徐超逸 王丹菡 余丹揚 程靜 段萍

[摘要] 目的 探討卵泡刺激素受體（Follicule stimulating hormone receptor，FSHR）、黃體生成素受體（Luteinizing hormone receptor，LHR）與子宮內膜息肉發(fā)生的相關性。 方法 運用實時熒光定量PCR方法（Real-time Quantitative polymerase chain reaction，real-time PCR）以及免疫印跡方法（Southwestern blotting，WB）從基因水平以及蛋白水平測定2016年12月～2017年11月在我院行宮腔鏡下子宮內膜息肉摘除術患者子宮內膜息肉及其旁正常子宮內膜中FSHR、LHR的表達差異。 結果 通過real-time PCR結果顯示子宮內膜息肉組織中FSHR基因表達量0.0496（0.0431，0.0656），其旁正常子宮內膜組織中FSHR基因表達量0.0002（0.0001，0.0002），差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;子宮內膜息肉組織中LHR基因表達量（0.00012293±0.00004748），其旁正常子宮內膜組織中LHR基因表達量（0.00001931±0.00000380），差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;通過WB結果顯示子宮內膜息肉組織中FSHR蛋白表達水平0.4093（0.3925，0.4789），其旁正常子宮內膜組織蛋白表達水平 0.2235（0.1093，0.3285），差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;子宮內膜息肉組織中LHR蛋白表達水平0.4379（0.4062，0.4503），其旁正常子宮內膜組織蛋白表達水平 0.2235（0.1093，0.3278），差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。 結論 FSHR及LHR存在于人子宮內膜組織中，其在子宮內膜息肉組織中的表達高于其旁正常子宮內膜組織，得出子宮內膜息肉的發(fā)生不僅與雌激素受體及孕激素受體表達失調有關，與FSHR及LHR表達失衡亦有關。

[關鍵詞] 子宮內膜息肉;卵泡刺激素受體;黃體生成素受體;實時熒光定量PCR;蛋白免疫印跡

[中圖分類號] R711.74? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2019）27-0017-05

[Abstract] Objective To investigate the relationship between follic stimulating hormone receptor（FSHR）， luteinizing hormone receptor（LHR） and the occurrence of endometrial polyps. Methods At the gene level and protein level， real-time quantitative polymerase chain reaction（real-time PCR） and Western blotting（WB） were used to determine the differences in the expression of FSHR and LHR between endometrial polyps and adjacent normal endometrium in the patients who received endometrial polypectomy under endoscopy in our hospital from December 2016 to November 2017.Results According to the results of real-time PCR， the gene expression quantity of FSHR in endometrial polyps was 0.0496（0.0431， 0.0656）， and the gene expression quantity of FSHR in adjacent normal endometrium was 0.0002（0.0001， 0.0002）. The differences were statistically significant（P<0.05）; the gene expression quantity of LHR in endometrial polyps was（0.00012293±0.00004748）， and the gene expression quantity of LHR in adjacent normal endometrium was（0.00001931±0.00000380）. The differences were statistically significant（P<0.05）; according to the WB results， the protein expression level of FSHR in endometrial polyps was 0.4093（0.3925， 0.4789）， and the protein expression level in adjacent normal endometrium was 0.2235（0.1093， 0.3285）. The difference was statistically significant（P<0.05）; the protein expression level of LHR in endometrial polyps was 0.4379（0.4062， 0.4503）， and the protein expression level in adjacent normal endometrium was 0.2235（0.1093， 0.3278）. The differences were statistically significant（P<0.05）. Conclusion FSHR and LHR are present in human endometrial tissues， and the expression in endometrial polyps is higher than that in adjacent normal endometrium. It is concluded that the occurrence of endometrial polyps is not only related to the expression imbalance of estrogen receptor and progesterone receptor， but also related to the imbalance of FSHR and LHR expression.

