吳志鵬+劉健+趙俊生

摘要：構(gòu)建雞卵清蛋白啟動子（OV 2.8kb）與含有eGFP基因的慢病毒表達(dá)載體，采用實時熒光定量PCR（QPCR）檢測重組慢病毒滴度。將雞卵清蛋白啟動子基因OV連接到慢病毒載體pLVshRNA-eGFP中替換質(zhì)粒上CMV promoter 元件，經(jīng)酶切、測序鑒定獲得攜帶OV與eGFP融合基因的重組慢病毒質(zhì)粒，用QPCR檢測病毒濃度滴定。結(jié)果顯示，重組慢病毒質(zhì)粒pLVshRNA-OV-eGFP酶切鑒定結(jié)果與目的基因條帶吻合，克隆測序結(jié)果與NCBI收錄的OV基因序列完全一致。在QPCR試驗過程中，發(fā)現(xiàn)空白組和載體組的溶解曲線和擴(kuò)增曲線較好，證明基因組抽提和QPCR過程無問題。最終測得病毒滴度約為1.6×107 IU/mL。成功構(gòu)建了攜帶OV與eGFP融合基因的慢病毒表達(dá)載體，為進(jìn)一步研究卵清蛋白啟動子基因的相關(guān)功能提供了優(yōu)質(zhì)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染載體。

關(guān)鍵詞：雞卵清蛋白；慢病毒載體；實時熒光定量PCR；病毒滴度

中圖分類號： S852.65 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）11-0038-02

近年來，通過利用禽類輸卵管制作生物反應(yīng)器以大規(guī)模生產(chǎn)藥物已成為研究熱點領(lǐng)域[1-2]，而實現(xiàn)外源基因在禽類輸卵管組織中的特異性表達(dá)必須有組織特性型的啟動子參與。使用雞卵清蛋白啟動子構(gòu)建禽輸卵管生物反應(yīng)器是1種很有前途的策略[3-5]。本研究擬構(gòu)建卵清蛋白OV與綠色熒光蛋白eGFP融合基因的慢病毒載體，為進(jìn)一步研究禽輸卵管生物反應(yīng)器提供試驗基礎(chǔ)[6-7]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞、菌株及質(zhì)粒 大腸桿菌宿主菌DH5α來自浙江大學(xué)動物科學(xué)院動物遺傳育種與繁殖實驗室。HEK-293T細(xì)胞，慢病毒表達(dá)載體質(zhì)粒pLVshRNA-eGFP。

1.1.2 主要試劑及藥品 限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、Taq DNA聚合酶、割膠回收試劑盒、Marker 1 kb。血液基因組DNA提取試劑盒、DNA快速純化回收試劑盒、普通質(zhì)粒提取試劑盒。DNaseⅠ；QPCR mix；BioTek ND5000。雞卵清蛋白啟動子OV和用Primer 5.0軟件自行設(shè)計，由英濰捷基（上海）生物公司合成。新鮮雞血20 mL。

1.2 重組慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

1.2.1 雞卵清蛋白啟動子OV基因克隆 用DNA提取試劑盒從新鮮雞血中提取雞基因組DNA[8-9]。用Primer 5.0軟件設(shè)計雞卵清蛋白啟動子OV引物，其中在OV引物上游F加上SpeⅠ酶切位點、下游R加上AgeⅠ酶切位點，OV-F：5′-ACACTAGTGTCCTCAGACTTGGC-3′，OV-R：5′-GCACCGGTTGAACTCTGAGTTGTCTAG-3′；用雞基因組DNA做模板，設(shè)計OV的PCR反應(yīng)體系，PCR擴(kuò)增OV目的片段。用SpeⅠ和AgeⅠ雙酶切OV基因和pLVshRNA-eGFP載體。酶切過后用1%低熔點瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收OV目的片段及線性化pLVshRNA-eGFP載體，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 慢病毒克隆載體pLVshRNA-OV-eGFPP構(gòu)建鑒定

連接OV目的基因和線性化載體pLVshRNA-ERE-eGFP：OV基因 2 μL、載體pLVshRNA-ERE-eGFP片段 1.5 μL、T4 DNA聚合酶 2 μL、10×ligation buffer 2 μL、ddH2O 12.5 μL （總體積20 μL），16 ℃連接過夜。連接后命名為pLVshRNA-OV-eGFP。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5a，隨機(jī)挑取數(shù)個單菌落，分別搖菌過夜，小提重組質(zhì)粒DNA。進(jìn)行SpeⅠ和AgeⅠ雙酶切鑒定，并將最終連接好的pLVshRNA-OV-eGFPP質(zhì)粒載體送英濰捷基（上海）生物公司測序鑒定。

