張敏敏，趙志國，劉偉，崔莉，王岱杰，王曉，趙恒強(qiáng)

(齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)山東省分析測試中心 山東省中藥質(zhì)量控制技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗室，山東 濟(jì)南 250014)

丹參為唇形科植物丹參SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根和根莖[1]，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，丹參具有抗血栓、抗炎、抗氧化、改善微循環(huán)等作用[2-4]，臨床上廣泛用于心腦血管等疾病的治療。丹參主要產(chǎn)地包括山東、河南、四川以及云南等地，其中，山東已成為當(dāng)前全國最大的丹參產(chǎn)地和丹參制商品集散地[5]。四川為丹參的道地產(chǎn)區(qū)，是臨床上公認(rèn)的丹參質(zhì)量最佳產(chǎn)區(qū)。不同來源丹參飲片質(zhì)量存在參差不齊的情況，而有關(guān)這種差異情況缺乏系統(tǒng)的研究，嚴(yán)重制約著各地丹參的充分開發(fā)利用。

丹參的有效成分主要是脂溶性的丹參酮類和水溶性的丹酚酸類[6-8]。目前，2015版《中國藥典》對于丹參的質(zhì)控要求僅限于規(guī)定隱丹參酮、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA三種丹參酮總含量和一種丹酚酸(丹酚酸B)的含量[1]。中藥是多成分、多靶點(diǎn)的復(fù)雜體系，有限的指標(biāo)難以全面反映中藥的質(zhì)量。而且，藥典中丹參酮和丹酚酸的測定需采用不同的條件進(jìn)行，測定方法較為復(fù)雜繁瑣。近年來，已有學(xué)者發(fā)展了丹參酮和丹酚酸的HPLC同時測定方法[9-12]，為本研究提供了技術(shù)參考。

本研究發(fā)展了超聲輔助提取-HPLC-DAD同時測定丹參飲片中6種水溶性和脂溶性化學(xué)成分(咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B、二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮和丹參酮ⅡA)的方法，并對不同來源的丹參飲片進(jìn)行對比研究，研究結(jié)果將為丹參飲片的合理利用和質(zhì)量評價研究提供數(shù)據(jù)支持。

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗儀器及材料

Thermo Scientific UltiMate 3000超高效液相色譜儀(美國Thermo Scientific公司)，配有二元梯度泵、在線脫氣機(jī)、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、DAD檢測器；CPA225D型十萬分之一電子分析天平(德國Sartorius公司)；SB-5200D型高功率數(shù)控超聲波儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)；FW100型高速萬能粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)。

對照品為咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B、二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮和丹參酮ⅡA(上海源葉生物科技有限公司,純度均大于98%)；甲醇、乙腈(美國Tedia公司，色譜純)；乙醇(國藥集團(tuán)，分析純)；甲酸(美國ROE公司，色譜純)。丹參樣品購于濟(jì)南市各藥店及藥材市場，經(jīng)山東省分析測試中心王曉研究員鑒定為唇形科植物丹參SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根和根莖。具體樣品信息見表1。

表1 樣品信息

續(xù)表1

2.2 實(shí)驗方法

2.2.1 供試品溶液的制備

取丹參飲片粉碎，過4號篩。精密稱取丹參藥材粉末0.2 g，加入20 mL 80%甲醇水溶液，稱重，超聲恒溫提取30 min，冷卻至室溫稱重后用80%甲醇水溶液補(bǔ)足失重。提取液經(jīng)0.22 μm濾膜抽濾后備用。

2.2.2 對照品溶液的制備

精密稱取咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B、二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮和丹參酮ⅡA 對照品適量，加甲醇配制成濃度分別為1.70、2.40、1.00、1.30、1.20、1.00 mg·mL-1的對照品儲備溶液，4 ℃存儲備用。使用時，用甲醇稀釋上述標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，配制成不同濃度的單標(biāo)溶液。各取單標(biāo)溶液適量，配制所需濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.2.3 色譜條件

Luna C18(4.6 mm×250 mm，5.0 μm)柱。流動相A為乙腈，流動相B為水(0.6 %乙酸)，流速1.0 mL·min-1，進(jìn)樣量10 μL，檢測波長254 nm。梯度洗脫：0～5 min，3%～7% A；5～8 min，2%～22% A；8～15 min，22%～70% A；15～25 min，70%～90% A；25～30 min，90%～100% A。

