賈彥彥+汝梅+金偉波+梁宗鎖

[摘要]蔗糖非酵解型蛋白激酶家族2（SnRK2）在逆境植物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起著重要作用。該研究根據(jù)丹參轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)從丹參cDNA中克隆得到一個(gè)SnRK2家族基因，命名為SmSnRK24，屬于Ⅰ類SnRK2。SmSnRK24基因包含8個(gè)內(nèi)含子，9個(gè)外顯子，其開放閱讀框1 068 bp，編碼355個(gè)氨基酸，推測(cè)其蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為4063 kDa，將其構(gòu)建到原核表達(dá)載體pMALc2X上，原核誘導(dǎo)表達(dá)出與預(yù)測(cè)蛋白大小一致的目的蛋白。依據(jù)丹參基因組序列，PlantCARE分析SmSnRK24起始密碼子ATG上游3 000 bp的啟動(dòng)子系列，結(jié)果顯示該序列包含Ibox，GAmotif，HSE，LTR，TCrich repeats等逆境脅迫響應(yīng)元件，以及GAREmotif，Pbox，ABRE，CGTCAmotif等激素響應(yīng)元件。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析表明SmSnRK24在丹參根中的含量較高，在莖中和葉中含量相當(dāng)，ABA和PEG脅迫響應(yīng)分析表明，SmSnRK24對(duì)PEG滲透脅迫響應(yīng)顯著，對(duì)ABA脅迫響應(yīng)微弱。該研究為進(jìn)一步探討SmSnRK24基因在丹參干旱脅迫下次生代謝產(chǎn)物積累機(jī)制中的作用奠定了基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞]丹參； SmSnRK24； 原核表達(dá)； 啟動(dòng)子； 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

Cloning and expression analysis of protein kinase

SmSnRK24 from Salvia miltiorrhiza

JIA Yanyan1， RU Mei2， JIN Weibo3， LIANG Zongsuo1，3*

（1 College of Life Science， Northwest Agriculture and Forestry University， Yangling 712100， China；

2 Institute of Soil and Water Conservation， Chinese Academy of Sciences and the Ministry of Water Resources， Yangling 712100， China；

3 College of Life Science， Zhejiang SciTech University， Hangzhou 310018， China）

[Abstract]Sucrose nonfermenting 1related protein kinase 2（SnRK2） plays a key role in abiotic stress signaling in plants In this study， we cloned a SmSnRK24 gene belonging to subclass I of SnRK2 from Salvia miltiorrhiza by screening its transcriptome database The SmSnRK24 gene contains 8 introns and 9 exons， with a 1 068 bp open reading frame encoding a polypeptide of 355 amino acids， the predicted molecular mass of which is 4063 kDa Prokaryotic expression of SmSnRK24 protein using pMALc2X as the expression vector displayed that the recombinant protein of SmSnRK24 gene in E coli was consistent with the predicted size A 3 000 bp promoter sequence of SmSnRK24 contained some stressresponsive elements and hormoneresponsive elements Quantitative realtime PCR analysis revealed that the expression of SmSnRK24 in root was much higher than that in stem and leaf， SmSnRK24 was strongly induced by PEG stress， weakly induced by ABA stress This research provided a basis for further study of the SmSnRK24 gene playing the role in accumulate mechanism of secondary metabolites in S miltiorrhiza under drought

[Key words]Salvia miltiorrhiza； SmSnRK24； prokaryotic expression； promoter； quantitative realtime PCR

丹參，為唇形科鼠尾草屬多年生草本植物，是傳統(tǒng)大宗藥材之一，主要活性成分為水溶性酚酸類化合物和脂溶性丹參酮類。丹參基原植物具有生命力強(qiáng)、世代周期短、組織培養(yǎng)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)成熟、基因組小、染色體數(shù)目少等特點(diǎn)，并且隨著丹參轉(zhuǎn)錄組信息、全基因組信息的逐步豐富，丹參已被認(rèn)定為中藥研究的理想模式植物[12]。

