盧 洋，張帥兵，翟煥趁，李 娜，呂揚勇，胡元森，蔡靜平

河南工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001

葡萄糖氧化酶(EC 1.1.3.4)是一類能催化β-D-葡萄糖和氧氣生成葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯和過氧化氫的酶類[1]。目前，已發(fā)現(xiàn)曲霉、青霉和芽孢桿菌等多種微生物可產(chǎn)生葡萄糖氧化酶，用于研究和實際應(yīng)用最多的是來源于黑曲霉的葡萄糖氧化酶，該酶在面粉和飼料添加劑、葡萄糖酸及其鹽生產(chǎn)以及生物傳感器等方面具有廣泛的應(yīng)用前景[2-7]。研究表明通過向小麥粉中添加葡萄糖氧化酶可改善面團品質(zhì)、發(fā)酵穩(wěn)定性和面包體積等[3,8-9]。葡萄糖氧化酶在飼料中添加可促進動物消化吸收、保護腸道和提高動物免疫力等，是替代抗生素具有較好前景的新型飼料酶制劑[10-12]。近年來，市場上對葡萄糖氧化酶的需求日益增加，高效發(fā)酵制備葡萄糖氧化酶可降低其生產(chǎn)成本。在黑曲霉發(fā)酵葡萄糖氧化酶的生產(chǎn)工藝中，發(fā)酵成本較高、酶制劑分離純化較復(fù)雜，而利用基因工程菌高效發(fā)酵黑曲霉葡萄糖氧化酶可有效降低生產(chǎn)成本。

作者通過將黑曲霉葡萄糖氧化酶在畢赤酵母中組成型表達，純化得到了葡萄糖氧化酶并分析了其酶學(xué)特性。為了進一步提高其發(fā)酵效率，將黑曲霉葡萄糖氧化酶在畢赤酵母中進行誘導(dǎo)型表達并利用G418抗生素篩選獲得了畢赤酵母高效表達菌株，通過高密度發(fā)酵可高效發(fā)酵黑曲霉葡萄糖氧化酶。本研究為高效發(fā)酵黑曲霉葡萄糖氧化酶及進一步改造其酶學(xué)特性奠定了試驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

E.coliDH5α、PichiapastorisX-33、黑曲霉菌株、pGAPZαA和pPIC9K質(zhì)粒載體：河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院實驗室保藏。T4 DNA連接酶、EcoR I限制性內(nèi)切酶、NotI限制性內(nèi)切酶、糖苷內(nèi)切酶H (Endo H)：美國New England Biolabs公司；pMD18-T載體、Taq DNA聚合酶：寶生物工程(大連)有限公司(Takara)；鎳離子親和樹脂：美國伯樂公司；雙色預(yù)染蛋白Marker(貨號C610011)、真菌總RNA快速抽提試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒、Bradford蛋白濃度測定試劑盒：上海生工生物有限公司。

LB培養(yǎng)基：酵母粉5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L；Low-salt LB培養(yǎng)基：酵母粉5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L；YPD培養(yǎng)基：酵母粉10 g/L，胰蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L；YPDS培養(yǎng)基：酵母粉10 g/L，胰蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，山梨醇182 g/L；BMGY培養(yǎng)基：酵母粉10 g/L，胰蛋白胨20 g/L，YNB 13.4 g/L，甘油10 g/L，生物素4×10-4g/L，0.1 mol/L K2HPO4/KH2PO4緩沖液(pH 6.0)；BMMY培養(yǎng)基：酵母粉10 g/L，胰蛋白 20 g/L，YNB 13.4 g/L，甲醇10 g/L，生物素4×10-4g/L，0.1 mol/L K2HPO4/KH2PO4緩沖液(pH 6.0)。

1.2 儀器與設(shè)備

TS-200B恒溫搖床：上海天呈試驗儀器制造有限公司；SHP-150型恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；A200PCR儀：杭州朗基科學(xué)儀器有限公司； BG-subMIDI水平電泳儀、BG-verMIDI垂直電泳儀：北京百晶生物技術(shù)有限公司；Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)、MicroPulser電穿孔儀：美國伯樂公司；JY92-Ⅱ超聲波細胞破碎儀：寧波新芝生物科技股份有限公司；小型切向流超濾系統(tǒng)(Labscale TFF System)：美國密理博公司。

