李鳳麗，李茂山，何 麗，羅 方，康志強(qiáng)

(1.鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院內(nèi)分泌科，河南 鄭州 450007； 2.河南省直第三人民醫(yī)院骨科，河南 鄭州 450006)

隨著生活水平的提高，我國(guó)居民高能量食物的攝入不斷增加，機(jī)體攝入的過(guò)剩糖類、脂質(zhì)等轉(zhuǎn)化為脂類物質(zhì)過(guò)量積累，導(dǎo)致肥胖發(fā)生率越來(lái)越高，進(jìn)而引起代謝性疾病的發(fā)生，如糖尿病、高血壓、脂肪肝和冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病等，嚴(yán)重威脅人類健康[1-2]。Adropin是由能量平衡基因(energy homeostasis associated gene，Enho)編碼的分泌性蛋白，在不同種屬間具有高度同源性，其主要表達(dá)于胰腺、肝臟、腎臟、冠狀動(dòng)脈、臍動(dòng)脈和腦組織等[3]。研究顯示，Adropin可抑制脂類生成及肝臟中脂肪的合成，可能是影響機(jī)體肥胖的重要因素之一[4]。Adropin不僅具有調(diào)節(jié)脂類代謝、改善胰島素抵抗的作用，同時(shí)，還能通過(guò)調(diào)節(jié)葡萄糖介導(dǎo)的胰島素釋放而調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)和碳水化合物的代謝[5-7]。研究發(fā)現(xiàn)，脂類可以參與細(xì)胞自噬，而自噬可調(diào)控脂質(zhì)代謝，糾正肥胖導(dǎo)致的代謝紊亂，進(jìn)而治療肥胖[8-9]，因此，Adropin可能通過(guò)調(diào)控自噬治療肥胖。但目前Adropin對(duì)脂肪細(xì)胞自噬的影響尚不明確。磷脂酰肌醇-3激酶/絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶(phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B，PI3K/AKT)通路參與介導(dǎo)細(xì)胞自噬，miR-138可通過(guò)靶向抑制人黑色素瘤A2058細(xì)胞中3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1(3-phosphoinositide-dependent protein kinase-1，PDK1)蛋白的表達(dá)而抑制PI3K/AKT/雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信號(hào)通路，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞自噬，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；Adropin可通過(guò)下調(diào)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular signal regulated kinase 1 and 2，Erk1/2)表達(dá)及上調(diào)PI3K/AKT通路而抑制人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的遷移和增殖[10-11]；因此考慮，Adropin可能通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/AKT通路而介導(dǎo)脂肪細(xì)胞自噬。本研究以Adropin處理成熟脂肪細(xì)胞，旨在探討其對(duì)脂肪細(xì)胞自噬及PI3K/AKT通路的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞小鼠胚胎成纖維前脂肪細(xì)胞株3T3-L1(前體脂肪細(xì)胞)購(gòu)自上海酶研生物科技有限公司，保存于鄭州市自身免疫性內(nèi)分泌疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 主要試劑與儀器Adropin購(gòu)自美國(guó)Selleck公司，西羅莫司購(gòu)自美國(guó)MedChemexpress公司，異丁基-甲基-黃嘌呤、4＇,6-二脒基-2-苯基吲哚(4＇,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司，地塞米松、油紅O購(gòu)自上海恒斐生物科技有限公司，胰島素購(gòu)自上海研卉生物科技有限公司，達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle′s medium，DMEM)、胎牛血清、胰蛋白酶、青鏈霉素購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，細(xì)胞自噬染色檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京雷根生物技術(shù)有限公司，抗微管相關(guān)蛋白輕鏈3(anti-microtubule-associated protein 1 light chain3，Anti-LC3)、Anti-Beclin1、Anti-P62、Anti-PI3K、抗磷酸化PI3K(anti-phosphorylated-PI3K，Anti-p-PI3K)、Anti-AKT、抗磷酸化AKT(anti-phosphorylated-AKT，Anti-p-AKT)、Anti-GAPDH、Alexa Fluor 488標(biāo)記的羊抗兔二抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)試劑盒、蛋白裂解液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，單丹磺酰尸胺(monodansylcadaverine，MDC)染色試劑盒購(gòu)自北京雷根生物技術(shù)有限公司；Olympus CKX41顯微鏡、CKX53倒置相差顯微鏡、BX63自動(dòng)熒光顯微鏡購(gòu)自日本Olympus 公司，Centrifuge 5424R低溫高速離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司，1659001蛋白電泳儀、Trans-Blot SD半干轉(zhuǎn)膜儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 培養(yǎng)基配置500 mL高糖DMEM中加入體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清50 mL、100×103U·L-1青鏈霉素5 mL，震蕩混勻后即為完全培養(yǎng)基；向500 mL完全培養(yǎng)基中加入0.25 mmol異丁基-甲基-黃嘌呤、5 μmol 地塞米松、5 μg胰島素,即為誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基A；向500 mL完全培養(yǎng)基中加入5 μg胰島素即為誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基B。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化及分組取原裝細(xì)胞瓶中保存的3T3-L1細(xì)胞，接種于含有5 mL完全培養(yǎng)基的25 cm2培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 d換完全培養(yǎng)基1次，待細(xì)胞在瓶底鋪至70%～80%時(shí)，用胰蛋白酶消化，然后接種于24孔板中，待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)孔，參照文獻(xiàn)[12]方法進(jìn)行誘導(dǎo)分化：將24孔板中的完全培養(yǎng)基更換為誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基A，培養(yǎng)48 h后更換為誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基B，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，棄去誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基B，更換為完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)10 d，每 2 d 更換1次，誘導(dǎo)分化結(jié)束后棄去培養(yǎng)基，采用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solation，PBS)沖洗3次，使用 40 g·L-1多聚甲醛1 mL固定2 h，加入體積分?jǐn)?shù)0.3%油紅O染液250 μL，室溫染色1 h，吸去染液，加入體積分?jǐn)?shù)60%異丙醇250 μL處理 5 min，在200倍光學(xué)顯微鏡下觀察脂滴著色情況，觀察到細(xì)胞中有紅色脂滴即表示脂肪細(xì)胞分化成熟。取誘導(dǎo)分化成熟的脂肪細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶消化后接種于3個(gè)24孔板中，隨機(jī)分為對(duì)照組、Adropin組、自噬激動(dòng)劑組及Adropin+自噬激動(dòng)劑組；對(duì)照組細(xì)胞不予特殊處理，Adropin組細(xì)胞加入Adropin(終濃度為 1 μmol·L-1)[13]，自噬激動(dòng)劑組加入西羅莫司(終濃度為100 nmol·L-1)[14]，Adropin+自噬激動(dòng)劑組細(xì)胞加入Adropin(終濃度為 1 μmol·L-1)和西羅莫司(終濃度為100 nmol·L-1)，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