[Key words] Endometrial polyps; Follic stimulating hormone receptor（FSHR）; Luteinizing hormone receptor（LHR）; Real-time quantitative polymerase chain reaction（real-time PCR）; Western blotting（WB）

子宮內膜息肉（Endometrial polyps，EP）為局部子宮內膜過度增生形成的贅生物，可有蒂或無蒂，是由纖維化內膜間質（含厚壁血管）以及子宮內膜腺體構成。目前研究發(fā)現EP的發(fā)生與局部激素環(huán)境紊亂、炎癥、細胞增殖與凋亡失調、細胞因子及其受體紊亂以及染色體異常有關[1，2]，宮腔鏡為目前治療EP的首選方案，但術后復發(fā)率高，現臨床上使用雌激素抑制劑、孕激素、避孕藥、小劑量米非司酮以及左炔諾孕酮宮內緩釋系統(tǒng)[3]預防術后復發(fā)，但由于藥物局限性，以及患者依從性不同目前尚無統(tǒng)一治療方案。另隨著輔助生殖技術開展廣泛，現研究發(fā)現卵巢刺激與新發(fā)子宮內膜息肉相關，而子宮內膜息肉影響子宮內膜容受性，與妊娠成功率直接相關[4]，因此研究EP發(fā)病機制可為臨床治療及預防提供一條新思路。

卵泡刺激素（Follicule stimulating hormone，FSH）和黃體生成素（Luteinizing hormone，LH）是垂體分泌的兩種重要的促性腺激素，在正常表達水平下，上述兩種激素通過結合卵巢組織中的FSHR 和LHR發(fā)揮其生理作用[5-7]，且研究發(fā)現兩者在體內多種器官中存在，在人子宮內膜組織中亦有表達。目前研究表明FSH可能參與血管生成[8]，LH可能參與炎癥及增加細胞侵襲性[9]，與目前了解的子宮內膜息肉發(fā)生機制有相吻合之處，且有研究表明LHR在子宮內膜中有表達[10]，因此本實驗考慮子宮內膜息肉形成除與雌孕激素受體異常相關外，是否與促性腺激素受體異常有關，本實驗通過WB及real-time PCR方法檢測子宮內膜息肉組織和正常子宮內膜組織中FSHR及LHR表達差異研究子宮內膜息肉的發(fā)病機制。

1 材料與方法

1.1 材料來源

1.1.1 標本? 選取2016年12月～2017年11月在我院就診通過陰道超聲提示“宮腔占位：子宮內膜息肉可能”，予行全麻下宮腔鏡檢查術患者30例，患者體重指數（BMI范圍18.7～22.9 kg/m2），入組病例6個月內均未用過激素類藥物、未放置宮內節(jié)育器或接受宮腔手術，無急慢性盆腔炎癥，無多囊卵巢綜合征、子宮肌瘤、子宮腺肌病、盆腔子宮內膜異位癥、糖尿病、甲狀腺功能異常等代謝性疾病及其他惡性疾病及嚴重并發(fā)癥。30例患者手術時間選取經凈后3～7 d，宮腔鏡檢查術發(fā)現均為單發(fā)子宮內膜息肉，且子宮內膜息肉最大徑線小于2 cm，平均年齡為（31.55±6.77）歲（實際年齡21～45歲）。選取子宮內膜息肉組織（EP）為實驗組，子宮內膜息肉旁組織（EN）為對照組，所有患者均簽署知情同意書。

1.1.2 主要試劑? PCR引物（上海英駿生物技術有限公司）、TrizolRNA提取試劑（美國英駿公司）、逆轉錄試劑盒、SYBR Green Realtime PCR Master Mix-Plus（日本Toyobo公司）、瓊脂糖（晶美生物工程有限公司）、TAQ酶（Fermentas公司）、二硫蘇糖醇、丙烯酰胺、Tris堿、N，N-亞甲基丙烯酰胺（Sigma公司）、PVDF膜（美國BIO-RAD公司）、FSHR及LHR一抗（Santa Cruz公司）、HRP標記二抗（武漢博士德）。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取和cDNA合成? ①組織RNA提?。呵腥∫恍K-80℃保存的子宮內膜息肉及其旁正常子宮內膜樣本組織，研磨震蕩后，用Trizol溶解總RNA，異丙醇沉淀總RNA，75%乙醇洗滌RNA后用DEPC水溶解RNA。紫外分光光度計測定總RNA濃度。②cDNA合成：取1 μg的總RNA為模板，以Oligo（dT）引物和隨機引物反轉錄合成cDNA第一鏈。反應條件：25℃ 10 min，42℃ 60 min，52℃ 15 min，70℃15 min，4℃永久。