1.3 方法

1.3.1 黑曲霉葡萄糖氧化酶編碼序列的克隆

將活化后的黑曲霉孢子接種于察氏培養(yǎng)基中，于200 r/min、28 ℃條件下培養(yǎng)5 d后用無菌紗布過濾菌絲體。液氮快速冷凍菌絲體并在研缽中快速研磨后，利用真菌總RNA快速抽提試劑盒提取黑曲霉總RNA。按照反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒說明書，以總RNA為模板、oligo(dT)為引物反轉(zhuǎn)錄出cDNA。然后，根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中已報道的黑曲霉葡萄糖氧化酶編碼序列信息(GenBank: FJ979866.1)設(shè)計正向引物Gox-F：5′- ATGCAGACTCTCCTTGTG -3′和Gox-R：5′- TCACTGCATGGAAGCATAATC -3′，利用Taq DNA聚合酶以cDNA為模板PCR擴增出葡萄糖氧化酶編碼序列。利用DNA膠回收試劑盒獲得黑曲霉葡萄糖氧化酶編碼序列，利用T4 DNA將其與pMD18-T載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌并測序驗證。利用信號肽分析在線軟件SignalP-5.0 (www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)和PrediSi (www.predisi.de/)分析黑曲霉葡萄糖氧化酶的信號肽[13-14]。

1.3.2 黑曲霉葡萄糖氧化酶表達載體的構(gòu)建

設(shè)計正向引物mGox-F：5′- taggaggt gaattc AGCAATGGCATCGAAGCCAG -3′ 和mGox-R：5′ -taggaggt gcggccgc TCACTGCATGGAAGCATAATC -3′，以測序驗證正確的質(zhì)粒模板PCR擴增不含信號肽的葡萄糖氧化酶編碼序列，PCR反應(yīng)條件：95 ℃，30 s；58 ℃，30 s；72 ℃，2 min；反應(yīng)30個循環(huán)，最后72 ℃延伸反應(yīng)10 min。利用DNA膠回收試劑盒獲得目的基因后，用EcoR I和NotI限制性內(nèi)切酶對目的基因進行酶切。然后，用T4 DNA連接酶將其與用同樣的限制性內(nèi)切酶處理的pPIC9K質(zhì)粒相連接，并轉(zhuǎn)化E.coliDH5α后測序驗證，將此重組質(zhì)粒命名為pPIC9K-mGOX。

1.3.3 黑曲霉葡萄糖氧化酶編碼序列在畢赤酵母中的轉(zhuǎn)化與表達

用BspH I限制性內(nèi)切酶對重組質(zhì)粒pGAPZαA-mGOX進行酶切反應(yīng)，制備線性化的重組質(zhì)粒片段。制備畢赤酵母感受態(tài)細胞，利用電穿孔儀，將線性化重組質(zhì)粒片段轉(zhuǎn)入畢赤酵母感受態(tài)細胞后涂布含有100 μg/mL博來霉素的YPDS固體培養(yǎng)基上。于28 ℃培養(yǎng)箱中放置3 d，挑取單菌落并接種于100 mL YPD液體培養(yǎng)基中,28 ℃恒溫搖床中培養(yǎng)2 d。離心收集發(fā)酵上清液，通過酶活檢測分析葡萄糖氧化酶的表達。

