穆巖，李麗麗，馬雙雙，宋月，王泉博*

(齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)山東省分析測(cè)試中心 a.環(huán)境與健康免疫研究室; b.山東省中藥質(zhì)量控制技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250014)

鉛污染及相關(guān)中毒事件是世界性環(huán)境和醫(yī)學(xué)問(wèn)題。2017年，全球鉛生產(chǎn)量超過(guò)400萬(wàn)噸，而中國(guó)是最大的鉛生產(chǎn)國(guó)和消費(fèi)國(guó)[1-2]。相當(dāng)一部分鉛通過(guò)電子垃圾、鉛基汽油、化妝品、含鉛涂料等不同形式污染自然環(huán)境，然后通過(guò)直接接觸，或食物鏈、PM 2.5等間接接觸方式進(jìn)入人體[3]。研究表明，谷物、動(dòng)物和人類體內(nèi)都已發(fā)現(xiàn)顯著的鉛積累。人體的鉛積累會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的健康問(wèn)題，包括肝損傷、中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害和炎癥等[4-5]，尤其兒童，鉛積累會(huì)引起神經(jīng)損傷和骨骼異常等不可逆的發(fā)育毒性[6]。據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道，2016年有54萬(wàn)人死于鉛中毒[7]。鉛一旦進(jìn)入人體，則很難完全迅速排出，臨床對(duì)鉛中毒的治療主要是基于螯合療法，使用乙二胺四乙酸二鈉(EDTA二鈉鈣)或二巰基琥珀酸等螯合劑治療[8-9]。然而，螯合療法主要應(yīng)用于高劑量的急性鉛中毒，對(duì)長(zhǎng)期暴露而導(dǎo)致的微量鉛中毒作用有限。另一方面，螯合劑的使用也伴有嚴(yán)重的副作用，包括脫水、低血鈣和腎臟損害，甚至死亡[10-12]。

目前對(duì)鉛中毒的機(jī)制，主要研究其抑制體內(nèi)多種酶的活性和導(dǎo)致超氧化合物刺激等[13]，但鉛對(duì)神經(jīng)細(xì)胞代謝組學(xué)的影響研究較少。因此，本文以正常神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞BV-2為模型，采用UPLC-QTOF液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)研究鉛離子誘導(dǎo)下的BV-2細(xì)胞代謝組學(xué)變化，為鉛毒性緩解藥物的研發(fā)提供參考，為臨床鉛中毒的治療提供理論基礎(chǔ)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

生物安全柜(上海力康生物科技有限公司)；倒置顯微鏡(美國(guó)奧林巴斯公司)；BSA124S分析天平(德國(guó)Sartorius公司)；超聲波清洗機(jī)(SB-3200DT，寧波新芝生物科技股份有限公司)；流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD Biosciences公司)；二氧化碳培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)；冷凍離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司)；超高效液相色譜儀(Acquity H-Class，美國(guó)Waters公司)；四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(Impact Ⅱ，德國(guó)Bruker公司)。

1.2 試劑

色譜級(jí)甲醇、乙腈，購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；分析純甲酸、乙酸、碳酸氫銨、醋酸鉛，購(gòu)自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；去離子水，美國(guó)Thermo公司純水機(jī)制備；細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)胎牛血清，購(gòu)自巴西Lonser公司；細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)二甲基亞砜、磷酸鹽緩沖液、青霉素-鏈霉素溶液、細(xì)胞凋亡試劑盒，購(gòu)自北京索萊寶有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)高糖DMEM(Dulbecco's modified eagle medium)培養(yǎng)基、溴化噻唑藍(lán)四氮唑，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

使用添加10%胎牛血清和青霉素-鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系BV-2，細(xì)胞培養(yǎng)箱溫度37 ℃，二氧化碳濃度5%。根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)密度，每2～3 d用細(xì)胞刮刀傳代培養(yǎng)。

2.2 醋酸鉛溶液的配制

取醋酸鉛粉末適量，精密稱定后溶解于對(duì)應(yīng)體積的純乙酸中，加入20倍體積去離子水稀釋制成儲(chǔ)備液，處理細(xì)胞時(shí)，按照0.1%比例加至培養(yǎng)基中暴露。

2.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)和增殖活力試驗(yàn)