1.5 MDC染色檢測(cè)各組細(xì)胞自噬空泡取1個(gè)24孔板的細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基，PBS漂洗，使用MDC染色試劑盒染色，具體操作步驟參照說(shuō)明書進(jìn)行，熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，細(xì)胞中的自噬空泡被染為綠色。每組細(xì)胞隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)自噬空泡數(shù)目，得出各組細(xì)胞自噬空泡相對(duì)含量，以對(duì)照組自噬空泡數(shù)為參照，設(shè)定為100%，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞自噬空泡相對(duì)含量=實(shí)驗(yàn)組自噬空泡數(shù)/對(duì)照組自噬空泡數(shù)×100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.6 免疫熒光染色檢測(cè)各組細(xì)胞中微管相關(guān)蛋白輕鏈3(microtubule associated protein light chain 3，LC3)表達(dá)取1個(gè)24孔板的細(xì)胞，以PBS漂洗，40 g·L-1多聚甲醛固定，牛血清白蛋白(含有體積分?jǐn)?shù)0.5%TritonX-100)封閉，然后經(jīng)LC3一抗、Alexa Fluor 488標(biāo)記的羊抗兔二抗、DAPI染劑分別避光孵育后，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞著色情況，DAPI著色于細(xì)胞核，細(xì)胞核為藍(lán)色；LC3著色于細(xì)胞質(zhì)，LC3陽(yáng)性細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)為紅色。每組隨機(jī)選取5個(gè)視野，分別計(jì)數(shù)總細(xì)胞數(shù)(即DAPI陽(yáng)性細(xì)胞)、LC3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算各組LC3陽(yáng)性細(xì)胞所占比例，LC3陽(yáng)性細(xì)胞比例= LC3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.7 Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白及PI3K/AKT通路蛋白表達(dá)取1個(gè)24孔板的細(xì)胞，胰蛋白酶消化處理后，收集各組細(xì)胞，加入200 μL蛋白裂解液，4 ℃裂解后提取總蛋白，以BCA試劑盒測(cè)定總蛋白濃度，具體操作步驟參照說(shuō)明書進(jìn)行。蛋白置于水浴鍋中煮沸5 min，根據(jù)測(cè)定結(jié)果，各組分別取含20 μg蛋白的樣品液在電泳儀中進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜上，以脫脂奶粉室溫封閉2 h后，依據(jù)目的蛋白相對(duì)分子質(zhì)量截取蛋白條帶置于小盒中，加入相應(yīng)一抗(Beclin-1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、p62、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT，以GAPDH作為內(nèi)參，11 000比例稀釋)，4 ℃孵育過(guò)夜；加入二抗(15 000)，室溫孵育1～2 h，采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色，以Tanon軟件拍攝圖像并分析Beclin-1、LC3-Ⅱ、p62、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