1.3.4 黑曲霉葡萄糖氧化酶活性測定方法

黑曲霉葡萄糖氧化酶活性的測定參照Tu等[15]的方法并稍加修改。反應(yīng)體系:10 mmol/L葡萄糖0.78 mL、2 000 U/mL辣根過氧化物酶40 μL、20 mmol/L愈創(chuàng)木酚的pH 6.0磷酸鈉緩沖液0.78 mL。取0.4 mL葡萄糖氧化酶酶液加入1.6 mL反應(yīng)溶液中，于35 ℃水浴鍋反應(yīng)5 min后，利用分光光度計在470 nm波長處測定吸光度。取0.4 mL不同濃度的過氧化氫加入1.6 mL反應(yīng)溶液中進行反應(yīng)，根據(jù)葡萄糖濃度和470 nm波長處吸光度繪制標準曲線。通過標準曲線計算酶液中葡萄糖氧化酶的酶活。酶活定義：在35 ℃、pH 6.0條件下，每1 min內(nèi)催化生成1 μmol的過氧化氫的酶量為1個酶活單位。

1.3.5 黑曲霉葡萄糖氧化酶的純化和酶學(xué)性質(zhì)分析

利用labscale小型切向流超濾系統(tǒng)(Labscale TFF System)對發(fā)酵上清液進行濃縮，根據(jù)鎳離子親和層析操作手冊(Ni-NTA Superflow Cartridge Handbook)的操作方法，利用鎳離子親和層析樹脂純化葡萄糖氧化酶。通過4%濃縮膠和12%分離膠的聚丙烯酰胺凝膠電泳對濃縮和純化后的葡萄糖氧化酶進行SDS-PAGE分析。按照說明書，在37 ℃下用500 U的糖苷內(nèi)切酶H (Endo H)處理純化后的葡萄糖氧化酶以分析其糖基化。利用Bradford蛋白濃度測定試劑盒檢測純化后葡萄糖氧化酶的濃度。采用上述酶活檢測反應(yīng)條件對純化后的葡萄糖氧化酶的比活力進行分析，比活力為在35 ℃、pH 6.0條件下每毫克葡萄糖氧化酶所具有的酶活單位數(shù)。根據(jù)葡萄糖氧化酶在35 ℃、100 mmol/L乙酸鈉緩沖液(pH 3.0～5.0)、磷酸鹽緩沖液(pH 6.0～8.0)和Tris-HCl緩沖液(pH 9.0)條件下的反應(yīng)活性確定其最適反應(yīng)pH值；將葡萄糖氧化酶在pH 3.0～9.0條件下溫育1 h后，于pH 6.0、35 ℃條件下測定殘余酶活以確定其pH穩(wěn)定性。根據(jù)葡萄糖氧化酶在pH 6.0、25～65 ℃條件下的反應(yīng)活性確定其最適反應(yīng)溫度；將葡萄糖氧化酶在25～65 ℃水浴中處理1 h后，于pH 6.0、35 ℃條件下測定殘余酶活以確定其熱穩(wěn)定性。

1.3.6 黑曲霉葡萄糖氧化酶多拷貝表達菌株的構(gòu)建及篩選

參照畢赤酵母表達手冊(Revision A.0, MAN0000012, Invitrogen)構(gòu)建和篩選黑曲霉葡萄糖氧化酶多拷貝表達的畢赤酵母菌株。利用PmeI限制性內(nèi)切酶線性化重組質(zhì)粒pPIC9K-GOX后轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115菌株。將其涂布于MD固體培養(yǎng)基上30 ℃培養(yǎng)2 d后，在MD培養(yǎng)基上加無菌水并用涂布棒刮下菌體制成約1×106cfu/mL的菌懸液。吸取100 μL菌懸液涂布于分別含有1.0、2.0、3.0、4.0 mg/mL G418抗生素的YPD固體培養(yǎng)基平板上，于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d。