目前，干旱脅迫成為影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的最嚴(yán)重因子之一，植物在干旱脅迫的環(huán)境中會(huì)改變細(xì)胞內(nèi)次生代謝產(chǎn)物的積累[3]。丹參是干旱敏感種，在干旱脅迫下通過(guò)酚酸類物質(zhì)積累抵御干旱氧化脅迫[4]。中度干旱脅迫顯著促進(jìn)丹參活性成分的積累已得到研究者們的一致認(rèn)同[59]，在此基礎(chǔ)上，劉曉蕾?gòu)拇x途徑著手，初步研究了中度脅迫下顯著提高丹參葉片總酚酸含量積累的機(jī)制，即在干旱條件下通過(guò)啟動(dòng)水溶性代謝途徑關(guān)鍵酶的活性從而調(diào)控酚酸類物質(zhì)的積累[10]。

諸多研究表明，在面對(duì)干旱脅迫時(shí)，植物體內(nèi)ABA的快速積累對(duì)植物響應(yīng)干旱脅迫起著重要的作用[11]。SnRK2家族作為ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中重要成員，已在擬南芥、玉米、水稻、蘋果、馬鈴薯和草莓等物種中得到克隆和功能分析研究[1217]。然而，當(dāng)前有關(guān)SnRK2s在藥用植物上的研究幾乎空白，限制了其在提高逆境下藥用植物次生代謝含量方面的應(yīng)用。

通過(guò)對(duì)丹參SnRK2家族成員之一SmSnRK24的分析，將有助于通過(guò)基因工程手段提高干旱脅迫下丹參有效成分的含量。聚乙二醇6000（PEG6000）是一種親水性很強(qiáng)的大分子聚合物，其自身不能通過(guò)植物細(xì)胞壁而滲入活細(xì)胞內(nèi)，且無(wú)毒性，但能使細(xì)胞緩慢吸水，利用聚乙二醇作為誘導(dǎo)劑模擬干旱條件具有簡(jiǎn)單快速、周期短、重復(fù)性好等特點(diǎn)，因此，近年來(lái)常被廣泛用于植物的耐旱性分析[1819]。研究表明，PEG能模擬干旱脅迫的原因是其可阻塞植物的輸導(dǎo)組織，且其模擬干旱脅迫與土壤控水的結(jié)果相同[2022]，當(dāng)15%≤PEG≤25%時(shí)即可模擬中度干旱脅迫[2324]。

本研究首次以藥用模式植物丹參為材料，對(duì)SmSnRK24基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，原核表達(dá)分析，啟動(dòng)子分析和組織特異性分析，同時(shí)也分析了在ABA處理和PEG模擬中度干旱脅迫下SmSnRK24基因的響應(yīng)情況，旨在為深入研究丹參SmSnRK24基因功能奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為了解丹參中ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑提供科學(xué)積累。

1材料

11植物將丹參種子播種于穴盤中，組培間培養(yǎng)，種子萌發(fā)并長(zhǎng)出一對(duì)真葉后移栽至營(yíng)養(yǎng)缽中，每個(gè)營(yíng)養(yǎng)缽3棵幼苗，培養(yǎng)至60 d時(shí)用于各種分析。組織特異性分析：分別取60 d齡丹參幼苗的根、莖和葉于液氮中迅速冷凍，置于-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆?。ABA處理和PEG處理：分別用100 μmol·L-1 ABA和20% PEG溶液噴灑并澆灌丹參苗，樣品分別于處理后0，05，1，3，6，9，12，24 h進(jìn)行收集，以對(duì)應(yīng)條件下的H2O處理作為對(duì)照，材料收集后液氮速凍，置于-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

12菌種及載體pMALc2X購(gòu)于NEB有限公司，大腸桿菌DH5α感受態(tài)購(gòu)于康為世紀(jì)生物科技有限公司，T載體（pEASYBlunt Simple Cloning Kit）購(gòu)自全式金生物技術(shù)有限公司，宿主菌Rosetta本實(shí)驗(yàn)室保存。