2 結(jié)果

2.1 3T3-L1細(xì)胞誘導(dǎo)分化結(jié)果結(jié)果見圖1。3T3-L1細(xì)胞形態(tài)為梭形，貼壁生長(zhǎng)。誘導(dǎo)分化10 d后，油紅O染色，細(xì)胞中出現(xiàn)紅色脂滴，表明細(xì)胞已分化為成熟脂肪細(xì)胞。

A：3T3-L1細(xì)胞；B：成熟脂肪細(xì)胞。

圖1 3T3-L1細(xì)胞誘導(dǎo)分化成熟脂肪細(xì)胞的鑒定(油紅O染色,×200)

Fig.1 Identification of mature adipocytes induced by 13T3-L1 cells (Oil red O staining,×200)

2.2 各組細(xì)胞中自噬空泡相對(duì)含量比較結(jié)果見圖2。對(duì)照組、Adropin組、自噬激動(dòng)劑組、Adropin+自噬激動(dòng)劑組細(xì)胞中自噬空泡相對(duì)含量分別為(100.00±0.00)%、(23.63±5.21)%、(207.59±51.33)%、(92.78±20.22)%。與對(duì)照組比較，Adropin組細(xì)胞中自噬空泡相對(duì)含量降低，自噬激動(dòng)劑組細(xì)胞中自噬空泡相對(duì)含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Adropin+自噬激動(dòng)劑組與對(duì)照組細(xì)胞自噬空泡相對(duì)含量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與Adropin組比較，自噬激動(dòng)劑組、Adropin+自噬激動(dòng)劑組細(xì)胞中自噬空泡相對(duì)含量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與自噬激動(dòng)劑組比較，Adropin+自噬激動(dòng)劑組細(xì)胞中自噬空泡相對(duì)含量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

A：對(duì)照組；B：Adropin組；C：自噬激動(dòng)劑組；D：Adropin+自噬激動(dòng)劑組。

圖2 各組細(xì)胞中自噬空泡表達(dá)結(jié)果(MDC染色，×400)

Fig.2 expression of autophagy vacuole in the cells of each group (MDC staining ，×400)

2.3 各組細(xì)胞LC3陽(yáng)性細(xì)胞比例比較結(jié)果見圖3。對(duì)照組、Adropin組、自噬激動(dòng)劑組、Adropin+自噬激動(dòng)劑組LC3陽(yáng)性細(xì)胞比例分別為(28.93±5.13)%、(10.03±2.23)%、(66.57±7.79)%、(26.08±4.92)%。與對(duì)照組比較，Adropin組細(xì)胞LC3陽(yáng)性細(xì)胞比例顯著降低，自噬激動(dòng)劑組細(xì)胞LC3陽(yáng)性細(xì)胞比例顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Adropin+自噬激動(dòng)劑組與對(duì)照組細(xì)胞LC3陽(yáng)性細(xì)胞比例比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05 )。與Adropin組比較，自噬激動(dòng)劑組、Adropin+自噬激動(dòng)劑組細(xì)胞LC3陽(yáng)性細(xì)胞比例顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與自噬激動(dòng)劑組比較，Adropin+自噬激動(dòng)劑組細(xì)胞LC3陽(yáng)性細(xì)胞比例顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