1.3.7 畢赤酵母高效發(fā)酵葡萄糖氧化酶的條件分析

參照畢赤酵母發(fā)酵工藝手冊(Version B, 053002, Invitrogen),對畢赤酵母高效發(fā)酵葡萄糖氧化酶的條件進行分析。挑取含有4 mg/mL G418抗生素的YPD固體培養(yǎng)基平板上生長出的單菌落接種于BMGY培養(yǎng)基中,30 ℃、220 r/min培養(yǎng)2 d后離心收集菌體，用BMMY重懸菌體至濕菌體濃度為200 g/L。將50 mL濕菌體濃度為200 g/L的菌懸液分別移入250 mL無菌搖瓶中并于30 ℃、220 r/min條件下高密度培養(yǎng)。每天加入1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%的甲醇，分析甲醇添加量對葡萄糖氧化酶表達量的影響；分析在最優(yōu)甲醇添加量條件下發(fā)酵時間對葡萄糖氧化酶表達量的影響。采用上述酶活檢測反應(yīng)體系，在35 ℃、pH 6.0條件下分析發(fā)酵上清液中葡萄糖氧化酶的活力。利用Bradford蛋白濃度測定試劑盒檢測純化后葡萄糖氧化酶的濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 黑曲霉葡萄糖氧化酶基因的克隆與表達

以黑曲霉總RNA為模板，擴增出了葡萄糖氧化酶的編碼基因。該基因長度為1 818 bp(含1個終止密碼子)，編碼605個氨基酸，與已報道來源于黑曲霉Z-25菌株的葡萄糖氧化酶的氨基酸序列一致性為100%[16]。利用SignalP-5.0和PrediSi在線軟件分析，黑曲霉葡萄糖氧化酶具有21個氨基酸組成的信號肽，推測其分子質(zhì)量為63.1 kDa。為了表達具有催化活性的葡萄糖氧化酶，利用PCR技術(shù)獲得去除信號肽的成熟葡萄糖氧化酶編碼序列。將該編碼和pGAPZαA質(zhì)粒載體重組并轉(zhuǎn)化畢赤酵母X-33菌株后，挑取單菌落接種于YPD液體培養(yǎng)基中進行蛋白表達。結(jié)果表明黑曲霉葡萄糖氧化酶可在畢赤酵母中組成型表達，發(fā)酵上清液中葡萄糖氧化酶的酶活可達1.2 U/mL。

2.2 黑曲霉葡萄糖氧化酶的純化

通過對發(fā)酵上清液濃縮并利用鎳離子親和層析對濃縮后發(fā)酵液中的葡萄糖氧化酶進行分離純化，發(fā)酵液中葡萄糖氧化酶酶活可回收81.38%(表1)。黑曲霉葡萄糖氧化酶的SDS-PAGE分析見圖1，純化后得到了分子質(zhì)量約為100 kDa的葡萄糖氧化酶，分子質(zhì)量與推測的分子質(zhì)量相比偏大，這可能與該蛋白在畢赤酵母中表達的糖基化有關(guān)。利用糖苷內(nèi)切酶H(Endo H)去除葡萄糖氧化酶的糖基化后，其分子質(zhì)量約為70 kDa，與推測的分子質(zhì)量相近。

表1 葡萄糖氧化酶純化后酶活回收率

注：泳道1為蛋白質(zhì)Marker；泳道2為濃縮后發(fā)酵上清液；泳道3為純化后的葡萄糖氧化酶；泳道4為糖苷內(nèi)切酶H處理后的葡萄糖氧化酶。

2.3 葡萄糖氧化酶酶學(xué)性質(zhì)

對純化后的葡萄糖氧化酶的酶學(xué)性質(zhì)進行研究，結(jié)果見圖2和圖3，在當前反應(yīng)條件下該酶的比活力為60.9 U/mg。該酶的最適反應(yīng)pH為6，其在pH 5～8條件下具有較好的穩(wěn)定性。葡萄糖氧化酶的最適反應(yīng)溫度為35 ℃，將葡萄糖氧化酶在45 ℃條件下溫育1 h后測定其殘余活力仍保留80%以上。

