馮巖巖，趙利芹，李 晏，谷景陽(yáng)，劉 聰，郭新勝，穆俊林，韓金紅，王長(zhǎng)虹

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 新鄉(xiāng) 453002;2.鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，河南 鄭州 450001；3.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，河南 新鄉(xiāng) 453003)

抑郁癥是最常見(jiàn)的精神疾病之一，也是最嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一，近年來(lái)，其發(fā)病率呈逐漸上升趨勢(shì)[1-3]，據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全球約3.5億人患有該疾病，每年造成的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)位于臨床疾病前列[4]。抑郁癥發(fā)病機(jī)制研究逐漸由環(huán)境生物學(xué)因素發(fā)展到分子生物學(xué)機(jī)制，其中，絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1(mitogen-activated protein kinase phosphatase-1，MKP-1)具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生理活動(dòng)和神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)的作用[5]，WANG等[6]研究發(fā)現(xiàn)，海馬內(nèi)MKP-1高表達(dá)可能與抑郁癥的發(fā)生有關(guān)。MKP-1可以負(fù)性調(diào)控絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)活性，并快速、直接地滅活MAPK[7]。MAPKs是一組絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是一種調(diào)節(jié)細(xì)胞反應(yīng)的主要信號(hào)系統(tǒng)[8],包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶、Jun氨基末端激酶 (Jun N-terminal kinase,JNK)和p38[9-10]。JNK信號(hào)通路調(diào)節(jié)各種細(xì)胞的凋亡[11]，JNK基因異?？梢鹣嚓P(guān)的精神疾病，但具體機(jī)制尚不清楚[12]。氟西汀是臨床常用的抗抑郁藥物，屬于5-羥色胺選擇性再攝取抑制劑，已被廣泛應(yīng)用于抑郁癥和焦慮癥的治療[13-15]。本研究通過(guò)慢性不可預(yù)見(jiàn)性刺激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)建立抑郁樣大鼠模型，并給予氟西汀進(jìn)行干預(yù)，探討氟西汀對(duì)抑郁樣大鼠行為及海馬組織內(nèi)MKP-1、磷酸化JNK(p-JNK)和JNK蛋白表達(dá)水平的影響，為研究抑郁癥的發(fā)病機(jī)制及治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性Sprague Dawley大鼠40只，8周齡，體質(zhì)量160～200 g，飼養(yǎng)于濕度40%～50%、溫度(24.0±1.0) ℃的通氣籠系統(tǒng)。大鼠購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK(京)2012-0001，質(zhì)量合格證號(hào)：11400700139232。

1.2 主要試劑與儀器鹽酸氟西汀購(gòu)自蘇州制藥有限公司(國(guó)藥準(zhǔn)字 J20130010)，MKP-1抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，JNK抗體、P-JNK抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司，磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GADPH)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，山羊抗兔二抗購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳儀(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)和轉(zhuǎn)膜儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組及抑郁大鼠模型制備40只大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、抑郁癥組、生理鹽水組和氟西汀組，每組10只。正常組大鼠以每籠2只正常環(huán)境飼養(yǎng)8周，不給予任何刺激。抑郁癥組、生理鹽水組和氟西汀組大鼠均孤養(yǎng)，并給予8周CUMS[16]：行為限制(每次2 h)、強(qiáng)迫游泳(水溫4 ℃，每次5 min)、夾尾(大鼠尾部近端1/3處，每次1 min)、夜間傾斜籠子45°、電擊足底(電壓60 V，每次10 s,間隔5 s)、潮濕墊料(24 h)、禁食24 h、禁水24 h；上述刺激隨機(jī)排列，相同刺激不可連續(xù)出現(xiàn)。在CUMS進(jìn)行的第5～8周,生理鹽水組大鼠給予生理鹽水(10 mg·kg-1·d-1)灌胃，氟西汀組大鼠給予氟西汀(10 mg·kg-1·d-1)灌胃，正常組和抑郁癥組大鼠不給予任何干預(yù)。