A：對(duì)照組；B：Adropin組；C：自噬激動(dòng)劑組；D：Adropin+自噬激動(dòng)劑組。

圖3 各組細(xì)胞LC3陽(yáng)性細(xì)胞染色結(jié)果(免疫熒光染色，×400)

Fig.3 Results of LC3 positive cell staining in each group(immunofluorescence staining ，×400)

2.4 各組細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量比較結(jié)果見圖4和表1。與對(duì)照組比較，Adropin組細(xì)胞中Beclin-1、LC3-Ⅱ 蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低，p62蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高，自噬激動(dòng)劑組細(xì)胞中Beclin-1、LC3-Ⅱ 蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高，p62蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Adropin+自噬激動(dòng)劑組與對(duì)照組細(xì)胞中Beclin-1、LC3-Ⅱ、p62蛋白相對(duì)表達(dá)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與Adropin組比較，自噬激動(dòng)劑組、Adropin+自噬激動(dòng)劑組細(xì)胞中Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高，p62蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與自噬激動(dòng)劑組比較，Adropin+自噬激動(dòng)劑組細(xì)胞Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低，p62蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

A：對(duì)照組；B：Adropin組；C：自噬激動(dòng)劑組；D：Adropin+自噬激動(dòng)劑組。

圖4 各組細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、LC3、p62的表達(dá)

Fig.4 Expression of autophagy-related proteins Beclin-1, LC3 and p62 in cells of each group(Western blot)

表1 4組細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、LC3-II、P62相對(duì)表達(dá)量比較

組別nLC3-IIBeclin-1p62對(duì)照組31.03±0.310.92±0.190.69±0.07Adropin組30.17±0.03a0.13±0.02a1.27±0.29a自噬激動(dòng)劑組32.01±0.39ab1.59±0.23ab0.14±0.04abAdropin+自噬激動(dòng)劑組31.01±0.32bc0.88±0.21bc0.64±0.15bc

注：與對(duì)照組比較aP<0.05；與Adropin組比較bP<0.05；與自噬激動(dòng)劑組比較cP<0.05。

2.5 各組細(xì)胞中PI3K/AKT 通路相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量比較結(jié)果見圖5、表2。與對(duì)照組比較，Adropin組細(xì)胞中p-PI3K、p-AKT蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高，自噬激動(dòng)劑組細(xì)胞中p-PI3K、p-AKT蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Adropin+自噬激動(dòng)劑組與對(duì)照組細(xì)胞中p-PI3K、p-AKT蛋白相對(duì)表達(dá)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與Adropin組比較，自噬激動(dòng)劑組、Adropin+自噬激動(dòng)劑組細(xì)胞中p-PI3K、p-AKT蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與自噬激動(dòng)劑組比較，Adropin+自噬激動(dòng)劑組細(xì)胞p-PI3K、p-AKT蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。4組細(xì)胞中PI3K、AKT蛋白相對(duì)表達(dá)量?jī)蓛杀容^差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

A：對(duì)照組；B：Adropin組；C：自噬激動(dòng)劑組；D：Adropin+自噬激動(dòng)劑組。

圖5 各組細(xì)胞中PI3K/AKT 通路蛋白p-PI3K、PI3K、AKT、p-AKT的表達(dá)(Western blot)

Fig.5 Expression of PI3K/AKT pathway proteins p-PI3K, PI3K, AKT and p-AKT in cells of each group(Western blot)

表2 4組細(xì)胞中PI3K/AKT 通路蛋白p-PI3K、PI3K、AKT、p-AKT相對(duì)表達(dá)量比較

組別np-PI3KPI3Kp-AKTAKT對(duì)照組30.98±0.120.53±0.111.92±0.140.46±0.13Adropin組31.54±0.25a0.51±0.132.96±0.61a0.44±0.15自噬激動(dòng)劑組30.38±0.05ab0.54±0.120.69±0.03ab0.45±0.12Adropin+自噬激動(dòng)劑組30.91±0.23bc0.52±0.111.40±0.38bc0.47±0.14

