曾 敬，楊小利，劉漁凱，謝紅英

（中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)附屬大坪醫(yī)院心血管內(nèi)科·重慶市心血管病研究所，重慶 400042）

腎臟缺血再灌注損傷（RIRI）是臨床常見病理現(xiàn)象，腎移植、腎臟及其血管外科手術(shù)、體外沖擊波碎石等均有可能引起RIRI[1]。腎臟缺血再灌注會(huì)引起細(xì)胞凋亡和壞死，由此引起急性腎小管壞死，從而損傷腎臟功能，還可能影響腎臟功能的恢復(fù)，使疾病死亡率升高[2]。番茄紅素（lycopene）是植物中的一種天然色素，主要存在于茄科植物西紅柿的成熟果實(shí)中，具有強(qiáng)大的抗氧化作用[3]和促進(jìn)細(xì)胞自噬的作用[4]。既往研究證實(shí)，番茄紅素具有防護(hù)細(xì)胞及組織缺血再灌注損傷的作用[5-6]，但主要集中在心、腦等器官，對(duì)番茄紅素在腎臟缺血再灌注損傷中的作用及其具體機(jī)制的研究相對(duì)較少。自噬作為實(shí)現(xiàn)細(xì)胞本身的代謝需要和更新的重要途徑，是維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要機(jī)制，在調(diào)節(jié)缺血再灌注損傷中起到了重要作用[7]。其中LC3 Ⅱ是自噬的特異性蛋白，在自噬的調(diào)節(jié)機(jī)制中有關(guān)鍵性作用[8]。本研究中通過大鼠腎臟缺血再灌注模型，觀察番茄紅素對(duì)腎臟缺血再灌注后腎臟組織的影響，同時(shí)利用自噬抑制劑3-MA 來明確番茄紅素是否通過激活自噬途徑來減輕腎臟缺血再灌注損傷。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

動(dòng)物：選用健康雄性SD 大鼠（SPF 級(jí)）20 只，周齡8 ～9 周，體質(zhì)量200 ～250 g，由陸軍軍醫(yī)大學(xué)附屬大坪醫(yī)院動(dòng)物中心提供（動(dòng)物許可證編號(hào)為SCXK ＜渝＞2017-0006）。大鼠均給予常規(guī)喂養(yǎng)。符合陸軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的倫理審查要求。

試藥：番茄紅素（Sigma Aldrich，批號(hào)75051）；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、ATP 酶活性等均通過檢測試劑盒檢測，試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；其余試劑及有機(jī)溶劑均為分析純（Sigma Aldrich）。

1.2 模型建立及動(dòng)物分組

所有大鼠給予腹腔注射3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉，腹正中切口，切除右側(cè)腎臟，游離左側(cè)腎臟，備用。將大鼠隨機(jī)分為4 組：1）假手術(shù)組（A 組），術(shù)前30 min腹腔一次性注射等體積的0.9%氯化鈉注射液，全身麻醉后完成前文描述的手術(shù)部分后，與其他組動(dòng)物放置相同的時(shí)間。2）缺血再灌注組（B 組），術(shù)前30 min 腹腔一次性注射等體積的0.9%氯化鈉注射液，用血管夾夾閉左側(cè)腎蒂缺血1 h，打開血管夾再灌注1 h。3）番茄紅素+缺血再灌注組（C 組），術(shù)前30 min 腹腔一次性注射番茄紅素（20 mg/kg），用血管夾夾閉左側(cè)腎蒂缺血1 h，打開血管夾再灌注1 h。4）番茄紅素+3 -MA +缺血再灌注組（D 組），術(shù)前30 min 腹腔一次性注射番茄紅素（20 mg/kg）+3-MA（20 mg/kg），用血管夾夾閉左側(cè)腎蒂缺血1 h，打開血管夾再灌注1 h。結(jié)束后，取上述4 組大鼠左側(cè)腎臟，去除包膜，洗凈腎內(nèi)殘余血液，拭干，稱取0.5 g 制成組織勻漿，用不同試劑盒測定各組MDA含量、SOD 活性、Na+，K+ -ATP 酶和Ca2+/ATP 酶活性，并通過比較B 組與A 組大鼠的病理、生化改變，確定模型建立是否成功。

1.3 檢測指標(biāo)

