 為181127），沙 氏 葡 萄 糖 液 體 培 養(yǎng) 基（SDB，批 號(hào) 為180411），均購(gòu)于北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。丙酮為分析純，95%乙醇、聚山梨酯80 為化學(xué)純。

1.3 菌株

大腸埃希菌[CMCC（B）44102]、金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]、銅綠假單胞菌[CMCC（B）10104]、短小芽孢桿菌[CMCC（B）63202]、黑曲霉菌[CMCC（F）98003]，均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；白色念珠菌[CMCC（F）98001，購(gòu)自原南寧食品藥品檢驗(yàn)所]；表皮葡萄球菌[CMCC（B）29069]，福氏志賀氏菌（ATCC12022），均購(gòu)自桂林朝儀商貿(mào)有限公司；蠟樣芽孢桿菌[CMCC（B）63303]、產(chǎn)氣腸桿菌（ATCC13048）、鼠傷寒沙門氏菌（ATCC14028）、釀酒酵母（ATCC9763），均購(gòu)自原廣東省食品微生物安全工程技術(shù)研究開發(fā)中心；黃曲霉菌（CICC2219）購(gòu)自原中國(guó)工業(yè)微生物菌種管理中心。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法

2.1.1 溶液制備

菌懸液：取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、短小芽孢桿菌、表皮葡萄球菌、福氏志賀氏菌、蠟樣芽孢桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌甘油冷凍管，接種在TSB 培養(yǎng)基中，36 ℃條件下培養(yǎng)24 h，采用平板計(jì)數(shù)法，將菌液制成濃度為107～108的菌懸液，冰箱中保存，備用。取白色念珠菌、釀酒酵母菌甘油冷凍管，接種到SDB 液體培養(yǎng)基，28 ℃條件下培養(yǎng)48 h，同細(xì)菌計(jì)數(shù)法制成濃度為107～108的菌懸液，冰箱中保存，備用。取黑曲霉、黃曲霉的新鮮培養(yǎng)物，接種至SDA 斜面培養(yǎng)基，25 ℃條件下培養(yǎng)7 ～8 d，加入5 mL 含0.05% 聚山梨酯80的pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，將孢子洗脫，用無菌吸管吸出孢子液?？筛鶕?jù)用量多制備幾個(gè)斜面。同上述方法制備成濃度為105～106的菌懸液，冰箱中保存，備用。

供試品溶液：取樣品（半固體約50 ℃熔化）原液，作100%供試品溶液；取樣品（半固體約50 ℃熔化）50 mL，加丙酮至100 mL，搖勻，作50%供試品溶液。

對(duì)照溶液：取慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，精密稱定，根據(jù)對(duì)菌株的抑菌效力強(qiáng)弱加滅菌水制成10，20，100 U/mL 3 種濃度的細(xì)菌對(duì)照溶液。取環(huán)吡酮胺對(duì)照品10 mg，精密稱定，加乙醇制成質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL 的真菌對(duì)照溶液。

空白溶液：以100%丙酮作為空白溶液。

2.1.2 樣品抑菌性測(cè)定采用紙片法[16]。在安全柜里將完成滅菌的培養(yǎng)基傾注15 mL 于平皿中（細(xì)菌用TSA 培養(yǎng)基，霉菌用SDA培養(yǎng)基），待其凝固，在上面平鋪含5%細(xì)菌的TSA 培養(yǎng)基（或含4%霉菌、5%酵母菌的SDA 培養(yǎng)基）5 mL，制成帶菌平板；貼上浸泡約10 min 供試品溶液的紙片，同時(shí)用浸泡慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液的紙片作細(xì)菌抑菌性對(duì)照，用浸泡環(huán)吡酮胺對(duì)照溶液的紙片作霉菌、酵母菌抑菌性對(duì)照，用浸泡丙酮溶液的紙片作空白對(duì)照。每個(gè)板貼4 片，其中樣品成對(duì)角貼2 片，對(duì)照與空白成對(duì)角各1 片，平行3 份。細(xì)菌置36 ℃條件下培養(yǎng)24 h，真菌置28 ℃條件下培養(yǎng)48 h，測(cè)量抑菌圈直徑，重復(fù)2 次，結(jié)果取平均值，詳見表1。抑菌效果見圖1。樣品的抑菌活性與對(duì)照溶液抑菌活性進(jìn)行比較，又形成倍比關(guān)系，詳見表2。