1.3.2 各組大鼠行為學(xué)評(píng)估分別于造模前、造模4周(造模后)、8周后(干預(yù)后)稱大鼠體質(zhì)量，并進(jìn)行蔗糖水偏好實(shí)驗(yàn)、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)及強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)，評(píng)估大鼠行為學(xué)改變。(1)蔗糖水偏好實(shí)驗(yàn)：將大鼠置于安靜的房間；第1天在籠子上放置2瓶10 g·L-1蔗糖溶液；第2天放置1瓶10 g·L-1蔗糖溶液和1瓶清水；第3天大鼠禁食禁水；第4天放置相同體積的1瓶10 g·L-1蔗糖溶液和1瓶清水，并稱蔗糖溶液和清水的質(zhì)量，12 h后將蔗糖溶液和清水互換位置，24 h后稱剩余蔗糖溶液及清水質(zhì)量；蔗糖偏好指數(shù)=糖水消耗量/(清水消耗量+糖水消耗量)×100%。(2)曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)：礦場(chǎng)由不透明鋼板制成(100 cm × 100 cm × 40 cm)，置于暗室，將大鼠置于礦場(chǎng)中心，讓大鼠自由活動(dòng)5 min。全部實(shí)驗(yàn)過(guò)程由攝像機(jī)拍攝，用Smart virsion 2.5 軟件(上海欣軟科技有限公司)跟蹤記錄大鼠5 min內(nèi)行為，計(jì)算大鼠運(yùn)動(dòng)總路程，并人工同步記錄大鼠直立次數(shù)。(3)強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)：參考PORSOLT等[17]的實(shí)驗(yàn)方法，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室情況，稍作修改，水溫25 ℃，測(cè)試6 min,記錄后5 min的不動(dòng)時(shí)間。

1.3.3 Western blot法檢測(cè)各組大鼠海馬組織內(nèi)MKP-1、JNK、p-JNK蛋白表達(dá)水平4組大鼠進(jìn)行最后1次行為學(xué)評(píng)估后給予100 g·L-1水合氯醛(4 mL·kg-1)腹腔注射麻醉，斷頭取腦。在冰上迅速鈍性分離雙側(cè)海馬組織，生理鹽水沖洗后放入凍存管，于-80 ℃過(guò)夜保存，第2天置于液氮中。將海馬組織置于含有研磨珠的試管中，加入含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的裂解液，放入組織研磨儀中，研磨2次，每次60 s，冰上裂解30 min；然后4 ℃下13 000×g離心15 min，提取上清液；采用二喹啉甲酸法檢測(cè)蛋白濃度，加入一定量的5×Lodding buffer，在95 ℃金屬浴中煮10 min，進(jìn)行蛋白變性；進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳(100 V、90 min)、轉(zhuǎn)膜(300 mA、90 min)；使用Tris洗膜緩沖液洗滌 2次，每次5 min；體積分?jǐn)?shù)5%牛奶室溫封閉1 h； Tris洗膜緩沖液洗滌3次，每次10 min；孵育一抗，室溫?fù)u床放置1 h,然后4 ℃孵育過(guò)夜，第2天進(jìn)行洗膜,Tris洗膜緩沖液洗滌3次，每次10 min；孵育二抗2 h,Tris洗膜緩沖液洗滌3次，每次10 min；滴加超敏增強(qiáng)化學(xué)液至乙烯膜上進(jìn)行顯影拍照，保存圖片，應(yīng)用Image J軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 4組大鼠行為學(xué)表現(xiàn)比較結(jié)果見(jiàn)表1。造模前各組大鼠體質(zhì)量、蔗糖偏好指數(shù)、強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間及曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。正常組大鼠造模前后各行為學(xué)指標(biāo)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與造模前比較，造模后抑郁癥組、生理鹽水組、氟西汀組大鼠體質(zhì)量降低，蔗糖偏好指數(shù)下降，強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間增加,水平運(yùn)動(dòng)距離和直立次數(shù)減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與正常組比較，造模后抑郁癥組、生理鹽水組、氟西汀組大鼠體質(zhì)量降低，蔗糖偏好指數(shù)下降，強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間增加,水平運(yùn)動(dòng)距離和直立次數(shù)減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。造模后，抑郁癥組、生理鹽水組、氟西汀組大鼠各種行為學(xué)指標(biāo)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與正常組比較，干預(yù)后生理鹽水組和抑郁癥組大鼠體質(zhì)量降低，蔗糖偏好指數(shù)下降，強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間增加，水平運(yùn)動(dòng)距離和直立次數(shù)減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。干預(yù)后，氟西汀組與正常組大鼠各項(xiàng)行為學(xué)指標(biāo)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，生理鹽水組與抑郁癥組大鼠各項(xiàng)行為學(xué)指標(biāo)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。干預(yù)后，與生理鹽水組和抑郁癥組比較，氟西汀組大鼠體質(zhì)量增加，蔗糖偏好指數(shù)上升，強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間減少，水平運(yùn)動(dòng)距離和直立次數(shù)增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 4組大鼠行為學(xué)指標(biāo)比較