注：與對(duì)照組比較aP<0.05；與Adropin組比較bP<0.05；與自噬激動(dòng)劑組比較cP<0.05。

3 討論

肥胖與多種代謝性疾病如2型糖尿病、脂肪肝和心血管疾病等的發(fā)生相關(guān)，因此，對(duì)肥胖及代謝紊亂相關(guān)疾病的研究具有重要臨床意義[15]。Adropin參與體內(nèi)脂質(zhì)代謝，敲除小鼠Enho基因可使小鼠脂肪組織增加50%，引起小鼠肥胖；過(guò)表達(dá)Enho基因或以Adropin治療后可減少脂肪合成，減輕其體質(zhì)量；因此，Enho基因編碼的Adropin可能具有調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞的作用[16]。機(jī)體內(nèi)的能量物質(zhì)氨基酸、葡萄糖與脂滴等可通過(guò)不同途徑參與細(xì)胞自噬，研究發(fā)現(xiàn)，敲除小鼠自噬相關(guān)基因7可使脂肪組織的自噬活性降低，脂肪組織減少，提示自噬對(duì)調(diào)節(jié)機(jī)體脂質(zhì)代謝平衡至關(guān)重要[17]。

3T3-L1是一種胚胎成纖維細(xì)胞，可誘導(dǎo)分化為成熟脂肪細(xì)胞，因此又稱為前體脂肪細(xì)胞，是研究脂肪細(xì)胞分化調(diào)控機(jī)制的經(jīng)典模型細(xì)胞，3T3-L1需要經(jīng)過(guò)2個(gè)細(xì)胞周期的增殖后再在成脂分化誘導(dǎo)下經(jīng)過(guò)2次誘導(dǎo)分化才能培養(yǎng)為成熟脂肪細(xì)胞。本研究以3T3-L1誘導(dǎo)分化的成熟脂肪細(xì)胞作為研究對(duì)象，將3T3-L1經(jīng)過(guò)2次誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基的培養(yǎng)，結(jié)果顯示，多數(shù)3T3-L1細(xì)胞中出現(xiàn)被油紅O著色的小液滴，表明大多數(shù)細(xì)胞已經(jīng)可以形成脂滴，分化為成熟脂肪細(xì)胞，因此，3T3-L1誘導(dǎo)分化10 d后即可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

MDC是一種嗜酸性染色劑，可以染色自噬空泡結(jié)構(gòu)，用于檢測(cè)自噬體的形成。LC3是自噬體上表達(dá)的蛋白，可作為自噬體的檢測(cè)標(biāo)志物，其包含2種蛋白亞基，即LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成的前體LC3被Atg4B剪切為L(zhǎng)C3-Ⅰ，自噬發(fā)生過(guò)程中，LC3蛋白由LC3-Ⅰ轉(zhuǎn)為L(zhǎng)C3-Ⅱ，LC3-Ⅱ主要定位于自噬小體膜結(jié)構(gòu)上，穩(wěn)定表達(dá)于自噬體膜上，其與自噬小體的形成密切相關(guān)[18-19]。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，Adropin組細(xì)胞中自噬空泡相對(duì)含量、LC3陽(yáng)性細(xì)胞比例、LC3-Ⅱ蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低，自噬激動(dòng)劑組細(xì)胞中自噬空泡相對(duì)含量、LC3陽(yáng)性細(xì)胞比例、LC3-Ⅱ蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高；與Adropin組比較，自噬激動(dòng)劑組、Adropin+自噬激動(dòng)劑組細(xì)胞中自噬空泡相對(duì)含量、LC3陽(yáng)性細(xì)胞比例、LC3-Ⅱ蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高；與自噬激動(dòng)劑組比較，Adropin+自噬激動(dòng)劑細(xì)胞中自噬空泡相對(duì)含量、LC3陽(yáng)性細(xì)胞比例、LC3-Ⅱ蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低；此結(jié)果表明，Adropin干預(yù)不僅可降低自噬空泡相對(duì)含量，同時(shí)也可降低LC3陽(yáng)性細(xì)胞比例和LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)，提示Adropin干預(yù)可能對(duì)自噬小體形成具有一定的抑制作用。但是，單獨(dú)分析2LC3-Ⅱ含量不能有效反映自噬作用，同時(shí)，由于細(xì)胞中的酸性物質(zhì)不只包括自噬空泡，所以，本研究通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞Beclin-1、p62蛋白相對(duì)表達(dá)情況，進(jìn)一步分析Adropin干預(yù)對(duì)脂肪細(xì)胞自噬的影響。