圖2 葡萄糖氧化酶的最適反應(yīng)pH和pH穩(wěn)定性分析

圖3 葡萄糖氧化酶的最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性分析

2.4 葡萄糖氧化酶高效表達菌株的篩選及發(fā)酵條件分析

為了進一步提高葡萄糖氧化酶在畢赤酵母中的表達量，將葡萄糖氧化酶編碼序列與pPIC9K載體重組后轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115菌株得到了誘導(dǎo)型表達的工程菌株。通過G418抗生素篩選，得到了可在含有4.0 mg/mL G418的培養(yǎng)基上生長的菌株(圖4)。對該菌進行高密度發(fā)酵條件研究表明：該菌株發(fā)酵葡萄糖氧化酶的最優(yōu)甲醇添加量為2.5%(圖5)。在甲醇添加量2.5%的誘導(dǎo)發(fā)酵過程中，葡糖糖氧化酶的表達量和酶活呈不斷上升趨勢，至第7天時葡萄糖氧化酶發(fā)酵量可達133 U/mL(圖5)，蛋白表達量約1.9 g/L(圖6)。發(fā)酵7 d后，上清液中酶活不再增加，蛋白濃度增加可能是由于酵母菌部分自溶引起的。

注：a、b、c、d分別為G418質(zhì)量濃度1.0、2.0、3.0、4.0 mg/mL。

圖5 甲醇添加量對發(fā)酵液中葡萄糖氧化酶酶活的影響

注：泳道M為蛋白質(zhì)Marker，泳道1—7分別為甲醇誘導(dǎo)后第1—7天的發(fā)酵上清液。

2.5 討論

黑曲霉葡萄糖氧化酶在面粉和飼料添加劑、葡萄糖酸及其鹽生產(chǎn)和生物傳感器等方面具有廣泛的應(yīng)用前景，提高葡萄糖氧化酶的發(fā)酵效率以降低其生產(chǎn)成本對于該酶的生產(chǎn)和應(yīng)用具有重要意義。為了在畢赤酵母中高效表達黑曲霉葡萄糖氧化酶，分別構(gòu)建了組成型和誘導(dǎo)型表達葡萄糖氧化酶的畢赤酵母表達菌株，對畢赤酵母表達的葡萄糖氧化酶的酶學(xué)性質(zhì)及糖基化進行了研究分析，并通過高效表達菌株篩選和高密度發(fā)酵較大程度地提高了萄萄糖氧化酶的表達量。研究表明，黑曲霉葡萄糖氧化酶可在畢赤酵母中組成型和誘導(dǎo)型表達，該酶的最適反應(yīng)溫度為35 ℃，50 ℃以上的溫度會引起該酶的快速失活，表明該酶的熱穩(wěn)定性較低。該酶在畢赤酵母中表達會產(chǎn)生約30 kDa的糖基化修飾，這與文獻[16-17]相一致。通過理性設(shè)計或定向進化方法改造黑曲霉葡萄糖氧化酶以提高其熱穩(wěn)定性可為實際生產(chǎn)和應(yīng)用過程提供耐熱性更高的酶，以減少該酶在使用中由于熱失活造成的酶活損失并拓展其應(yīng)用范圍[18-20]。

為了提高葡萄糖氧化酶在畢赤酵母中的發(fā)酵量，構(gòu)建了誘導(dǎo)型表達葡萄糖氧化酶的畢赤酵母工程菌株，得到了可在含有4 mg/mL G418的培養(yǎng)基上生長的菌株。研究表明，pPIC9K質(zhì)粒載體上含有G418抗性基因，通過G418抗生素篩選可獲得高效表達的含有多拷貝基因的工程菌株[21]。采用高密度發(fā)酵，甲醇添加量為2.5%條件下，葡糖糖氧化酶的表達量達到了較高酶量。與已報道葡萄糖氧化酶發(fā)酵水平相比該菌株具有較好的生產(chǎn)應(yīng)用前景[22]。

3 結(jié)論

本研究成功實現(xiàn)了黑曲霉葡萄糖氧化酶在畢赤酵母中組成型表達，對純化后的葡萄糖氧化酶糖基化分析表明該酶在畢赤酵母中表達具有30 kDa左右的糖基化修飾，對葡萄糖氧化酶的酶學(xué)性質(zhì)進行了分析。為了實現(xiàn)葡萄糖氧化酶的高效表達，構(gòu)建和篩選了誘導(dǎo)型表達葡萄糖氧化酶的高效發(fā)酵工程菌株并對發(fā)酵條件進行了分析，為黑曲霉葡萄糖氧化酶的進一步放大生產(chǎn)和研究提供了試驗依據(jù)。