1.2.2 實時熒光定量PCR? 取上述反轉錄后的cDNA 1 μL，加入10 μL 25×SYBR GreenPremix配制成25 μL的反應體系。置于Step OnePlusTM qRT-PCR系統(tǒng)，反應條件：95℃ 90 s 預變性，95℃ 5 s、58℃ 1 min、58℃ 10 s循環(huán)68次、4℃永久。每個樣本設置3個復孔，且以GAPDH作為內參，以2-△CT方法計算目的基因的相對表達水平。FSHR正向引物為5-AAAGCTGCCTACTCTGGAAAAG -3，反向引物為5-GACCCCTAGCCTGAGTCATATAA -3;LHR正向引物為5-ACTGGGACACTGAGAAGGG-3，反向引物為5-GGAAATGAGCATGACCTTTGGTG -3。

1.2.3 Western blot? 常規(guī)方法提取子宮內膜息肉組織與其旁正常子宮內膜組織總蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白轉移至硝酸纖維（NC）膜上，用質量分數為5%的BSA/脫脂牛奶封閉NC膜1 h，加入FSHR、LHR一抗或β-actin（抗體）：V（TBS）=1：1000稀釋于TBS中，4℃過夜;洗膜后加入HRP標記的二抗（1：2000稀釋），室溫下緩慢振蕩2 h，最后用化學發(fā)光試劑盒顯色、曝光，用圖像分析軟件對蛋白條帶作灰度掃描分析，β-actin作為內參。

1.3 觀察指標

1.3.1 Real-time PCR的觀察指標? Real-time PCR的檢測結果，CT值是在real-time PCR技術中一個非常重要的概念，C表示Cycel，T表示threshold，CT值表示每個反應管中熒光信號要達到設定的閾值所需要經歷的循環(huán)數量。每個目的基因的表達量用2-ΔCT表示，ΔCT為實驗的標本（EP組以及EN組）在PCR擴增過程中的平均CT值（每個標本做3個復孔）減去內參（GAPDH）的平均CT值（3個復孔），本實驗將每個目的基因的表達量作為觀察指標。

1.3.2 Western-blot的觀察指標? 用圖像分析軟件將WB實驗獲得的每個特異性條帶灰度值進行數字化掃描分析，β-actin作為內參，本實驗將實驗組及對照組獲得的灰度值與內參獲得的灰度值的比值作為觀察指標。

1.4統(tǒng)計學方法

所有數據均采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計分析。正態(tài)分布計量資料用（x±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗;非正態(tài)分布計量資料用M（P25，P75）表示， 組間比較用Mann-Whitney U 檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 PCR實驗結果

FSHR基因表達量數據不服從正態(tài)分布，用兩個獨立樣本秩和檢驗，得到FSHR基因表達量在EP組及EN組中的表達差異，EP組中FSHR表達較EN組中增多，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表1、圖1。LHR基因表達量數據服從正態(tài)分布，用兩個獨立樣本t檢驗，得到LHR基因表達量在EP組及EN組中的表達差異，EP組中LHR表達較EN組中增多，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表2、圖2。

2.2 Western-blot實驗結果

2.2.1 在Western-blot中FSHR、LHR蛋白條帶表達差異? a為子宮內膜息肉組織中FSHR蛋白條帶，b為正常內膜組織中FSHR蛋白條帶，c為β-actin蛋白的條帶，d為子宮內膜息肉組織中LHR蛋白的條帶，e為正常子宮內膜LHR蛋白的條帶，f為β-actin蛋白的條帶。從圖片得知，在子宮內膜息肉組織中FSHR蛋白表達高于正常子宮內膜組織;在子宮內膜息肉組織中LHR蛋白表達高于正常子宮內膜組織（圖3）。

2.2.2 數據分析? 數據均不服從正態(tài)分布，用兩個獨立樣本秩和檢驗，得到FSHR、LHR蛋白在EP組及EN組中的表達差異，EP組中FHSR、LHR的表達較EN組中增多，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表3、4及圖4、5。