收集BV-2細(xì)胞懸液后，在400 g離心力下離心5 min，然后加入5 mL培養(yǎng)基重懸，測(cè)定細(xì)胞濃度；調(diào)整BV-2細(xì)胞濃度至按照1×105/mL，每孔100 μL接種于96孔板；細(xì)胞貼壁后分別加入1、10、20 μmol/L鉛離子(醋酸鉛溶液)或空白溶劑染毒暴露；處理48 h后，置于顯微鏡下拍照記錄細(xì)胞形態(tài)；然后加入MTT溶液，孵育4 h，加入二甲基亞砜溶解結(jié)晶后，在酶標(biāo)儀495 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，以處理孔的吸光度與正常對(duì)照孔的吸光度比值計(jì)算細(xì)胞存活率。

2.4 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)

調(diào)整BV-2細(xì)胞濃度至1×105/mL，每皿3 mL接種于6 cm培養(yǎng)皿中，加入10 μmol/L鉛離子(醋酸鉛溶液)或相同體積的空白溶劑處理48 h。收集各組細(xì)胞后，用磷酸鹽緩沖液洗滌2次，然后用Annexin V-PE/7-AAD 染色20 min，放入BD流式細(xì)胞儀中進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)和分析。

2.5 細(xì)胞代謝物提取

2.6 細(xì)胞代謝物液相及質(zhì)譜測(cè)定

超高效液相色譜儀參數(shù)為：Waters C18色譜柱(1.7 μmol/L，3.0 mm×100 mm)；柱溫40 ℃；樣品室溫度4 ℃；流速0.4 mL/min；洗脫溶劑為0.1%甲酸水溶液(A)和0.1%甲酸乙腈溶液(B)。洗脫梯度依次為0～2 min：99% A～A 70%；2～8 min：70% A～1% A；8～17 min：1% A；17.0～17.1 min：1% A～99% A；17.1～20.0 min：99% A；進(jìn)樣量10 μL。

四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀參數(shù)為：離子源ESI；正離子模式；掃描質(zhì)荷比50～1500m/z；端板偏移電壓-500 V；毛細(xì)管電壓3.5 kV；霧化和干燥氣體為高純度氮?dú)?，流?.0 L/min，壓力2.0 bar；干燥溫度220 ℃。

2.7 細(xì)胞代謝物的液質(zhì)數(shù)據(jù)生物信息學(xué)分析

將鉛離子暴露組和正常對(duì)照組所測(cè)全部液相和質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)，包括保留時(shí)間、離子流峰高及相應(yīng)離子片段分子量信息等，上傳至XCMS online數(shù)據(jù)庫(kù)[14]，選擇Pairwise模式進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，包括峰識(shí)別、特征峰提取、保留時(shí)間校正、特征峰對(duì)齊、自動(dòng)t-test顯著性差異檢驗(yàn)、主成分分析(principal component analysis，PCA)等。差異代謝物分析選擇P<0.05，變化倍數(shù)為1.5～40，分子量小于1000的特征峰。導(dǎo)出處理后的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，上傳至MetaboAnalyst數(shù)據(jù)庫(kù)[15]，選擇Peaks to Pathway模式，進(jìn)行代謝通路富集分析，設(shè)定參數(shù)如下：Mummichog算法，P<0.001，分子量比對(duì)精度0.000 5%，KEGG Mus musculus 代謝通路數(shù)據(jù)庫(kù)[16]。最終得到代謝通路富集圖及其相應(yīng)的差異代謝物。

2.8 數(shù)據(jù)分析

使用Graph pad prism 7.0軟件進(jìn)行作圖，顯著性差異分析采用Student’s t-test，雙側(cè)檢驗(yàn)，P<0.05視作具有顯著性差異。

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 鉛離子對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量的影響

如圖1所示，BV-2細(xì)胞在暴露不同濃度鉛離子48 h后，隨著鉛離子的濃度升高，在同等放大倍數(shù)和視野下的BV-2細(xì)胞數(shù)顯著減少，細(xì)胞形態(tài)由正常的多邊形略帶觸角變化為膨大的細(xì)長(zhǎng)型，并伴有大量細(xì)胞碎片和膜塌陷的細(xì)胞圓球。整體看，鉛離子對(duì)細(xì)胞形態(tài)和數(shù)目的改變具有顯著的濃度依賴性，在10 μmol/L濃度下即產(chǎn)生顯著的毒性變化。

