熊林等

[摘要] 目的 探討αB-crystallin基因在喉癌組織中的表達(dá)及其與喉癌的關(guān)系。 方法 收集2008年3月～2014年10月南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院及皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院手術(shù)切除的喉癌標(biāo)本54例及13例癌旁正常黏膜標(biāo)本，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time PCR）檢測8例喉癌組織及其癌旁正常組織中αB-crystallin基因的表達(dá)，免疫組化法檢測54例癌組織及13例癌旁正常組織中αB-crystallin蛋白的表達(dá)，比較不同組織中αB-crystallin陽性表達(dá)率。 結(jié)果 喉癌組織中的αB-crystallin mRNA表達(dá)量及αB-crystallin蛋白陽性表達(dá)率均明顯高于癌旁正常組織，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）；不同TMN分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況的喉癌組織中αB-crystallin蛋白的陽性表達(dá)率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），不同性別、年齡、腫瘤分型及分化程度的喉癌組織中αB-crystallin蛋白的陽性表達(dá)率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。 結(jié)論 αB-crystallin基因的高表達(dá)與喉癌發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移有關(guān)，可能為喉癌患者的預(yù)后提供一個(gè)潛在的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估指標(biāo)。

[關(guān)鍵詞] αB-crystallin；實(shí)時(shí)熒光定量PCR；喉癌；免疫組化

[中圖分類號(hào)] R739.63 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2016）10（a）-0009-04

Expression and significance of αB-crystallin in laryngeal squamous cell carcinoma

XIONG Lin1 MAO Yuan2 MA Jun3 ZHANG Dawei4▲ ZHU Jin5 CHEN Renjie4

1.Department of Pathology， the Second Affiliated Hospital of Nanjing Medical University， Jiangsu Province， Nanjing 210029， China； 2.Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery， Jiangsu Provincial Official Hospital， Jiangsu Province， Nanjing 210024， China； 3.Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery， Yiji Shan Hospital of Wannan Medical College， Anhui Province， Wuhu 241001， China； 4.Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery， the Second Affiliated Hospital of Nanjing Medical University， Jiangsu Province， Nanjing 210029， China； 5.Military Medical Research Institute of Nanjing Military Region， Jiangsu Province， Nanjing 210002， China

[Abstract] Objective To examine the expression of αB-crystallin in human laryngeal squamous cell carcinoma （LSCC） and investigate the relationship between its expression and LSCC. Methods A total of 54 cases of LSCC and 13 cases of adjacent normal tissues were collected from the Second Affiliated Hospital of Nanjing Medical University and Yiji Shan Hospital of Wannan Medical College from March 2008 to October 2014. Real-time quantitative polymerase chain reaction （8 LSCC tissues， 8 adjacent normal tissues） and immunohistochemistry （54 LSCC tissues and 13 adjacent normal tissues） were performed to detected the expression of αB-crystallin gene and protein in LSCC. The positive expression rate of αB-crystallin in different tissues was compared. Results The positive expression rate of αB-crystallin mRNA and protein in LSCC were significantly higher than those in tumor-adjacent normal tissues， the differences were statistically significant （P < 0.01）. the positive expression rate of αB-crystallin in LSCC with different pTNM stage and lymph node metastasis status had statistically significant difference （P < 0.05）； while， there was no statistically significant difference in the positive expression rate of αB-crystallin in LSCC with different gender， age， tumor classification and differentiation （P > 0.05）. Conclusion The data suggest that αB-crystallin expression is correlated with malignant phenotypes of LSCC and it may serve as a novel prognostic factor for LSCC.

[Key words] αB-crystallin； Real-time PCR； Laryngeal squamous cell carcinoma； Immunohistochemistry

鱗狀細(xì)胞癌（squamous cell carcinoma，SCC）是頭頸部的最常見的惡性腫瘤，占發(fā)展中國家所有疾病的1/4。在所有頭頸部惡性腫瘤中有近90%是鱗狀細(xì)胞癌[1]。在這其中，又有約1/4的頭頸部癌是喉癌（laryngeal squamous cell carcinoma，LSCC）。喉癌是喉部上皮起源的惡性腫瘤，臨床癥狀通常取決于腫瘤原來的位置和大小[2-3]。近年來喉鱗狀細(xì)胞癌治療策略已經(jīng)取得了一些進(jìn)展，但是治療效果仍然不是十分滿意，喉癌死亡率仍較高，5年存活率僅64%[4]。因此，迫切需要尋找一種新穎而有價(jià)值的靶標(biāo)志提示患者的預(yù)后或早期復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)從而指導(dǎo)治療[5]。