3討論

根據目前國內外關于子宮內膜息肉的研究，局部子宮內膜高雌激素是導致子宮內膜息肉的病因是可以下定論的，大量研究發(fā)現ER以及PR在子宮內膜息肉中呈現高表達趨勢，推測子宮內膜息肉的發(fā)生可能與子宮局部激素受體表達失衡相關[11-17]，根據子宮內膜息肉流行病學調查顯示其發(fā)病率在圍絕經期婦女達到高峰，此時期的婦女由于體內雌激素降低，FSH異常升高，用子宮內膜高雌激素理論難以解釋該年齡婦女子宮內膜息肉的病因，因此推測子宮內膜息肉的發(fā)生是否與促性腺激素紊亂相關。另有學者考慮子宮內膜息肉的發(fā)生是由于子宮內膜持續(xù)受損，導致血管生成因子（VEGF）及致炎因子及其受體表達升高，促進炎細胞聚集、浸潤及血管生成，導致子宮內膜炎癥狀態(tài)持續(xù)存在，宮腔鏡下見部分EP的形成伴隨著周圍子宮內膜的增厚、周圍充血、水腫等一系列變化，推測子宮內膜持續(xù)的炎癥可能與子宮內膜息肉的發(fā)生、發(fā)展相關。Xiao Y等[12]發(fā)現在子宮內膜息肉組織較其周圍正常子宮內膜組織中VEGF以及其受體的表達升高，考慮這些細胞活性因子可能在宮腔持續(xù)炎性刺激下產生，在子宮內膜息肉的形成過程中起到一定作用，促進子宮內膜組織中血管生成增加以及促進細胞生成導致子宮內膜息肉的發(fā)生。

另外Zhang Z等[13]研究發(fā)現FSH在腫瘤中通過影響VEGF、缺氧誘導因子等因子水平來促進血管生成， 從而促進腫瘤的形成與發(fā)展。Petersen SL等[18]發(fā)現不同性別人體內LH差異通過核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路介導， NF-κB是體內發(fā)生炎癥的重要通路，吳允等[19]發(fā)現NF-κB在EP組織中較其周圍內膜或正常子宮內膜中表達顯著升高，考慮NF-κB介導子宮內膜持續(xù)炎癥，促成EP的發(fā)生與發(fā)展。

在動物實驗中，將卵巢組織進行體外培養(yǎng)過程中，持續(xù)將FSH作用于其中，實驗結果表明其受體能持續(xù)表達，表明FSH能提高其受體表達水平，且呈現激素依賴性[20];研究發(fā)現單獨在雌激素作用下FSH受體數量未見明顯增減，但協助FSH共同作用下能夠將每一個細胞上的FSHR數量有所提高。在雌激素與FSH共同誘導形成LHR，形成的LHR反過來又能夠增強卵泡細胞上ER與雌激素結合的能力，促進雌激素的形成，由此形成特定的卵泡良性循環(huán)。有文獻報道，在FSHR 和LHR表達陽性的子宮內膜癌患者體內注射GnRH類似物或拮抗劑取得了一定的療效，因此考慮FSHR和LHR與子宮內膜癌的發(fā)生、發(fā)展存在一定的關聯，但其在子宮內膜癌中的作用機制目前尚不明確，考慮可能和子宮內膜腫瘤的激素依賴性有關?？紤]FSH與LH不僅通過作用于卵巢中的FSHR、LHR來引起雌孕激素紊亂，引起子宮內膜息肉的發(fā)生，還可能通過局部作用來調節(jié)子宮內膜的生理功能，引起子宮內膜增生與脫落失衡，參與了子宮內膜息肉的發(fā)生、發(fā)展。本研究結果顯示FSHR、LHR存在于子宮內膜息肉組織及其旁正常子宮內膜組織中，且在子宮內膜息肉組織中呈高表達，綜合上述觀點，FSHR、LHR的表達異?？赡芘c子宮內膜息肉的發(fā)生相關，根據FSHR、LHR的相關特性推測其可能通過局部炎癥、血管增生、局部激素受體紊亂方面促進子宮內膜息肉的發(fā)生、發(fā)展，今后需做相關細胞功能試驗進行進一步驗證。

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（收稿日期：2019-01-30）