Beclin-1是酵母ATG6的同系物，也是哺乳動(dòng)物參與自噬的特異性基因，可與Ⅲ型PIK3形成復(fù)合體，介導(dǎo)自噬相關(guān)蛋白ATG定位于自噬泡，從而促進(jìn)自噬，Beclin-1基因表達(dá)減少或活性降低均會(huì)對(duì)自噬產(chǎn)生抑制作用，因此，多位學(xué)者認(rèn)為其可作為反映自噬的指標(biāo)[20-21]。p62是一種由應(yīng)激誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)蛋白，可連接LC3與聚泛素化蛋白，通過(guò)泛素信號(hào)途徑將受損的線粒體、聚合的蛋白及細(xì)菌等轉(zhuǎn)運(yùn)到自噬小體，被自噬溶酶體降解；當(dāng)自噬激活時(shí)，自噬囊泡中p62蛋白水平降低；當(dāng)自噬被抑制時(shí)，自噬囊泡中p62蛋白水平升高[22]。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，Adropin組細(xì)胞中Beclin-1蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低，p62蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高；與對(duì)照組比較，自噬激動(dòng)劑組細(xì)胞中Beclin-1蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高，p62蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低；與Adropin組比較，自噬激動(dòng)劑組、Adropin+自噬激動(dòng)劑組細(xì)胞中Beclin-1蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高，p62蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低；與自噬激動(dòng)劑組比較，Adropin+自噬激動(dòng)劑組細(xì)胞中Beclin-1蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低，p62蛋白相對(duì)表達(dá)量升高。此結(jié)果表明，Adropin可減少Beclin-1蛋白表達(dá)，增加p62蛋白表達(dá)，從而抑制脂肪細(xì)胞自噬。

AKT是PI3K下游的絲/蘇氨酸蛋白激酶，AKT幾乎在所有組織中均有表達(dá)，可保護(hù)細(xì)胞應(yīng)對(duì)損傷，若敲除AKT基因，則細(xì)胞保護(hù)作用將會(huì)被抑制，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[23]。PI3K/AKT通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬的主要通路之一，該通路被激活后可抑制人前列腺癌細(xì)胞自噬，進(jìn)而促使其凋亡[24]。有研究顯示，敲除小鼠Enho基因可降低其血清中Adropin水平，降低AKT磷酸化，引起小鼠肺損傷[25]。因而推測(cè)，Adropin可調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號(hào)活性，且可能是Adropin抑制脂肪細(xì)胞自噬的作用機(jī)制。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，Adropin組細(xì)胞中p-PI3K、p-AKT蛋白相對(duì)表達(dá)量升高，自噬激動(dòng)劑組細(xì)胞中p-PI3K、p-AKT蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低；與Adropin組比較，自噬激動(dòng)劑組、Adropin+自噬激動(dòng)劑組細(xì)胞中p-PI3K、p-AKT蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低；與自噬激動(dòng)劑組比較，Adropin+自噬激動(dòng)劑細(xì)胞p-PI3K、p-AKT蛋白相對(duì)表達(dá)量升高；而4組細(xì)胞中PI3K、AKT蛋白相對(duì)表達(dá)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上結(jié)果表明，Adropin可激活PI3K/AKT信號(hào)，揭示PI3K/AKT信號(hào)通路激活可能是Adropin抑制脂肪細(xì)胞自噬的作用機(jī)制。

綜上所述，外源性Adropin可抑制脂肪細(xì)胞自噬，其作用機(jī)制可能與激活PI3K/AKT信號(hào)通路有關(guān)。但與自噬相關(guān)的通路及機(jī)制還有許多，Adropin是否通過(guò)其他通路或分子協(xié)同調(diào)控脂肪細(xì)胞自噬尚不清楚，將是下一步研究的重點(diǎn)。