1.3 QPCR檢測重組慢病毒滴度

1.3.1 病毒感染293T細(xì)胞 將狀態(tài)良好的目的細(xì)胞接種到6孔板，待細(xì)胞長到50%、約1×106個/mL時加50 μL病毒感染細(xì)胞[10]。感染開始后20 h，除去培養(yǎng)上清，換為500 μL含DNaseI （TaKaRa Mirus Bio，終濃度為10 U/mL）的新鮮培養(yǎng)基。在37 ℃消化15 min，以除去殘余的質(zhì)粒DNA。然后換為2 mL正常的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。用0.5 mL 0.25%胰酶-EDTA溶液消化細(xì)胞，在37 ℃放置1 min。在培養(yǎng)基吹洗下，離心收集細(xì)胞[11-13]。

1.3.2 細(xì)胞DNA的提取 加入400 μL ACL Solution 和 10 μL Proteinase K。振蕩混勻1 min，然后置于55 ℃水浴 10～20 min，在此期間可以適當(dāng)取出混勻，有助于充分裂解。取出樣品，待降至室溫時輕輕振蕩混勻。取預(yù)處理好的樣品，依次加入 300 μL Ext solution 和 300 μL AB solution，用力搖勻，12 000 r/min 離心5 min。溶液將分層，上層為藍(lán)色的抽提層，下層為透明水相，2層溶液中間可能會有部分沉淀層，DNA在下層水相中。將槍頭穿過上層溶液，深入到下層溶液，將下層溶液仔細(xì)吸出至 GenClean Column 中，盡量避免吸到上層溶液及中間層的沉淀。8 000 r/min 離心1 min，取下層 GenClean Column倒掉收集管中廢液。將 GenClean Column 放回收集管中，加入 500 μL Wash Solution，8 000 r/min室溫離心1min。取下 GenClean 柱，棄去收集管中的廢液。將柱放回收集管中，12 000 r/min室溫離心1 min，以除去殘留Wash Solution。將柱放入新的潔凈1.5 mL 離心管中，在柱中央加入 50～100 μL ddH2O，室溫或55 ℃放置2 min。然后 12 000 r/min室溫離心1 min。離心管中的液體即為基因組 DNA[14-15]。

1.3.3 Real-time PCR 分析 Real-time PCR 反應(yīng)體系：2×Real-time PCR Master Mix 10 μL、F/R（序列詳見表1） Primer （10 μmol/L） 0.8 μL、 eachcDNA Template（1 ∶100 dilution）1 μL，ddH2O加至20 μL。

Real-time PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，共40個循環(huán)。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞卵清蛋白啟動子OV片段克隆

用雞基因組DNA做模板，PCR擴(kuò)增雞卵清蛋白啟動子OV，1%低熔點瓊脂糖凝膠電泳鑒定（圖1）。測序結(jié)果證明片段序列與NCBI收錄的OV一致。

2.2 慢病毒克隆載體pLVshRNA-OV-eGFPP構(gòu)建鑒定及QPCR滴度測定

2.2.1 重組慢病毒質(zhì)粒的鑒定 重組慢病毒質(zhì)粒pLVshRNA-OV-eGFP 大小約為10 kb，通過限制性內(nèi)切酶SpeI和AgeI雙酶切后被切成2個片段：大片段約為7.2 kb，小片段約為2.8 kb。由圖2可知，目的條帶大小基本與預(yù)期一致。將陽性重組載體測序，證明外源基因片段成功插入慢病毒載體。

2.2.2 QPCR鑒定重組慢病毒滴度 QPCR分析中從擴(kuò)增曲線和溶解曲線來看，blank組和vector組的OV幾乎沒有擴(kuò)增，而過表達(dá)組的OV基因有顯著擴(kuò)增，證明基因組抽提和QPCR過程無問題。在試驗中，細(xì)胞數(shù)為2×106個/皿，加病毒 50 μL/皿。根據(jù)慢病毒載體上自帶的WPRE基因和對照組HGB基因的溶解曲線和擴(kuò)增曲線較好，通過計算軟件測得慢病毒載體滴度約為1.6×107 IU/mL。

3 討論

慢病毒載體是近幾年發(fā)展起來的基因工程載體，其最大的特點是能夠在體內(nèi)外轉(zhuǎn)染分裂和非分裂的細(xì)胞，是1種具有自我失活功能、無免疫反應(yīng)的高效基因傳遞工具，具有容納外源目的基因片段大、宿主范圍廣、重組機(jī)會低、可將所攜帶的目的基因整合到宿主染色體中并穩(wěn)定長期表達(dá)[16]、隨親本的繁殖將外源基因傳遞給子代發(fā)揮作用等優(yōu)點。本試驗中pLVshRNA-eGFP載體是基于HIV1的慢病毒RNA干擾載體，大小為7.8 kb，包含了生產(chǎn)慢病毒所必須的病毒元件、提高病毒滴度、基因表達(dá)效率的元件，具有載體結(jié)構(gòu)緊湊、包裝效果穩(wěn)定、病毒滴度高等優(yōu)點，并且pLVshRNA-eGFP載體表達(dá)eGFP熒光蛋白，可以方便地觀測病毒感染效率以及用流式熒光分選方法篩選出的陽性細(xì)胞。