2.1.3 最低抑菌濃度測(cè)定

稱取樣品，加滅菌的10%聚山梨酯80，混勻，用滅菌好的TSB 培養(yǎng)基（真菌用SDB 培養(yǎng)基）稀釋成20%的供試品溶液。采用等比稀釋法進(jìn)一步稀釋成20%，10%，5%，2.5%，1.25%，0.625%，0.312%，0.156%系列體積分?jǐn)?shù)。分別吸取10mL分裝試管，分別加1 種菌懸液各50 μL，搖勻。同時(shí)取相同稀釋劑，加適量聚山梨酯80，搖勻，分別作陰性和陽(yáng)性（陽(yáng)性管加菌懸液50 μL）對(duì)照。細(xì)菌36 ℃條件下培養(yǎng)24 h，真菌置28 ℃條件下培養(yǎng)48 h。吸取1 mL 培養(yǎng)好的樣品溶液注皿（每皿0.5 mL），傾注培養(yǎng)基搖勻待其凝固；同時(shí)從樣品溶液中取一環(huán)劃平板做同步試驗(yàn)，細(xì)菌用TSA 培養(yǎng)基、真菌用SDA 培養(yǎng)基，細(xì)菌36 ℃條件下培養(yǎng)24 h，真菌28 ℃條件下培養(yǎng)48 h。重復(fù)3 次。觀察平板，找出未長(zhǎng)菌的最低濃度，即為最低抑菌濃度。詳見表3。

圖1 樣品抑菌效果圖

表1 各溶液抑菌性比較（抑菌圈直徑，mm）

表2 50%供試品溶液抑菌活性倍數(shù)與對(duì)照溶液濃度比較

表3 樣品對(duì)各菌株的最低抑菌濃度（楓香重油/精油）

2.2 結(jié)果與分析

通過貼紙片法和最低抑菌濃度試驗(yàn)，楓香重油、楓香精油兩個(gè)供試品溶液對(duì)受試的14 種菌株均有不同程度抑制，兩者試驗(yàn)結(jié)果一致。從表1 及表3 可知抑菌強(qiáng)度：革蘭陽(yáng)性菌＞革蘭陰性菌，真菌類＞細(xì)菌類，芽孢類桿菌＞其他細(xì)菌，供試品溶液濃度與其抑菌活性呈量比關(guān)系，但不明顯，可能與油和有機(jī)溶劑的擴(kuò)散性有關(guān)。表2 中通過比較供試品溶液與對(duì)照品溶液抑菌活性，可直觀看出供試品溶液對(duì)每個(gè)菌株的抑菌活性強(qiáng)度。

3 討論

通過兩樣品不同菌株的抑菌試驗(yàn)證明，楓香脂中揮發(fā)油室溫下分層的兩部分對(duì)試驗(yàn)菌株的抑制作用差異不大，兩者對(duì)細(xì)菌類最低抑制濃度可達(dá)5%，對(duì)芽孢類桿菌甚至可達(dá)1.25% ，對(duì)霉菌最低抑制濃度可達(dá)1.25%，對(duì)酵母類最低抑制濃度可達(dá)0.625%。

從以往的文獻(xiàn)資料中可知，楓香脂精油對(duì)心血管及抗腫瘤方面都有較好的生物活性[7-14]。本研究結(jié)果表明，楓香脂精油對(duì)金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、大腸埃希菌、產(chǎn)氣腸桿菌、白色念珠菌、黃曲霉菌、釀酒酵母等14 個(gè)菌株均有較強(qiáng)的抑制作用，其作用強(qiáng)度優(yōu)于楓香葉揮發(fā)油[15-18]。楓香樹在我國(guó)資源豐富，新鮮楓香樹脂中揮發(fā)油含量高達(dá)15% ～20%，目前主要用作香精的原料，應(yīng)用范圍相對(duì)較窄。因此，繼續(xù)深入研究楓香脂揮發(fā)油在醫(yī)療、化工、食品行業(yè)上的應(yīng)用前景廣闊。

預(yù)試驗(yàn)中比較了乳化溶液貼紙片法、生物檢定（管碟）法[18-19]、表層涂布菌液培養(yǎng)基打孔法[20]、表層菌液涂布貼紙片法[21]，結(jié)果均有不穩(wěn)定性因素影響抑菌圈的圓整性、均勻性，甚至無法產(chǎn)生抑菌圈，表明供試品溶液制備和試驗(yàn)方法對(duì)抑菌性試驗(yàn)結(jié)果影響較大。經(jīng)綜合考慮各種影響因素，采用試劑溶解、加厚菌層、對(duì)照比對(duì)貼紙片法。每次的試液量相對(duì)恒定，菌層生長(zhǎng)均勻，容易得到大小均一、圓整透明的抑菌圈；四角對(duì)貼又可與對(duì)照、空白比較，一目了然。但要注意，抑菌圈直徑的大小受菌液濃度影響，菌懸液的濃度在使用過程中就是一個(gè)量變過程，所以菌液濃度應(yīng)控制在107左右，每次試驗(yàn)菌層濃度應(yīng)相同，且重復(fù)性試驗(yàn)盡量短時(shí)連續(xù)做。

最低抑菌濃度檢測(cè)直接將樣品加乳化劑制成乳液，采用試管等比稀釋，并用培養(yǎng)基稀釋法測(cè)定。此方法操作簡(jiǎn)單，無有機(jī)溶液干擾，且重復(fù)性好。

綜上所述，該方法操作簡(jiǎn)便，較穩(wěn)定。楓香脂中揮發(fā)油具有較強(qiáng)和較廣泛的抑菌作用，值得進(jìn)一步研究開發(fā)利用。