組別n體質(zhì)量/g蔗糖偏好指數(shù)/%強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間/s曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)水平運(yùn)動(dòng)距離/m直立次數(shù)正常組10 造模前245.31±2.0064.63±2.4423.60±3.42142.45±4.0721.75±1.44 造模后234.74±2.9967.73±1.6624.38±2.88140.90±4.6821.19±1.58 干預(yù)后238.40±3.9466.86±3.9223.78±1.33141.98±4.7620.42±1.46抑郁癥組10 造模前244.98±2.1665.00±3.0724.36±2.96140.89±4.7822.46±0.94 造模后183.02±6.83ab42.55±1.53ab53.98±4.05ab107.34±1.47ab8.79±0.17ab 干預(yù)后160.52±5.96b38.30±4.22b74.81±3.12b97.82±5.49b6.83±1.33b生理鹽水組10 造模前244.15±3.4863.77±3.3825.59±2.99143.89±4.8522.67±1.67 造模后183.46±2.49ab44.08±4.70ab52.44±4.78ab108.07±1.37ab8.56±0.27ab 干預(yù)后166.47±4.76b37.53±1.13b80.19±5.70b95.54±4.16b7.14±0.97b氟西汀組10 造模前244.57±3.6864.74±3.0922.90±2.33141.30±4.5022.24±1.27 造模后186.31±6.92ab44.76±2.46ab52.45±1.29ab107.84±1.33ab8.43±0.34ab 干預(yù)后203.60±3.30c56.27±4.75c56.66±2.14c111.67±2.81c16.91±0.96c

注：與造模前比較aP<0.05；與正常組比較bP<0.05；與生理鹽水組和抑郁癥組比較cP<0.05。

2.2 各組大鼠海馬組織內(nèi)MKP-1、p-JNK、JNK蛋白表達(dá)量及p-JNK/JNK比值比較結(jié)果見(jiàn)圖1和表2。抑郁癥組和生理鹽水組大鼠海馬組織內(nèi)MKP-1蛋白表達(dá)量高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；氟西汀組大鼠海馬組織內(nèi)MKP-1蛋白表達(dá)量低于抑郁癥組和生理鹽水組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；氟西汀組與正常組大鼠海馬組織內(nèi)MKP-1蛋白表達(dá)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。4組大鼠海馬組織內(nèi)p-JNK、JNK蛋白表達(dá)量及p-JNK/JNK比值比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

A:正常組;B:抑郁癥組;C:生理鹽水組;D:氟西汀組。

圖1 4組大鼠海馬組織內(nèi)MKP-1、p-JNK和JNK蛋白表達(dá)(Western blot)

Fig.1 Expression of MKP-1，p-JNK and JNK protein in the hippocampus tissues of rats in the four groups(Western blot)

表2 4組大鼠海馬組織內(nèi)MKP-1、p-JNK、JNK蛋白表達(dá)及p-JNK/JNK比較

組別nMKP-1p-JNKJNKp-JNK/JNK正常組100.78±0.021.45±0.032.75±0.330.53±0.01抑郁癥組101.12±0.02a1.46±0.032.74±0.020.53±0.01生理鹽水組101.09±0.05a1.44±0.012.75±0.010.53±0.01氟西汀組100.79±0.05b1.45±0.032.75±0.030.53±0.01F234.361 0.879 0.437 1.303P 0.000 0.461 0.728 0.288

注：與正常組比較aP<0.05；與生理鹽水組和抑郁癥組比較bP<0.05。

3 討論

抑郁癥是致殘的主要原因之一[18],嚴(yán)重危害患者生命安全。目前，關(guān)于抑郁癥的病因、發(fā)病機(jī)制尚不明確，只存在幾種假說(shuō)，例如：?jiǎn)伟奉愡f質(zhì)假說(shuō)、下丘腦-垂體-腎上腺 (hypothalamic-pituitary-adrenal,HPA)軸功能失調(diào)假說(shuō)、炎性細(xì)胞因子及腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子 (brain-derived neurotrophic factor，BDNF) 改變等[19]。 研究認(rèn)為，抑郁癥的發(fā)病主要與生物化學(xué)因素如去甲腎上腺素、 5-羥色胺和多巴胺、遺傳因素、社會(huì)及環(huán)境因素有關(guān)[20]。

本研究采用CUMS制備抑郁大鼠模型，該模型每日對(duì)大鼠進(jìn)行行為限制、強(qiáng)迫游泳、夜間傾斜籠子、電擊足底、夾尾等各種刺激，且每日不重復(fù)同樣刺激，通過(guò)各種不同刺激來(lái)模擬抑郁癥形成過(guò)程，從而使大鼠產(chǎn)生抑郁樣行為表現(xiàn)[21-22]。本研究通過(guò)給予大鼠連續(xù)8周的不可預(yù)見(jiàn)性刺激，使大鼠表現(xiàn)出一系列的抑郁樣行為，包括強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間增加、水平運(yùn)動(dòng)距離和直立次數(shù)減少(大鼠探索興趣降低)、蔗糖偏好指數(shù)下降(表明大鼠出現(xiàn)快感缺失)、體質(zhì)量降低(表明大鼠生理活動(dòng)發(fā)生改變)等，表明抑郁模型建立成功。在第5～8周給予相應(yīng)的干預(yù)措施，發(fā)現(xiàn)氟西汀組大鼠體質(zhì)量增加，蔗糖偏好指數(shù)上升，強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間減少，水平運(yùn)動(dòng)距離和直立次數(shù)增加，表明氟西汀能改變抑郁模型大鼠抑郁樣行為。