13工具酶及主要試劑pfu DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、限制性核酸內(nèi)切酶購(gòu)于Thermo公司，RNAprep Pure植物總RNA提取試劑盒（DP432）購(gòu)于北京天根生化科技有限公司，相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)200 bp Ladder、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒均購(gòu)于TaKaRa有限公司，DNA回收純化試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒均購(gòu)自O(shè)MEGA公司，預(yù)染蛋白Marker購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司，PCR引物均由北京奧科技術(shù)有限公司合成。

2方法

21總RNA提取及DNA提取參照RNAprep Pure植物總RNA提取試劑盒的使用說(shuō)明書進(jìn)行丹參植物根、莖、葉以及對(duì)照和處理材料總RNA的提取，用10%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，并利用核酸濃度檢測(cè)儀測(cè)定獲得RNA的濃度及純度。RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA依據(jù)TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作步驟進(jìn)行。DNA提取采用改良的CTAB法。

22SmSnRK24基因cDNA的克隆和基因組序列的獲得以擬南芥SnRK2基因家族保守序列為參考，從丹參轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中Blast丹參SnRK2s基因，篩選出的其中1條SnRK2基因長(zhǎng)1 846 bp，用Primer Premier 50軟件設(shè)計(jì)基因特異性引物。上游引物：5′GATACACAAACCCACTCTGCACTAC3′，下游引物：5′CAAGAAAATACAGAAGTTCTCATC3′，分別以反轉(zhuǎn)錄的cDNA和DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。在25 μL擴(kuò)增體系中含無(wú)RNA酶水172 μL，dNTP Mixture（25 mmol·L-1） 2 μL，10×Pfu buffer 25 μL（含MgSO4），引物（10 μmol·L-1）各1 μL，模板1 μL，Pfu DNA Polymerase 03 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 5 min，33個(gè)循環(huán)；最后72 ℃再延伸8 min。PCR擴(kuò)增出的特異片段回收、連接至pEASYBlunt Simple載體中，25 ℃連接15 min后，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)中，涂布在加氨芐青霉素（終濃度為100 mg·L-1）的LB平板上，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。挑取生長(zhǎng)良好的單克隆于加氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中活化，菌液PCR驗(yàn)證，選擇陽(yáng)性菌液送上海立菲生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，獲得SmSnRK24pEASY重組質(zhì)粒。

賈彥彥等：丹參蛋白激酶SmSnRK24的克隆及表達(dá)分析23SmSnRK24基因的生物信息學(xué)分析將測(cè)序所得的cDNA序列通過(guò)NCBI在線比對(duì)（https：//blastncbinlmnihgov/Blastcgi），找出與其同源性較高的其他物種的氨基酸序列，然后用DNAMAN軟件進(jìn)行同源性比較；從NCBI網(wǎng)站下載模式植物擬南芥和雙子葉植物蘋果的SnRK2家族成員氨基酸序列，應(yīng)用MEGA606使用NJ法（bootstrap 1000）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹；利用NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorfhtml）中的ORFfinder和GENSCAN在線軟件（http：//genes.mit.edu/GENSCANhtml）分析其ORF序列；利用GSDS20在線軟件（http：//gsds.cbi.pkueducn/）分析基因的內(nèi)含子和外顯子序列；利用Expasy工具（http：//web.expasy.org/protparam/）進(jìn)行氨基酸殘基數(shù)目、組成、蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)和親、疏水性的在線分析；利用Expasy工具中的SOPMA軟件（https：//npsaprabiibcpfr/cgibin/npsa_automatpl？page=/NPSA/npsa_sopmahtml）在線預(yù)測(cè)分析α螺旋、β折疊和無(wú)規(guī)則卷曲；利用Expasy工具中的SWISSMODEL（http：//swissmodelexpasyorg/）進(jìn)行蛋白的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；利用NetPhos 20 Server（http：//wwwcbsdtudk/services/NetPhos/）對(duì)SmSnRK24蛋白進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)分析。