腎臟病理：實(shí)驗(yàn)?zāi)I臟組織經(jīng)10%福爾馬林固定、乙醇脫水、石蠟包埋、切片，按HE 染色流程染色，顯微鏡下觀察病理結(jié)構(gòu)變化。

腎臟LC3 ⅡWestern Blot：取實(shí)驗(yàn)?zāi)I臟組織，液氮研磨后加含有1 μmol/L 的RIPA 裂解液（碧云天，P0013B）裂解提取蛋白，SDS-PAGE 電泳跑膠后半干轉(zhuǎn)至NC 膜，1 ∶1 000 比例稀釋LC3 抗體（Sigma Aldrich，L8918）和GAPDH（Sigma Aldrich，G9545）并孵育過夜，HRP 二抗孵育并常規(guī)顯色，使用Odyssey 掃膜儀掃描條帶后統(tǒng)計(jì)LC3 Ⅱ與GAPDH 的比值并計(jì)算。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。計(jì)量資料以表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用ANOVA單因素方差分析。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)各指標(biāo)的影響

結(jié)果見表1?？梢姡cA 組相比，B 組大鼠MDA 含量明顯增高，SOD 活性明顯下降。與B 組相比，C 組大鼠MDA 含量明顯降低，SOD 活性明顯升高；D 組大鼠番茄紅素對(duì)腎臟缺血再灌注后MDA 和SOD 的作用明顯減弱。與A 組比較，B 組大鼠的Na+，K+-ATP 酶、Ca2+/ATP 酶活性顯著下降（P ＜0.01），提示腎臟組織在缺血再灌注過程中發(fā)生脂質(zhì)過氧化，Na+，K+-ATP 酶、Ca2+/ATP 酶活性受到抑制；經(jīng)番茄紅素處理后，Na+，K+-ATP 酶、Ca2+/ATP 酶活性顯著增強(qiáng)（P ＜0.05），表明番茄紅素能減輕腎組織的脂質(zhì)過氧化損傷，保護(hù)腎臟功能。D 組的ATP 酶活性下降，表明上述保護(hù)作用可被3-MA 抑制。

表1 番茄紅素對(duì)腎臟缺血再灌注大鼠腎臟組織中各指標(biāo)的影響（± s，n=5）

表1 番茄紅素對(duì)腎臟缺血再灌注大鼠腎臟組織中各指標(biāo)的影響（± s，n=5）

注：與A 組相比，*P ＜0.05；與B 組相比，#P ＜0.05；與C 組相比，&P ＜0.05。圖2 同。

組別A 組B 組C 組D 組MDA（nmol/g）27±5 48±12*37±9#44±7&SOD（U/g）118±21 77±16*115±31#88±13&Na+，K+ -ATP 酶（μmolPi/mg·Pr·h）4.5±1.2 2.3±0.6*3.5±1.3#2.7±0.5&Ca2 + /ATP 酶（μmolPi/ mg·Pr·h）5.8±1.5 3.1±1.7*4.6±1.4#3.5±1.1&

2.2 減輕腎臟缺血再灌注損傷

腎臟缺血再灌注后HE 染色切片顯示，缺血再灌注引起腎小管上皮細(xì)胞腫脹，而番茄紅素能明顯減輕缺血再灌注引起的腎小管上皮細(xì)胞腫脹；但在D 組中，番茄紅素保護(hù)作用明顯減弱，提示番茄紅素的保護(hù)機(jī)制有可能是通過調(diào)控細(xì)胞的自噬活動(dòng)。見圖1。

圖1 腎臟缺血再灌注后各組腎臟組織切片HE 染色（×400）

2.3 增加腎臟自噬相關(guān)蛋白LC3 Ⅱ表達(dá)

LC3 Ⅱ的形成是自噬增強(qiáng)的一個(gè)指標(biāo)，通過對(duì)各組大鼠腎臟LC3 Ⅱ表達(dá)量的檢測，發(fā)現(xiàn)缺血再灌注引起腎臟LC3 Ⅱ表達(dá)升高，番茄紅素可進(jìn)一步增加腎臟缺血再灌注時(shí)LC3 Ⅱ的表達(dá)，但3-MA 可阻斷番茄紅素對(duì)LC3 Ⅱ表達(dá)的上調(diào)作用，提示番茄紅素可能通過激活腎臟自噬而改善缺血再灌注損傷。見圖2。