3 結(jié)果與討論

3.1 色譜條件優(yōu)化

本文考察了Kromosial C18(4.6 mm×250 mm，5.0 μm)、Agilent SB C18(4.6 mm×250 mm，5.0 μm)、Agilent TC C18(4.6×250 mm，5.0 μm)和Luna C18(4.6 mm×250 mm，5.0 μm)色譜柱針對丹參中咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B、二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮和丹參酮ⅡA 6種成分的分離效果。結(jié)果表明，采用Luna C18(4.6 mm×250 mm，5.0 μm)色譜柱時，峰型和分離度較好。因此，選用Luna C18(4.6 mm×250 mm，5.0 μm)色譜柱對丹參飲片提取物進(jìn)行色譜分析。

對比了相同比例的乙腈-水和甲醇-水體系對提取物的分離效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用乙腈-水體系時，丹參飲片提取物分離效果明顯較好，故采用乙腈-水體系作為流動相。由于丹參提取物成分復(fù)雜，等度洗脫難以實(shí)現(xiàn)上述6種成分的色譜分離，因此采用梯度洗脫對丹參提取物進(jìn)行分析。

咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B等成分屬于酸性成分，易造成色譜峰拖尾，在流動相中加入一定量的弱酸可以抑制有機(jī)酸的電離從而改善色譜峰峰型?？疾炝怂喾謩e加入不同比例的乙酸(0.2%、0.4%、0.6%和0.8%)對丹參提取物色譜分離的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)水相中加入0.6%乙酸時色譜峰對稱性較好、峰型尖銳。

另外，柱溫對色譜峰分離度、峰型和保留時間等均具有一定的影響。先后調(diào)節(jié)柱溫箱溫度在25、30、35、40和45 ℃時比較得出，當(dāng)柱溫為40 ℃時，色譜峰分離度和峰型明顯較好，可以用于后續(xù)研究。

在波長選擇上，經(jīng)二極管陣列檢測器考察各類成分在不同波長(190～600 nm)下的紫外吸收波長。結(jié)果表明，在254 nm下各類成分均有吸收，且各化合物具有較好的分離度和靈敏度，因此選擇254 nm作為檢測波長。在優(yōu)化后的色譜條件下，丹參提取物的色譜分離圖如圖1所示。

1 咖啡酸；2 迷迭香酸；3 丹酚酸B；4 二氫丹參酮Ⅰ；5 隱丹參酮；6 丹參酮ⅡA

3.2 方法學(xué)考察

3.2.1 線性關(guān)系考察

分別精密吸取6種對照品溶液適量，按照不同比例稀釋得到不同濃度的混合對照品溶液。按照3.1的色譜條件進(jìn)樣分析，以峰面積為縱坐標(biāo)(y)，化合物濃度為橫坐標(biāo)(x)繪得各化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線，各化合物的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢測限(3倍信噪比計算)、定量限(10倍信噪比計算)見表2 。由表2中可以看出，在給出的線性范圍內(nèi)各化合物所建立的標(biāo)曲線性良好，可以用于后續(xù)的定量分析。

表2 6種成分的回歸方程、檢測限和定量限

3.2.2 精密度實(shí)驗

精密稱定丹參樣品0.2 g，處理后按2.2.3的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，分別測出6種化合物的峰面積和保留時間，計算出各個化合物的峰面積和保留時間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。6種化合物峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.294%、0.804%、1.000%、2.914%、0.329%、0.081%；保留時間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.020%、0.025%、0.083%、0.013%、0.015%、0.011%，說明儀器精密度良好。

3.2.3 重復(fù)性實(shí)驗

精密稱定同一丹參樣品6份，分別用2.2.1制備供試品溶液的方法處理，精密吸取5 μL進(jìn)樣分析，經(jīng)過計算得到6種化合物峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.692%、2.451%、2.380%、1.944%、2.137%、2.952%；保留時間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.210%、0.020%、0.031%、0.041%、0.034%、0.173%，說明該方法的重現(xiàn)性較好。

3.2.4 穩(wěn)定性實(shí)驗

取丹參樣品分別于0 、2 、4 、8 、12 、24 h進(jìn)樣分析，檢測和計算得到6種化合物峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為3.333%、2.659%、2.305%、1.620%、0.961%、2.512%；保留時間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.020%、0.053%、0.115%、0.008%、0.012%、0.010%。由于其保留時間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于1%，峰面積的相相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于4%，說明該樣的化學(xué)性質(zhì)在24 h內(nèi)較穩(wěn)定。

