杜祎，張金玲，朱思榮，張利群，趙曉華，史建國，畢春元

(齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)山東省科學(xué)院生物研究所 山東省生物傳感器重點實驗室，山東 濟(jì)南 250014)

乳糖是牛乳中特有的一種雙糖，并且其在牛乳中的含量是相對穩(wěn)定的[1]。乳糖不僅可以促進(jìn)鈣離子的吸收，還可以促進(jìn)有益菌的生長，有利于腸道健康。但是有些人體內(nèi)缺少乳糖酶，食用過量的乳糖會出現(xiàn)腹瀉、腹痛等癥狀，因此建立一種簡單、快速的檢測方法是十分重要的[2-3]。目前國標(biāo)中規(guī)定乳糖的檢測方法有高效液相色譜法和萊因-埃農(nóng)氏法。高效液相色譜法[4-7]雖然結(jié)果準(zhǔn)確，但成本高，操作繁瑣；萊因-埃農(nóng)氏法終點不易判斷，容易引起系統(tǒng)誤差[8-11]。

本研究建立了一種快速檢測乳糖的方法——復(fù)合膜生物傳感器差分法。采用酶固定化技術(shù)，將半乳糖苷酶和葡萄糖氧化酶固定于載體膜上形成復(fù)合膜，并安裝在一個電極上，另外一個電極上安裝葡萄糖酶膜，兩個酶膜發(fā)生反應(yīng)的最終產(chǎn)物過氧化氫通過過氧化氫電極檢測，經(jīng)過差分處理，測定乳糖的含量。這樣不僅可排除本底葡萄糖測定的干擾，還可以同時檢測葡萄糖和乳糖的含量。此方法快速準(zhǔn)確，易于操作，專一性強(qiáng)。

1 材料與儀器

葡萄糖氧化酶、半乳糖苷酶(Sigma公司)；牛血清蛋白、戊二醛(上?；瘜W(xué)試劑采購供應(yīng)站進(jìn)口分裝)；乳糖(Sigma公司)；“O”型空圈、SBA緩沖液(山東省科學(xué)院生物研究所)；核微孔膜(美國Nucleopore公司)；其他試劑均為分析純，所用水為蒸餾水。

SBA-40D型生物傳感分析儀(山東省科學(xué)院生物研究所)；50 μL微量進(jìn)樣(上海光正醫(yī)療儀器有限公司)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)；分析天平(德國賽多利斯集團(tuán))。

2 實驗方法

2.1 乳糖-葡萄糖復(fù)合膜及葡萄糖氧化酶膜的制備

首先將“O”型圈粘在核微孔膜上制成載體膜，置于30%甲醇溶液中浸泡30 min后用蒸餾水沖洗，在烘箱中烘干，取出備用。以5.0%戊二醛為交聯(lián)劑分別將葡萄糖氧化酶和半乳糖苷酶-葡萄糖氧化酶固定在載體膜上，在40 ℃烘箱中烘20 min，取出放在4 ℃冰箱中備用。

2.2 測定原理

H2O2→O2+2H++2e-

乳糖通過半乳糖苷酶分解成半乳糖和葡萄糖，葡萄糖再被葡萄糖氧化酶分解成葡萄糖酸，產(chǎn)生過氧化氫，通過過氧化氫電極產(chǎn)生電信號，再通過SBA-40D型生物傳感分析儀將電信號轉(zhuǎn)化成直接讀取的數(shù)字信號，通過差分處理，即可準(zhǔn)確快速地直接測定乳糖的含量。

2.3 乳糖-葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液的配制

取適量乳糖和葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品放入稱量瓶中，于104 ℃烘干箱內(nèi)烘4 h，然后在干燥器內(nèi)冷卻，待冷卻完全后，準(zhǔn)確稱取1.500 0 g乳糖、1.000 0 g葡萄糖，用蒸餾水溶解后轉(zhuǎn)移至1 L容量瓶中，定容備用。