本研究不僅成功構(gòu)建鵪鶉輸卵管納豆激酶慢病毒特異表達(dá)載體，并且所構(gòu)建的慢病毒載體將質(zhì)粒上原來的啟動子CMV片段替換成卵清蛋白啟動子（OV） [17]。而卵清蛋白啟動子是特異性啟動子，感染293T細(xì)胞效率低，熒光成像eGFP不表達(dá)，不能直接用于病毒滴度測定。使用較少采用的實時熒光定量PCR（QPCR）技術(shù)測定慢病毒載體滴度，為進(jìn)一步利用慢病毒載體構(gòu)建轉(zhuǎn)基因鵪鶉奠定基礎(chǔ)，同時也為進(jìn)一步研究卵清蛋白啟動子基因的相關(guān)功能提供了優(yōu)質(zhì)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染載體。

參考文獻(xiàn)：

[1]Palmiter R D，Brinster R L，Hammer R E，et al. Dramatic growth of mice that develop from eggs microinjected with metallothionein-growth hormone fusion genes[J]. Nature，1982，300（5893）：611-615.

[2]Clark A J，Burl S，Denning C，et al. Gene targeting in livestock：a preview[J]. Transgenic Research，2000，9（4/5）：263-275.

[3]楊紹清. 雞的基因轉(zhuǎn)移及用于禽蛋生物反應(yīng)器基因元件的制備[D]. 北京：中國科學(xué)院，1999：119-124.

[4]Love J，Gribbin C，Mather C，et al. Transgenic birds by DNA microinjection[J]. Biotechnology，1994，12（1）：60-63.

[5]Borwompinyo S，Brake J，Mozdziak P E，et al. Culture of chicken embryos in surrogate eggshells[J]. Poultry Science，2005，84（9）：1477-1482.

[6]李海昌. 雞胚的體外培養(yǎng)和轉(zhuǎn)基因雞的研究[D]. 北京：北京農(nóng)業(yè)大學(xué)，1995：22-24.

[7]劉鳳軍，莊益芬，張文昌. 鵝胚胎體外培養(yǎng)的研究[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī)，2004（1）：15-17.

[8]Ivarie R. Avian transgenesis：progress towards the promise[J]. Trends in Biotechnology，2003，21（1）：14-19.

[9]Habets G G，Scholtes E H，Zuydgeest D，et al. Identification of an invasion-inducing gene，Tiam-1，that encodes a protein with homology to GDP-GTP exchangers for Rho-like proteins[J]. Cell，1994，77（4）：537-549.

[10]于莉娜，張慶玲，李 新，等. Tiam1基因慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建及其在HT29細(xì)胞中的表達(dá)[J]. 實用醫(yī)學(xué)雜志，2010，26（16）：2895-2898.

[11]Lee S H，Kunz J，Lin S H，et al. 16-kDa prolactin inhibits endothelial cell migration by down-regulating the Ras-Tiam1-Rac1-Pak1 signaling pathway[J]. Cancer Research，2007，67（22）：11045-11053.

[12]Valori C F，Ning K，Wyles M，et al. Development and applications of non-HIV-based lentiviral vectors in neurological disorders[J]. Current Gene Therapy，2008，8（6）：406-418.

[13]Shagin D A，Barsova E V，Yanushevich Y G，et al. GFP-like proteins as ubiquitous metazoan superfamily：evolution of functional features and structural complexity[J]. Molecular Biology and Evolution，2004，21（5）：841-850.

[14]王耀輝，王明麗，陳九格，等. 靶向TIPE2基因的shRNA慢病毒載體構(gòu)建及病毒包裝[J]. 河南大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2014，33（2）：120-122，134.

[15]黃學(xué)蘭，徐廣賢，賈 偉，等. 小鼠miRNA-203慢病毒過表達(dá)載體的構(gòu)建及病毒包裝與滴度測定[J]. 寧夏醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2011，33（7）：605-608.

[16]Nishitsuji H，Ikeda T，Miyoshi H，et al. Expression of small hairpin RNA by lentivirus-based vector confers efficient and stable gene-suppression of HIV-1 on human cells including primary non-dividing cells[J]. Microbes and Infection/Institut Pasteur，2004，6（1）：76-85.

[17]Moffat J，Sabatini D M. Building mammalian signalling pathways with RNAi screens[J]. Nature Reviews Molecular Cell Biology，2006，7（3）：177-187.