24SmSnRK24蛋白原核表達(dá)根據(jù)SmSnRK24基因的ORF序列，設(shè)計(jì)上游引物F：5′CGCGGATCCATGGAGAAATAC3′（下劃線處為保護(hù)堿基和BamHⅠ酶切位點(diǎn)），下游引物R：5′GACGTCGACCTAAGTGATACG3′（下劃線處為保護(hù)堿基和SalⅠ酶切位點(diǎn)），以上述重組質(zhì)粒SmSnRK24pEASY為模板進(jìn)行擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物連接到表達(dá)載體pMALc2X的BamHⅠ和SalⅠ酶切位點(diǎn)處，獲得重組質(zhì)粒SmSnRK24pMAL，將鑒定和測(cè)序正確的重組質(zhì)粒和空的表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Rosetta中，挑取重組菌的單菌落接種至含有氨芐霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，然后按照1∶100稀釋到含有抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，當(dāng)A600達(dá)到06～08的時(shí)候分別加入01，03，05，07，09 mmol·L-1 IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，22 ℃誘導(dǎo)16 h。取誘導(dǎo)后菌液1 mL，4 000 r·min-1離心10 min，收集菌體，棄上清，用PBS重懸沉淀，取20 μL重懸液加入5 μL的 5×蛋白loading buffer，沸水浴5 min，SDSPAGE進(jìn)行分析。

25SmSnRK24基因啟動(dòng)子分析SmSnRK24基因的5′側(cè)翼序列根據(jù)丹參基因組序列分析所得。轉(zhuǎn)錄應(yīng)答元件的分析采用PlantCARE database （http：//bioinformaticspsbugentbe/webtools/plantcare /html/）進(jìn)行。

26SmSnRK24基因表達(dá)分析利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)SmSnRK24在丹參不同器官及不同脅迫處理?xiàng)l件下的表達(dá)進(jìn)行分析。所使用的定量引物序列為F： 5′TTGCCAACTCTTCTAGGAGAAT3′，R： 5′GGTTCTCTTTGCGGTAATACAC3′。PCR的反應(yīng)體系如下：125 μL SYBR Premix Ex Taq酶，上下游引物（10 μmol·L-1）各2 μL，cDNA模板（150 mg·L-1）2 μL，加水補(bǔ)足至25 μL，3個(gè)平行重復(fù)。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，58 ℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)。溶解曲線程序：從65 ℃以每5 s 05 ℃的速度升至95 ℃。以植物的管家基因之一βactin基因作為內(nèi)參，利用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。所有處理均設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR數(shù)據(jù)利用CFX Manager（BioRad，USA）處理分析，利用SPSS軟件（Version 160）進(jìn)行顯著性分析。

3結(jié)果與分析

31SmSnRK24基因全長(zhǎng)cDNA和基因組DNA序列的獲得根據(jù)擬南芥的10個(gè)SnRK2家族成員的保守序列，利用本地Blast檢索程序，從丹參轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中Blast丹參SnRK2s基因，搜索出的其中1條SnRK2基因序列長(zhǎng)1 846 bp，將其通過(guò)NCBI的blastX比對(duì)，確定其為SnRK2家族成員，命名為SmSnRK24，根據(jù)該序列設(shè)計(jì)特異引物，以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出與目的大小一致的單一特異條帶，見圖1A。將其回收、克隆送去測(cè)序，分析測(cè)序結(jié)果，與目的序列完全吻合，無(wú)堿基缺失或替換情況。為了分析其基因組序列信息，以丹參DNA為模板，用上述特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出大小在3 000 bp左右的單一特異條帶，回收、克隆測(cè)序，測(cè)序結(jié)果分析顯示：該特異條帶大小為3 136 bp，見圖1B。

32SmSnRK24基因的生物信息學(xué)分析結(jié)合ORFfinder和GENSCAN在線軟件分析，確定1 846 bp 的SmSnRK24 cDNA序列中包含開放閱讀框（ORF）1 068 bp，位于序列的483～1 550 bp位置，將ORF序列與獲得的DNA序列比對(duì)，查找DNA序列中的內(nèi)含子，結(jié)果顯示：SmSnRK24含有8個(gè)內(nèi)含子，9個(gè)外顯子，剪切位點(diǎn)符合GU/AG規(guī)則，內(nèi)含子和外顯子的分布情況見圖2。SmSnRK24基因編碼355個(gè)氨基酸，將其氨基酸序列通過(guò)NCBI Blastp 比對(duì)表明，與其他物種的SnRK2相似度較高，見圖3。與唇形目芝麻Sesamum indicum、鼠李目葡萄Vitis vinifera、茄目甜辣椒Capsicum annuum、茄目煙草Nicotiana tabacum的SnRK2基因氨基酸序列相似度分別達(dá)到91%，90%，93%，92%，說(shuō)明SnRK2基因家族的保守性很強(qiáng)。通過(guò)與擬南芥SnRK2家族的10個(gè)基因和蘋果SnRK2家族的10個(gè)基因的氨基酸聚類分析發(fā)現(xiàn)，SmSnRK24屬于SnRK2家族第Ⅰ亞家族，見圖4。