圖1 鉛離子對(duì)BV-2細(xì)胞形態(tài)的影響

3.2 鉛離子對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞存活率的影響

BV-2細(xì)胞存活率的測(cè)定采用MTT法進(jìn)行。通過(guò)鉛離子暴露孔與正常對(duì)照孔的吸光度比值得出細(xì)胞存活率。結(jié)果如圖2所示，鉛離子處理BV-2細(xì)胞48 h后，相比正常對(duì)照組(空白溶劑處理)，1 μmol/L鉛離子暴露的細(xì)胞存活率沒(méi)有顯著性差異，而10 μmol/L鉛離子導(dǎo)致細(xì)胞存活率下降了40%左右，20 μmol/L鉛離子導(dǎo)致細(xì)胞存活率下降超過(guò)50%，說(shuō)明鉛離子對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的存活率具有顯著毒性，且具有濃度依賴性。

*代表與正常對(duì)照組(空白溶劑處理)相比，P<0.05

基于上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，20 μmol/L高劑量鉛離子組細(xì)胞存活率嚴(yán)重降低，因此本文選擇10 μmol/L鉛離子暴露濃度進(jìn)行進(jìn)一步研究。

3.3 鉛離子對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞凋亡的影響

對(duì)正常對(duì)照組與10 μmol/L鉛離子暴露組BV-2細(xì)胞的凋亡狀態(tài)分析發(fā)現(xiàn)，10 μmol/L鉛離子顯著增加BV-2細(xì)胞晚期凋亡或壞死比例，其從0.5%升高至6.1%；而細(xì)胞膜破損的細(xì)胞比例從2%增至12%(7-氨基放線菌素D陽(yáng)性)，結(jié)果如圖3所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明10 μmol/L鉛離子對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞具有明顯凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)。

圖3 鉛離子對(duì)BV-2細(xì)胞凋亡比例的影響

3.4 鉛離子對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞代謝物的影響

通過(guò)XCMS online數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)BV-2細(xì)胞正常對(duì)照組與10 μmol/L鉛離子暴露組的液相及質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析結(jié)果如圖4所示。由圖4a和4b可知，以離子峰高計(jì)，鉛離子對(duì)細(xì)胞總代謝物水平?jīng)]有產(chǎn)生顯著差異，各組6個(gè)樣品離子峰平行性良好。圖4c針對(duì)單個(gè)代謝物的數(shù)據(jù)分析顯示，兩組差異主要集中于10～12 min色譜區(qū)間，變化倍數(shù)大于1.5且具有顯著性差異(P<0.05)的特征峰數(shù)目為973個(gè)，圖中，氣泡個(gè)數(shù)代表差異特征峰，氣泡大小代表差異特征峰變化倍數(shù)大小，紅色代表鉛離子暴露組相應(yīng)代謝離子峰比正常對(duì)照組升高，綠色代表鉛離子暴露組相應(yīng)代謝離子峰比正常對(duì)照組下降。實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，10 μmol/L鉛離子導(dǎo)致神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生了顯著的代謝物的水平變化，顯著影響了細(xì)胞的生命過(guò)程。

圖4 正常對(duì)照組與鉛離子暴露組的BV-2細(xì)胞總離子流圖與差異代謝物可視化氣泡圖

3.5 神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞正常對(duì)照組與鉛離子暴露組的PCA分析

通過(guò)PCA分析發(fā)現(xiàn)，BV-2細(xì)胞正常對(duì)照組與10 μmol/L鉛離子暴露組具有明顯不同的聚類趨勢(shì)，以PC1(方差18%)特征為界限，正常對(duì)照組分布于左側(cè)區(qū)域而鉛離子暴露組全部分布于右側(cè)區(qū)域，組間表現(xiàn)出良好的分群特點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)顯示，作為外來(lái)污染物(刺激物)，鉛離子顯著改變了神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的代謝行為和模式，干擾了其正常代謝平衡和生理活動(dòng)。詳見(jiàn)圖5。