圖2 腎臟缺血再灌注后各組腎臟組織LC3 Ⅱ蛋白水平

3 討論

持續(xù)性的腎臟缺血將造成不可逆的損傷，盡快恢復(fù)腎臟的血供是治療腎臟缺血的前提，但再灌注的同時(shí)也可能帶來進(jìn)一步的腎臟再灌注損傷[9]。氧化應(yīng)激和自噬都是組織細(xì)胞在缺血再灌注過程中都存在的病理生理現(xiàn)象。缺血再灌注導(dǎo)致的組織細(xì)胞損傷主要與自由基、鈣超載、白細(xì)胞增加、高能磷酸化物缺乏等密切相關(guān)[10]。而自噬一般被認(rèn)為是細(xì)胞在氧化應(yīng)激及營養(yǎng)匱乏等條件下的一種自我保護(hù)機(jī)制。通常情況下，自噬維持在較低水平，但ATP 能量耗竭、活性氧的釋放、線粒體膜通道的開放都會(huì)導(dǎo)致自噬活性迅速升高，故在缺血再灌注過程中的自噬活性增強(qiáng)。

在腎臟缺血再灌注損傷過程中，由于組織缺血缺氧，ATP 生成減少，膜泵失效，細(xì)胞內(nèi)Ca2+增加，激活Ca2+依賴性蛋白酶，使黃嘌呤脫氫酶大量轉(zhuǎn)變?yōu)辄S嘌呤氧化酶，而黃嘌呤氧化酶催化產(chǎn)生大量的活性氧自由基可損傷組織[11]。MDA 是膜脂過氧化的重要產(chǎn)物，能加劇細(xì)胞膜的損傷，因此通過MDA 了解膜脂過氧化的程度，可間接測定膜系統(tǒng)的受損程度，升高提示組織或細(xì)胞損傷明顯[12]。SOD 是組織自身存在的一種抗氧化金屬酶，能催化超氧陰離子自由基歧化生成氧和過氧化氫，在機(jī)體氧化與抗氧化平衡中可起到至關(guān)重要的作用[13]。腎小管基底膜內(nèi)側(cè)膜有Na+，K+-ATP 酶，主要起到排Na+保K+的作用，是維持細(xì)胞內(nèi)Na+和K+濃度穩(wěn)定的重要調(diào)節(jié)酶，在缺血再灌注損傷時(shí)，其調(diào)節(jié)功能受到損傷[14]。同樣，在缺血再灌注損傷發(fā)生時(shí)，還可造成Ca2+-ATP 酶受損，這也是引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載的原因之一[15]。既往研究表明，番茄紅素對(duì)心、腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用[16]，其保護(hù)機(jī)制除了抗氧化作用外，還有激活細(xì)胞內(nèi)自噬活動(dòng)的作用[4]，而對(duì)腎臟缺血再灌注過程中自噬的影響尚不明確。

本研究結(jié)果顯示，腎臟缺血再灌注后腎臟組織的MDA 含量明顯增高，SOD 活性明顯下降，其酶活性也明顯下降，證實(shí)了缺血再灌注對(duì)腎臟造成了損傷，確定了建模的成功。在給予番茄紅素處理后，其MDA 含量明顯降低，SOD 活性明顯升高，酶活性同樣得到一定程度的恢復(fù)，說明了番茄紅素對(duì)腎臟缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用。同時(shí)，HE 染色結(jié)果也支持上述結(jié)論。在對(duì)番茄紅素與自噬相關(guān)性的研究中發(fā)現(xiàn)，通過檢測LC3 Ⅱ表達(dá)量的變化，應(yīng)用番茄紅素處理后大鼠腎臟LC3 Ⅱ表達(dá)明顯升高，使用自噬抑制劑3-MA 可明顯減弱番茄紅素對(duì)LC3 Ⅱ表達(dá)升高的作用。同時(shí)，使用3-MA 后，由生化學(xué)和酶學(xué)的研究結(jié)果可見，番茄紅素對(duì)腎臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用被抑制，提示番茄紅素可能是通過自噬減輕了腎臟的缺血再灌注損傷程度。

綜上所述，番茄紅素在腎臟缺血再灌注損傷中具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能是通過激活自噬來減輕腎臟缺血再灌注損傷。