利用Expasy工具分析顯示，SmSnRK24編碼蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為40637 kDa，等電點(diǎn)為585，平均親水系數(shù)（GRAVY）為-0533，二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，SmSnRK24的二級(jí)結(jié)構(gòu)中α螺旋占4225%，

β轉(zhuǎn)角占817%，無(wú)規(guī)則卷曲占3127%，延伸鏈占1831%；三維結(jié)果預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，SmSnRK24預(yù)測(cè)編碼蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果相符合；NetPhos 20 Server分析結(jié)果表明，SmSnRK24有9個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)，3個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)，6個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)。

33SmSnRK24蛋白原核表達(dá)SmSnRK24的ORF片段與表達(dá)載體pMALc2X的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α中，進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，將經(jīng)鑒定后的陽(yáng)性克隆提取重組質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切鑒定，將菌液PCR和酶切鑒定均為陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒送測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示基因序列正確插入表達(dá)載體pMALc2X中。

將重組質(zhì)粒和空載體pMALc2X分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌Rosetta中，加入不同濃度的IPTG誘導(dǎo)后，收集菌體，PBS重懸，加蛋白上樣緩沖液煮沸，經(jīng)12% SDSPAGE電泳分析，含有重組質(zhì)粒的菌體經(jīng)IPTG誘導(dǎo)出目的條帶，見圖5中方框所示。表明重組質(zhì)粒在大腸桿菌中成功表達(dá)，此外，從圖中可以看出在IPTG濃度為05，07，09 mmol·L-1時(shí)，蛋白誘導(dǎo)量相對(duì)較多。

34SmSnRK24啟動(dòng)子分析利用PlantCARE Database對(duì)約為30 kb的丹參SnRK24基因5′側(cè)翼序列進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，該啟動(dòng)子序列中含有包含Ibox，GAmotif，HSE，LTR，TCrich repeats等逆境脅迫響應(yīng)元件，以及GAREmotif，Pbox，ABRE，

CGTCAmotif等激素響應(yīng)元件。部分響應(yīng)元件見表1，推測(cè)該基因的表達(dá)可能受到上述各因素的調(diào)控。

35SmSnRK24的表達(dá)分析在丹參不同部位中的表達(dá)：以移栽培養(yǎng)60 d的丹參幼苗為材料，

M預(yù)染蛋白marker； 1空pMALC2X未誘導(dǎo)蛋白樣； 2空pMALC2X誘導(dǎo)蛋白樣； 3融合蛋白未誘導(dǎo)蛋白樣； 4融合蛋白01 mmol·L-1 IPTG誘導(dǎo)蛋白樣； 5融合蛋白03 mmol·L-1 IPTG誘導(dǎo)蛋白樣； 6融合蛋白05 mmol·L-1 IPTG誘導(dǎo)蛋白樣； 7融合蛋白07 mmol·L-1 IPTG誘導(dǎo)蛋白樣； 8融合蛋白09 mmol·L-1 IPTG誘導(dǎo)蛋白樣。

以丹參管家基因之一βactin為內(nèi)參，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析SmSnRK24基因在丹參根、莖、葉中的表達(dá)，把莖中目的基因的表達(dá)量設(shè)為1，測(cè)定根