2.4 樣品測定

采用0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液體系，在SBA-40D生物傳感分析儀上分別安裝乳糖酶膜和葡萄糖酶膜，接通電源，采用差分法，當(dāng)儀器顯示基礎(chǔ)定標(biāo)時，用微量進(jìn)樣針準(zhǔn)確吸取25 μL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液注入反應(yīng)池內(nèi)，重復(fù)此操作直至出現(xiàn)定標(biāo)通過。接著當(dāng)儀器顯示“差值定標(biāo)，請進(jìn)樣品”字樣時，取25 μL乳糖標(biāo)準(zhǔn)液注入反應(yīng)池內(nèi)，同樣重復(fù)此操作直至定標(biāo)通過，接下來就可以檢測樣液中乳糖的含量。采用差分法可以自動減去樣品中葡萄糖的含量，從而屏幕中直接顯示乳糖和葡萄糖的含量。

2.5 生物傳感器法測定乳糖的最適pH

本研究采用的磷酸鹽緩沖液體系，分別配制pH 為4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0的緩沖劑，研究不同pH對乳糖測定體系的影響。

2.6 線性實驗

分別配制濃度為0.30 ，0.60，0.90 ，1.20 ，1.50 g/L的乳糖標(biāo)準(zhǔn)液和濃度為0.20，0.40 ，0.60 ，0.80 ，1.00 g/L的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，每個濃度重復(fù)測定3次，計算生物傳感器法測定乳糖和葡萄糖的線性。

2.7 乳糖和葡萄糖混合液對乳糖電極和葡萄糖電極測定的干擾性

對乳糖和葡萄糖混合液進(jìn)行測定，在1.50 g/L乳糖溶液中分別添加濃度為0.20，0.40，0.60，0.80，1.00 g/L的葡萄糖。在1.0 g/L葡萄糖溶液中分別添加濃度為0.30，0.60，0.90，1.20，1.50 g/L的乳糖，分別測定乳糖和葡萄糖的含量。

2.8 生物傳感器法對乳糖測定的穩(wěn)定性

對1.50 g/L乳糖標(biāo)準(zhǔn)液連續(xù)測定10次，并計算生物傳感器法測定乳糖的精密度。

2.9 生物傳感器法測定乳糖的回收率

先測定5個不同濃度的乳糖樣品，然后依次添加同體積的濃度為0.50，0.40，0.30，0.20，0.10 g/L的乳糖標(biāo)液，計算生物傳感器法測定乳糖的加標(biāo)回收率。

2.10 不同方法測定牛乳中乳糖含量的對比

采用生物傳感器法和高效液相色譜法(HPLC)分別對超市中出售的兩種名牌牛奶中的乳糖進(jìn)行測定，對測定結(jié)果進(jìn)行對比。

2.11 生物傳感器法測定乳糖專一性檢測

分別對濃度為1.5 g/L的乳糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、淀粉標(biāo)準(zhǔn)液，用生物傳感器法進(jìn)行測定，檢測生物傳感器法測定乳糖的專一性。

3 結(jié)果與分析

3.1 生物傳感器法測定乳糖的最適pH

在此測定體系中，乳糖酶膜是半乳糖苷酶和葡萄糖氧化酶這兩種酶組成的復(fù)合酶膜，而葡萄糖氧化酶最適pH為5.0左右，半乳糖苷酶最適pH為6.6左右，故需要找到復(fù)合酶膜的最適pH。研究pH為4.5～8.0時，緩沖劑對乳糖酶膜的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 pH對乳糖電極響應(yīng)值的影響

由圖1的結(jié)果可以看出，pH在4.5～7.0內(nèi)，酶電極的響應(yīng)值隨著pH的升高而增強(qiáng)，在pH=7.0時達(dá)到最大值，后隨著pH的升高而減少，故選擇緩沖劑的pH為7.0。

3.2 線性實驗

分別配制濃度為0.30，0.60，0.90，1.20，1.50 g/L的乳糖標(biāo)準(zhǔn)液和濃度為0.20，0.40，0.60，0.80，1.00 g/L的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，每個濃度重復(fù)測定3次，分別以乳糖標(biāo)準(zhǔn)液和葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)x，以電極的響應(yīng)值為縱坐標(biāo)y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖2所示。