αB-crystallin屬于小熱休克蛋白家族（HSP20）的成員之一，最早發(fā)現(xiàn)于眼部，早期研究對(duì)其在晶狀體、心肌和骨骼肌功能的影響研究較多?，F(xiàn)階段的研究發(fā)現(xiàn)αB-crystallin具有對(duì)細(xì)胞的保護(hù)及抗凋亡作用的雙重功能[6]。最近的資料還顯示，多種實(shí)體瘤上αB-crystallin的表達(dá)異常，如頭頸部腫瘤、口腔鱗癌、非小細(xì)胞肺癌以及乳腺基底細(xì)胞樣癌，且這種異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后有相關(guān)性[7-10]。本文通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time PCR）檢測及免疫組化方法檢測αB-crystallin基因在喉癌和癌旁正常組織中的表達(dá)差異，初步探討其與喉癌的發(fā)生發(fā)展以及浸潤轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象

收集2008年3月～2014年10月南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院及皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院喉癌手術(shù)切除的標(biāo)本54例，同時(shí)選取13例距離腫瘤2 cm以上的癌旁喉黏膜組織作為對(duì)照，病理證實(shí)均為正常喉黏膜。其中8例癌組織及其遠(yuǎn)端正常組織在取標(biāo)本后立即置液氮中保存。54例喉癌患者中，男48例，女6例；年齡42～81歲，平均（60.4±11.54）歲；聲門型43例，聲門上型8例，聲門下型3例；組織病理學(xué)分級(jí)：高分化23例，中低分化31例；伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30例，不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移24例；臨床分期及組織病理學(xué)分級(jí)按2002年國際抗癌協(xié)會(huì)（UICC）TMN分類標(biāo)準(zhǔn)及組織病理學(xué)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)第4版第二次修訂方案：Ⅰ～Ⅱ期28例，Ⅲ～Ⅳ期26例。術(shù)前患者均未經(jīng)任何治療，經(jīng)病理確診為喉鱗狀細(xì)胞癌，且均知曉并同意參與本研究。本研究已經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑

Trizol試劑盒（Invitrogen公司），RT-PCR試劑盒（Promega公司），αB-crystallin上游引物：5'-CTTTGA CCAGTTCTTCGGAG-3'，下游引物：5'-CCTCAATCACATCTCGCTGT-3'；β-actin上游引物：5'-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3'，下游引物：5'-GCTGCTACCTT CACCGTTCC-3'。所有引物序列均由上海英俊生物工程有限公司提供。鼠抗人αB-crystallin單克隆抗體（Santa Cruz Biotechnology，USA）；二步法免疫組化試劑和PV-9000（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time PCR）

按照試劑盒的說明提取總RNA，具體步驟見說明書，提取的總RNA置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系（20 μL）中加入適量總RNA（2 μL），70℃ 5 min，冰水冷卻后加入逆轉(zhuǎn)錄buffer及逆轉(zhuǎn)錄酶37℃孵育1 h，然后升溫至95℃滅活5 min，立即冰浴，-20℃保存?zhèn)溆?。然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在25 μL PCR反應(yīng)體系中加入cDNA 5 μL及引物，擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性45 s，57℃退火45 s，72℃延伸45 s。循環(huán)30次。最后72℃延伸10 min，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物。分別取5 μL PCR產(chǎn)物，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，對(duì)凝膠進(jìn)行灰度掃描及照像。Real-time PCR實(shí)驗(yàn)使用SYBR熒光染料，在ABI PRISMR7000熒光定量PCR儀（Perkin-Elmer，F(xiàn)oster City，CA，USA）上設(shè)置實(shí)時(shí)定量PCR（QPCR）的反應(yīng)條件50℃孵育2 min，95℃預(yù)變性10 min；94℃變性15 s，循環(huán)40 次，56℃退火1 min。

1.4 免疫組織化學(xué)染色

本研究中54例喉癌及13例正常組織福爾馬林處理后石蠟包埋，切片后采用兩步法對(duì)所有標(biāo)本切片進(jìn)行免疫組化染色，檢測各組標(biāo)本的αB-crystallin蛋白表達(dá)情況，具體操作參照試劑盒說明進(jìn)行，染色結(jié)果判定：由2名獨(dú)立的病理科醫(yī)師采用半定量積分法閱片，結(jié)果由染色強(qiáng)度和染色密度或陽性細(xì)胞率決定，觀察10個(gè)視野（200倍），將染色強(qiáng)度分為4級(jí)進(jìn)行評(píng)分，0分：無染色，1分：淡黃色，2分：棕黃色，3分：棕褐色；計(jì)算陽性細(xì)胞率，根據(jù)陽性率進(jìn)行評(píng)分，1分：陽性率<10%，2分：陽性率為10%～<50%，3分：陽性率為50%～<80%，4分：陽性率為80%～100%。最后評(píng)分=染色強(qiáng)度評(píng)分×陽性率評(píng)分，0～3分為陰性，>3分為陽性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 αB-crystallin基因表達(dá)

PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測見一特異擴(kuò)增條帶，其分子量大小與αB-crystallin預(yù)期結(jié)果（230 bp）相符（圖1），β-actin作為內(nèi)參。QPCR檢測結(jié)果顯示αB-crystallin基因在喉癌組織中mRNA表達(dá)水平（5.398±0.882）明顯高于正常喉組織（2.195±0.534），差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t = 6.942，P < 0.01）。

2.2 αB-crystallin蛋白表達(dá)

αB-crystallin蛋白主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)中，染色呈彌漫性顆粒狀。在鱗癌組織中癌巢的染色較強(qiáng)，部分見核染，在正常上皮組織中不表達(dá)或表達(dá)較弱（圖2）。54例喉癌組織中有39例陽性，15例陰性。正常黏膜組織標(biāo)本中11例呈陰性表達(dá)，2例陽性表達(dá)，兩組比較差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2 = 14.254，P < 0.01）。不同性別、年齡、腫瘤分型及分化程度的喉癌組織中αB-crystallin蛋白的陽性表達(dá)率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）；不同TMN分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況的喉癌組織中αB-crystallin蛋白的陽性表達(dá)率比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2 =6.591、10.634，均P < 0.05），Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移喉癌組織染色強(qiáng)度顯著高于Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者。

3 討論

αB-crystallin作為一種熱穩(wěn)定性良好的蛋白，具有分子伴侶的作用，能幫助蛋白質(zhì)的正確折疊、移位、復(fù)性和降解，同時(shí)能夠抑制DNA損傷藥物、TNF和Fas蛋白等誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用[11-12]，使得它在腫瘤發(fā)生發(fā)展及預(yù)后中起著重要作用[13-16]。

本研究發(fā)現(xiàn)，喉癌組織中的αB-crystallin mRNA表達(dá)水平明顯高于癌旁正常組織，免疫組化結(jié)果也顯示喉癌組織中αB-crystallin蛋白陽性表達(dá)率明顯高于癌旁正常組織，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01），與αB-crystallin在其他腫瘤中的研究結(jié)果一致[7-10]?？赡苁怯捎讦罛-crystallin可以通過內(nèi)在的線粒體途徑和外在的凋亡受體阻斷細(xì)胞凋亡的信號(hào)傳遞，抑制了細(xì)胞的凋亡，從而有促進(jìn)腫瘤的形成[6]。本研究發(fā)現(xiàn)αB-crystallin Ⅲ～Ⅳ期喉癌組織的染色強(qiáng)度顯著高于Ⅰ～Ⅱ期，可能機(jī)制為αB-crystallin的表達(dá)促進(jìn)上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，并使腫瘤細(xì)胞進(jìn)一步惡性增殖，同時(shí)使腫瘤細(xì)胞易于遷移侵襲[6]。本研究中，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的喉癌組織中αB-crystallin蛋白陽性表達(dá)率明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，提示αB-crystallin也有促癌生長及腫瘤轉(zhuǎn)移的特性，最近的文獻(xiàn)也進(jìn)一步支持了這種結(jié)論[6]。但是，也有研究顯示，αB-crystallin在一些頭頸部腫瘤中表達(dá)下降或缺失，如甲狀腺癌、鼻咽癌[17-18]，這些研究提示了αB-crystallin基因在某些腫瘤發(fā)病機(jī)制中可能發(fā)揮著腫瘤抑制的作用。Chin等[5]研究發(fā)現(xiàn)頭頸癌腫瘤組織有αB-crystallin基因過表達(dá)現(xiàn)象，其過表達(dá)與預(yù)后呈明顯負(fù)相關(guān)，且其中19例αB-crystallin過表達(dá)但無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中有7例復(fù)發(fā)，提示αB-crystallin可能具有潛在的、較淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移更有意義的患者預(yù)后的評(píng)估指標(biāo)。本研究病例數(shù)較少，期待在后續(xù)的研究中對(duì)αB-crystallin及喉癌預(yù)后作出更有意義的評(píng)估。

目前，喉癌的治療手段包括分子靶向治療、基因治療以及免疫治療。然而沒有一種治療方法起到令人滿意的治療效果。近年來的研究也發(fā)現(xiàn)了一些喉癌的分子靶標(biāo)[19-20]，因此，找到一種預(yù)后靶標(biāo)對(duì)于喉癌治療和預(yù)防更加重要。而αB-crystallin的高表達(dá)在喉癌的發(fā)生發(fā)展過程中可能會(huì)產(chǎn)生重要的作用。這或許可以為喉癌的治療提供一個(gè)潛在的靶標(biāo)。

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（收稿日期：2016-06-30 本文編輯：任 念）