元件名稱功能ABRE參與ABA響應(yīng)的順式作用元件AuxRRcore參與生長(zhǎng)素響應(yīng)的順式作用元件CAATbox真核生物常有的增強(qiáng)調(diào)節(jié)區(qū)CGTCAmotif參與茉莉酸甲酯響應(yīng)的順式作用元件Gbox/Ibox參與光響應(yīng)的順式調(diào)節(jié)元件HSE參與熱脅迫的順式作用元件MBS參與干旱誘導(dǎo)的MYB結(jié)合位點(diǎn)TATAbox位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游約-30 bp處，真核生物啟動(dòng)子基本元件TCrich repeats脅迫反應(yīng)相關(guān)響應(yīng)元件GAREmotif/Pbox赤霉素響應(yīng)元件LTR低溫響應(yīng)作用元件TCAelemen水楊酸響應(yīng)作用元件

和葉中目的基因相對(duì)于莖的表達(dá)量。結(jié)果顯示，基因在所有檢測(cè)部位中均有表達(dá)，在根中的表達(dá)量最高，在莖中和葉中的表達(dá)量幾乎相同，見圖6。

ABA和PEG脅迫處理下的表達(dá)：以移栽培養(yǎng)60 d的丹參幼苗為材料，進(jìn)行PEG和ABA處理，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)不同處理?xiàng)l件下目標(biāo)基因的表達(dá)情況進(jìn)行分析。該基因?qū)EG脅迫響應(yīng)顯著，快速響應(yīng)PEG誘導(dǎo)，在05 h時(shí)達(dá)到高峰，經(jīng)過(guò)1 h時(shí)的迅速下降后，3 h 時(shí)又恢復(fù)高峰，之后開始逐漸降低，在12 h時(shí)降到最低表達(dá)水平后，24 h上升達(dá)到最高峰；ABA對(duì)該基因的誘導(dǎo)效果甚微，基因的轉(zhuǎn)錄水平僅在9 h時(shí)出現(xiàn)顯著升高，在05，1，6 h時(shí)出現(xiàn)了不同程度的下調(diào)，在3，12，24 h時(shí)則不受ABA誘導(dǎo)，見圖7。

4討論

SnRK2是植物體特有的一類Ser/Thr類蛋白激酶，研究表明，SnRK2家族成員在ABA信號(hào)轉(zhuǎn)錄途徑和抗?jié)B透脅迫中扮演著重要的角色。針對(duì)SnRK2家族成員對(duì)干旱和ABA脅迫響應(yīng)的情況，相關(guān)研究表明：在擬南芥SnRK2家族的10個(gè)成員當(dāng)中，9個(gè)能夠被高滲脅迫所激活，其中只有5個(gè)能夠被ABA所誘導(dǎo)[12]；在玉米11個(gè)SnRK2家族成員中5個(gè)受ABA激活[14]；在水稻10個(gè)SnRK2成員，所有的家族成員都受高滲脅迫的誘導(dǎo)，其中有3個(gè)成員受ABA的誘導(dǎo)[13]；小麥中TaSnRK23/24/28對(duì)外源ABA和干旱脅迫具有不同程度的響應(yīng)[2527]；馬鈴薯中8個(gè)SnRK2基因均受PEG誘導(dǎo)表達(dá)，而外源ABA只能誘導(dǎo)StSnRK23基因的表達(dá)[16]。從系譜發(fā)生的分析中，SnRK2基因家族被分為3個(gè)亞家族，分別為groupⅠ，groupⅡ，groupⅢ，研究表明，groupⅠ不受ABA的激活，groupⅡ?qū)BA具有微弱的響應(yīng)或不響應(yīng)，而groupⅢ受ABA的強(qiáng)烈激活，所有的基因除AtSnRK29外，均受高滲脅迫的誘導(dǎo)[1213，28]。

目前，對(duì)SnRK2家族成員的功能在模式植物和一些大田作物中已得到了較為充分的闡述，然而，在藥用植物中的研究還相對(duì)較少，作為藥用模式植物丹參，隨著其轉(zhuǎn)錄組和基因組信息的豐富，為研究目標(biāo)基因提供了極大的便利。