圖2 乳糖電極對單一乳糖和葡萄糖的響應(yīng)

由圖2可見，乳糖在0.00～1.50 g/L，葡萄糖在0.00～1.00 g/L內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。乳糖的線性關(guān)系為y=98.85 7x+2.190 5，r2=0.999 3，葡萄糖的線性關(guān)系為y=99.714x+0.809 5，r2=0.999 5。

3.3 乳糖和葡萄糖混合液對乳糖電極和葡萄糖電極測定的干擾性

對乳糖和葡萄糖混合液進(jìn)行測定，在1.50 g/L乳糖溶液中分別添加濃度為0.20，0.40，0.60，0.80，1.00 g/L的葡萄糖溶液，在1.0 g/L葡萄糖溶液中分別添加濃度為0.30，0.60，0.90，1.20，1.50 g/L的乳糖，分別測定乳糖和葡萄糖的含量，結(jié)果見表1。

表1 乳糖和葡萄糖混合液對乳糖電極和葡萄糖電極的響應(yīng)

由表1結(jié)果可以看出，含有乳糖和葡萄糖的混合溶液，不管是乳糖的測定還是葡萄糖的測定，都具有較強(qiáng)線性關(guān)系，并且在葡萄糖濃度不同時，同一濃度的乳糖測定的變異系數(shù)是0.87%，乳糖濃度不同時同一濃度的葡萄糖測定的變異系數(shù)是1.13%，說明葡萄糖和乳糖的測定互不干擾。

3.4 生物傳感器法乳糖測定的穩(wěn)定性

當(dāng)儀器定標(biāo)通過后，對乳糖標(biāo)準(zhǔn)液(1.50 g/L)連續(xù)測定10次，測定結(jié)果如表2所示。

表2 生物傳感器法測定乳糖濃度

由表2可以得出，生物傳感器法測定乳糖的精密度為1.49%，說明該方法的穩(wěn)定性良好。

3.5 生物傳感器法測定乳糖的回收率

先測定5個不同濃度的乳糖樣品，然后依次添加同體積的濃度為0.50，0.40，0.30，0.20，0.10 g/L的乳糖標(biāo)液，計算生物傳感器法測定乳糖的加標(biāo)回收率。結(jié)果如表3所示。由表3可以得出，生物傳感器法測定乳糖含量的加標(biāo)回收率為95%～105%。

表3 生物傳感器法測定乳糖含量的加標(biāo)回收率

3.6 不同方法測定牛乳中乳糖含量的對比

采用生物傳感器法和HPLC法對超市中出售的兩種品牌牛奶中的乳糖進(jìn)行測定，對測定的結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果如表4所示。

表4 生物傳感器法和高效液相色譜法對乳糖含量測定結(jié)果的比較

由表4可以看出，生物傳感器法平均值及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差稍大于HPLC法，但差異不明顯(P>0.05)，兩種方法具有良好的一致性。

3.7 生物傳感器法測定乳糖專一性檢測

分別對濃度為1.50 g/L的乳糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、淀粉標(biāo)準(zhǔn)液用生物傳感器法進(jìn)行測定，測定結(jié)果如表5所示。

表5 生物傳感器法測定乳糖的專一性測定結(jié)果

由表5測定的數(shù)據(jù)可以得出，除了乳糖之外，其他的糖類基本無明顯響應(yīng)，因此生物傳感器測定乳糖含量的方法專一性很高。

4 結(jié)論

本研究制備了乳糖-葡萄糖復(fù)合酶膜，建立了復(fù)合膜生物傳感器差分法檢測牛奶中乳糖的方法，并研究了該方法的最適pH、線性范圍、穩(wěn)定性、干擾性和回收率等。結(jié)果表明，該方法的操作簡單、穩(wěn)定性好、線性良好、專一性強(qiáng)、回收率高，與高效液相色譜法的結(jié)果進(jìn)行比較，具有良好的一致性，復(fù)合膜生物傳感器差分法測定牛乳中乳糖的含量具有可行性。