圖5 BV-2細(xì)胞正常對(duì)照組與鉛離子暴露組的PCA得分圖

3.6 鉛離子對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞代謝通路的影響

將處理后的質(zhì)譜數(shù)據(jù)上傳至MetaboAnalyst數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)定P<0.001，將差異代謝物進(jìn)行代謝通路富集分析，結(jié)果如圖6和表1所示，其中顯著程度由數(shù)據(jù)庫(kù)根據(jù)指定代謝通路的代謝物預(yù)期數(shù)量與實(shí)際測(cè)得數(shù)量的一致性情況計(jì)算得出，并以-logP值表示[15]。鉛離子顯著改變了代謝物谷氨酸、谷氨酰胺、多個(gè)葡糖糖代謝中間產(chǎn)物、3-羥基-3-甲基戊二酰乙酰輔酶A、乙酰輔酶A、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)、原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)、谷胱甘肽等數(shù)十個(gè)代謝物水平，干擾了BV-2細(xì)胞中谷氨酰胺和谷氨酸鹽代謝、抗壞血酸和醛酸代謝、丁酸鹽代謝以及谷胱甘肽代謝等多個(gè)涉及氧化還原功能等共33條重要代謝通路。根據(jù)圖6，越靠近右側(cè)，其權(quán)重值越高，越靠近上側(cè)，其顯著性越強(qiáng)。這些代謝通路大體可以分為以下3類：氨基酸和葡萄糖代謝通路、維持氧化還原狀態(tài)的代謝通路以及脂類代謝通路。

圖6 神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞被鉛離子顯著改變的代謝通路富集圖

表1 鉛離子影響的BV-2神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的主要代謝通路及其代謝物

代謝通路分析結(jié)果提示，針對(duì)性地修復(fù)鉛離子造成的代謝通路紊亂可能會(huì)緩解其毒性，例如在受影響的谷胱甘肽代謝通路中，帶有活性巰基的谷胱甘肽和半胱氨酸的抗氧化和解毒作用，在維持細(xì)胞氧化還原平衡等生理活動(dòng)中具有重要作用，可以使細(xì)胞膜免受過(guò)氧化耦合反應(yīng)，免于氧化應(yīng)激的損傷。有文獻(xiàn)報(bào)道天然產(chǎn)物槲皮素可以通過(guò)抑制氧化應(yīng)激減輕鉛離子造成的組織損傷[17]。

4 結(jié)論與討論

本文為了探索鉛離子生物毒性的細(xì)胞代謝組學(xué)作用機(jī)制，以神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞為模型，對(duì)鉛離子導(dǎo)致的細(xì)胞形態(tài)變化、細(xì)胞存活率和凋亡等進(jìn)行了研究，并基于UPLC-QTOF液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)測(cè)定了鉛離子暴露組和正常對(duì)照組的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中代謝物的水平。結(jié)果顯示，10 μmol/L 鉛離子即可引起神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生顯著變化、存活率下降以及凋亡比例的上升。這些結(jié)果與文獻(xiàn)[18]報(bào)道一致，表明鉛離子對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞具有顯著的生物毒性。與文獻(xiàn)[19]報(bào)道的正常腎細(xì)胞HEK293等細(xì)胞模型相比，本文發(fā)現(xiàn)BV-2細(xì)胞在10 μmol/L鉛離子暴露下存活率更低。進(jìn)一步通過(guò)UPLC-QTOF質(zhì)譜測(cè)試發(fā)現(xiàn)，鉛離子暴露后的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中多達(dá)973個(gè)潛在代謝物水平變化大于1.5倍(P<0.05)，而且PCA分析顯示鉛離子暴露組和正常對(duì)照組BV-2細(xì)胞具有顯著不同的聚類趨勢(shì)，差異代謝物的通路富集分析顯示鉛離子顯著改變了神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中谷氨酰胺和谷氨酸鹽代謝、抗壞血酸和醛酸代謝、丁酸鹽代謝以及谷胱甘肽代謝等多個(gè)涉及氧化還原等功能的重要代謝通路。這些結(jié)果表明鉛離子顯著影響了神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的代謝行為和模式，干擾了其正常代謝平衡和生理活動(dòng)，這可能是鉛離子引起細(xì)胞毒性的作用機(jī)制之一。

綜上所述，鉛污染及其引起的中毒事件仍然是一個(gè)全球性問(wèn)題，對(duì)鉛中毒尤其是低劑量鉛的毒性機(jī)制和治療需要進(jìn)一步地深入研究，本文通過(guò)對(duì)鉛離子神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞毒性和細(xì)胞代謝組學(xué)的研究，為鉛離子的毒性作用機(jī)制提供了理論參考，為緩解鉛毒性藥物研發(fā)提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。