本研究首次從丹參轉(zhuǎn)錄組中篩選得到了丹參的SnRK2家族成員之一SmSnRK24基因，對(duì)其基因特性和空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，并構(gòu)建了該基因的原核表達(dá)載體，成功地在大腸桿菌中表達(dá)，這為后續(xù)SmSnRK24的功能研究奠定了基礎(chǔ)。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)其在PEG模擬的干旱脅迫和ABA脅迫下的表達(dá)水平，結(jié)果顯示：SmSnRK24基因受PEG和ABA的誘導(dǎo)，這與啟動(dòng)子作用元件的預(yù)測(cè)結(jié)果相一致，其對(duì)PEG脅迫的響應(yīng)較為迅速且強(qiáng)烈，呈現(xiàn)波浪形趨勢(shì)，這與TaSnRK23/24/28和NtSnRK28基因在PEG脅迫下的表達(dá)趨勢(shì)基本相似，這可能是由SnRK2s家族基因?qū)δ婢趁{迫的響應(yīng)機(jī)制所決定，詳細(xì)機(jī)理的闡述還有待進(jìn)一步研究[2527，29]。其對(duì)ABA脅迫的響應(yīng)微弱，結(jié)合對(duì)SmSnRK24基因磷酸化位點(diǎn)分析結(jié)果，推測(cè)該基因可能通過(guò)磷酸化修飾后參與植物抗逆途徑，屬于ABA非依賴型。

適當(dāng)干旱脅迫有助于提高丹參有效成分的含量，而在抗?jié)B透脅迫中扮演著重要的角色的SmSnRK24是如何調(diào)節(jié)丹參有效成分的含量，其通過(guò)何種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來(lái)調(diào)節(jié)丹參有效成分含量，這都是后續(xù)要努力的方向，本研究為后續(xù)研究提供了科學(xué)的理論依據(jù)。

[參考文獻(xiàn)]

[1]王慶浩，陳愛華，張伯禮 丹參：一種中藥研究的模式生物[J] 中醫(yī)藥學(xué)報(bào)， 2009（37）：1

[2]宋經(jīng)元，羅紅梅，李春芳，等 丹參藥用模式植物研究探討[J] 藥學(xué)學(xué)報(bào)， 2013， 48（7）： 1099

[3]盛東峰，陳龍 聚乙二醇6000脅迫對(duì)丹參毛狀根中丹參酮積累的影響[J] 中草藥， 2013， 44（9）：1181

[4]Bettaieb I， HamrouniSellami I， Bourgou S， et al Drought effects on polyphenol composition and antioxidant activities in aerial parts of Salvia officinalis L[J] Acta Physiol Plant， 2011， 33（4）：1103

[5]劉景玲 UVB輻射和干旱對(duì)丹參生物量及酚酸類成分含量的影響[D] 楊凌： 西北農(nóng)林科技大學(xué)， 2014

[6]左小容 干旱對(duì)丹參的生長(zhǎng)及有效成分積累的影響[D] 楊凌： 西北農(nóng)林科技大學(xué)， 2011

[7]劉大會(huì)， 郭蘭萍， 黃璐琦， 等 土壤水分含量對(duì)丹參幼苗生長(zhǎng)及有效成分的影響[J] 中國(guó)中藥雜志， 2011， 36（3）：321

[8]韓立敏， 俞嘉寧， 魏新麗， 等 干旱、鹽脅迫處理對(duì)丹參無(wú)菌苗中丹參素含量的影響[J]中國(guó)中藥雜志， 2008， 33（10）：1211

[9]高揚(yáng) 不同土壤水分對(duì)丹參耗水特性及有效成分含量的影響[D] 楊凌： 西北農(nóng)林科技大學(xué)， 2004

[10]劉曉蕾 干旱下丹參酚酸類化合物積累機(jī)制及其抗寒性研究[D] 楊凌： 西北農(nóng)林科技大學(xué)， 2011

[11]Fujita Y， Fujita M， Shinozaki K， et al ABAmediated transcriptional regulation inresponse to osmotic stress in plants[J] J Plant Res， 2011， 124：509

[12]Boudsocq M， BarbierBrygoo H， Lauriere C Identification of nine sucrose non fermenting 1related protein kinases 2 activated by hyperosmotic and saline stresses in Arabidopsis thaliana[J] J Biol Chem， 2004， 279（40）：41758