3.2.5 加標(biāo)回收率

精密稱取丹參樣品6份，每份0.2 g，分別精密稱定加入咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B、二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮和丹參酮ⅡA標(biāo)準(zhǔn)品適量，按上述供試品溶液制備方法處理后進(jìn)樣分析。其平均回收率(n=6)分別為94.42%、92.32%、101.04%、94.82%、95.39%、104.19%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.87%、1.98%、3.01%、2.95%、3.71%和4.19%。結(jié)果表明，各目標(biāo)成分加標(biāo)回收率為92.32%～104.19%，回收率良好。

3.3 含量測定

取17批不同來源的丹參樣品，采用2.2.1樣品溶液制備方法進(jìn)行制備，分別進(jìn)樣分析，得出上述6種化合物的相應(yīng)峰面積，根據(jù)上述方法中回歸方程算出各化合物的含量，平行3次取平均值。

利用Origin7.5 對所有含量測定數(shù)據(jù)按來源分組處理，得到帶誤差棒的柱狀圖，見圖2。由圖2中可以看出，來源于四川的丹參飲片中的6種成分含量均高于源自山東和云南的，尤其以丹酚酸B、隱丹參酮和丹參酮ⅡA的含量較為明顯。6種成分的總平均含量為 (11.72±0.71)mg·g-1。

圖2 三組丹參飲片中各化合物含量柱狀圖

不同來源丹參飲片中各化合物的含量均有差異。山東產(chǎn)丹參飲片的二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮和丹參酮ⅡA 3種丹參酮的含量高于云南產(chǎn)丹參飲片，來源于山東和云南的丹參飲片中上述3種丹參酮總含量分別為 (3.52±0.17)mg·g-1和(3.14±0.17)mg·g-1。而源自山東的丹參飲片中咖啡酸、迷迭香酸和丹酚酸B的含量低于源自云南的丹參飲片，這兩個地區(qū)丹參飲片中3種酚酸總含量分別為(37.75±2.26)mg·g-1和(54.09±0.27)mg·g-1。

3.4 聚類分析

聚類分析又稱群分析，是研究樣品或指標(biāo)分類問題的一種統(tǒng)計分析方法，同時也是數(shù)據(jù)挖掘的一個重要算法。本研究中以17批不同來源的丹參飲片樣本為研究對象，以HPLC法測得的6種水溶性和脂溶性成分的含量為變量，進(jìn)行聚類分析，以得到各樣本間的聚集關(guān)系，見圖3。

圖3 17批丹參飲片樣本的聚類分析圖譜

由聚類結(jié)果可以看出，圖3中1～10批樣本為一組，11～14號樣本為一組，15～17號樣本為一組分別聚集，結(jié)合表1中樣品來源信息可知這三組樣本分別來源于山東、四川和云南，該聚集關(guān)系與樣品信息高度一致。其中四川組和云南組聚集關(guān)系較近，推測可能是由于四川與云南地理來源較為接近，丹參藥材的種植條件(環(huán)境、氣候等)較為相似，造成所含化學(xué)成分具有相似的分布規(guī)律。其次，各組內(nèi)部也存在聚集關(guān)系差異，11～14號樣本組即四川組樣本中，11、12號和13、14號分別聚集較近，可能是由于這兩組飲片分別來源于四川不同產(chǎn)區(qū)。山東組中由于樣本量較大且來源復(fù)雜，其內(nèi)部聚集劃分等級和組別較多。

可以看出，采用本研究測定的丹參中6種水溶性和脂溶性成分含量結(jié)果結(jié)合聚類分析，可以較好地實(shí)現(xiàn)對不同來源丹參飲片樣品的區(qū)分，可以較為明顯地表現(xiàn)出各樣本間的差異關(guān)系。

4 結(jié)論

本研究發(fā)展了超聲輔助提取-HPLC-DAD同時測定丹參飲片中6種成分，即咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B、二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮和丹參酮ⅡA的方法。研究表明，該方法簡單、快速，可以實(shí)現(xiàn)丹參中不同極性成分的同時提取、分析。應(yīng)用該方法對山東、四川和云南不同來源的丹參飲片進(jìn)行分析表明，三個來源丹參飲片中各化合物的含量均存在一定差異，結(jié)合聚類分析可以實(shí)現(xiàn)其來源區(qū)分，進(jìn)一步證明了其產(chǎn)地差異性。

但由于受到樣品數(shù)量的限制，詳細(xì)的差異分析有待進(jìn)一步研究。本研究為了解不同來源丹參飲片的質(zhì)量現(xiàn)狀及合理利用提供了科學(xué)依據(jù)。