[13]Kobayashi Y， Yamamoto S， Minami H，et al Differential activation of the rice sucrose non fermenting1related protein kinase2 family by hyperosmotic stress and abscisic acid[J] Plant Cell， 2004， 16（5）：1163

[14]Huai J L， Wang M， He J G， et al Cloning and characterization of the SnRK2 gene family from Zea mays[J] Plant Cell Rep， 2008， 28：1861

[15]陳娜娜， 劉金義， 蔡斌， 等 蘋果SnRK2基因家族的鑒定和生物信息學(xué)分析[J] 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)， 2013， 29（13）：120

[16]毛娟 馬鈴薯抗逆相關(guān)基因SnRK2家族的克隆與功能分析[D] 蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2014

[17]Han Y， Dang R H， Li J X， et al Sucrose nonfermenting1related protein kinase26， an ortholog of open stomata1， is a negative regulator of strawberry fruit development and ripening[J] Plant Physiol， 2015， 167（3）：915

[18]梁國(guó)玲， 周青平， 顏紅波 聚乙二醇對(duì)羊茅屬4種植物種子萌發(fā)特性的影響研究[J] 草業(yè)科學(xué)， 2007， 24（6）：50

[19]楊柳， 周瑞陽(yáng)， 金聲楊 PEG模擬干旱脅迫對(duì)11份黃麻種子萌發(fā)的效應(yīng)[J] 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2011， 42（7）：715

[20]Rawlor D W Absorption of polyethylene glycol by plants and their effects on plant growth[J] New Phytol， 1970， 69：501

[21]Kaufmann M R， Eckard A N Evaluation of water stress control with polyethylene glycol by analysis of guttation[J] Plant Physiol， 1971， 47：453

[22]劉曉東， 李洋洋， 何淼 PEG模擬干旱脅迫對(duì)玉帶草生理特性的影響[J] 草業(yè)科學(xué)， 2012， 29（5）：687

[23]劉丹， 王雪， 楊毅， 等 PEG脅迫對(duì)萌動(dòng)苦豆子子葉抗旱生理及氧化苦參堿含量的影響[J] 干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究， 2016， 34（3）：166

[24]陳郡雯， 吳衛(wèi)， 鄭有良， 等 聚乙二醇（PEG6000）模擬干旱條件下白芷苗期抗旱性研究[J] 中國(guó)中藥雜志， 2010， 35（2）：149

[25]Tian S J， Mao X G， Zhang H Y， et al Cloning and characterization of TaSnRK23， a novel SnRK2 gene in common wheat[J] J Exp Bot， 2013， 64（7）：2063

[26]Mao X G， Zhang H Y， Tian S J， et al TaSnRK24， an SNF1type serine/threonine protein kinase of wheat（Triticum aestivum L）， confers enhanced multistress tolerance in Arabidopsis[J] J Exp Bot， 2010， 61：683

[27]Zhang H Y， Mao X G， Wang C S， et al Overexpression of a common wheat gene TaSnRK28 enhances tolerance to drought， salt and low temperature in Arabidopsis[J] PLoS ONE， 2010， 5：e16041

[28]Kulik A， Wawer I， Krzywińska E， et al SnRK2 protein kinaseskey regulators of plant response to abiotic stresses[J] OMICS， 2011， 15（12）：859

[29]Zhang H Y， Jia H F， Liu G S， et al Cloning and characterization of NtSnRK27 and NtSnRK28 genes involved in abiotic stress responses from Nicotiana tabacum[J] Acta Physiol Plant， 2014， 36： 1673

[責(zé)任編輯呂冬梅]

[收稿日期]20160709

[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81373908）；浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（LZ16H280001）；科技部“十二五”科技支撐項(xiàng)目（2015BAC01B03）

[通信作者]梁宗鎖，Email：liangzs@msiswcaccn

[作者簡(jiǎn)介]賈彥彥，博士研究生，主要從事藥用植物次生代謝分子調(diào)控機(jī)理研究，Email：xiyanaidi@163com