MKP-1是蛋白質(zhì)家族中的一員，可以同時(shí)使蘇氨酸和酪氨酸殘基去磷酸化[23]。DURIC等[24]研究發(fā)現(xiàn)，在抑郁樣動(dòng)物和抑郁癥患者(尸檢)大腦海馬組織中均檢測(cè)到MKP-1表達(dá)增加，并認(rèn)為MKP-1在抑郁癥病理生理學(xué)中起著負(fù)性調(diào)節(jié)作用；在抑郁動(dòng)物模型大腦海馬組織中MKP-1 mRNA和蛋白表達(dá)水平增加，而將含有MKP-1過(guò)表達(dá)的病毒載體注射到大鼠海馬區(qū)內(nèi)，會(huì)引起大鼠出現(xiàn)糖水偏好指數(shù)降低，強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間增加等抑郁樣行為表現(xiàn)。MKP-1基因敲除小鼠給予CUMS應(yīng)激則不會(huì)產(chǎn)生抑郁樣行為。BARTHAS等[25]研究表明，慢性疼痛和重復(fù)的前扣帶皮層區(qū)光遺傳學(xué)刺激可使小鼠產(chǎn)生抑郁樣癥狀，MKP-1基因在大腦前扣帶皮層區(qū)過(guò)度表達(dá)，且這種癥狀能被氟西汀逆轉(zhuǎn)，采用基因敲除、拮抗劑或局部沉默MKP-1基因的表達(dá)，能減弱模型動(dòng)物抑郁樣行為，提示MPK-1在抑郁癥的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。本研究結(jié)果顯示，與正常組比較，抑郁癥組和生理鹽水組大鼠海馬組織內(nèi)MKP-1蛋白表達(dá)水平顯著升高，氟西汀組大鼠海馬組織內(nèi)MKP-1蛋白表達(dá)水平低于抑郁癥組；這與GUPTA等[26]研究結(jié)果一致。由此推測(cè)，海馬組織內(nèi)MKP-1表達(dá)水平在抑郁癥的發(fā)病過(guò)程中起著重要作用。同時(shí)，氟西汀能降低抑郁樣大鼠海馬組織內(nèi)MKP-1表達(dá)水平，并改善抑郁樣行為表現(xiàn)，也表明MKP-1在抑郁癥的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用。

關(guān)于抑郁癥發(fā)病的分子機(jī)制的研究越來(lái)越受到重視，而MAPK信號(hào)通路中JNK是否參與抑郁癥發(fā)病尚不清楚。MOHAMMAD等[27]研究發(fā)現(xiàn)，抑制海馬神經(jīng)源性JNK，成年小鼠大腦顆粒細(xì)胞數(shù)增加，同時(shí)可減輕小鼠焦慮及抑郁行為；另外，抑制顆粒細(xì)胞中JNK表達(dá)可以緩解小鼠焦慮和抑郁行為；提示JNK在焦慮和抑郁成年小鼠海馬顆粒細(xì)胞中起著主要作用。JNK基因缺失小鼠表現(xiàn)為強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間減少，蔗糖偏好增加，抑郁樣行為表現(xiàn)出較低水平，鑒于JNK-1基因缺失小鼠表現(xiàn)出較低的抑郁表型，MOHAMMAD等[27]對(duì)強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)絕望的小鼠使用JNK抑制劑反轉(zhuǎn)錄病毒，8周后進(jìn)行行為測(cè)試，發(fā)現(xiàn)使用JNK抑制劑反轉(zhuǎn)錄病毒小鼠的強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間顯著縮短。本研究結(jié)果顯示，大鼠海馬組織內(nèi)p-JNK、JNK蛋白表達(dá)及p-JNK/JNK比值未受到明顯影響，推測(cè)JNK信號(hào)通路可能未參與抑郁癥的發(fā)病機(jī)制，氟西汀對(duì)抑郁樣大鼠海馬組織內(nèi)JNK信號(hào)通路也無(wú)顯著影響。這與以上研究結(jié)果不一致，其原因可能是機(jī)體受到其他機(jī)制的影響而改變了JNK表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)不足之處在于未對(duì)大鼠海馬組織進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。

綜上所述，CUMS可成功誘導(dǎo)出大鼠抑郁樣行為表現(xiàn)，抑郁樣大鼠海馬組織內(nèi)MKP-1蛋白表達(dá)水平升高，提示MKP-1可能參與抑郁癥的發(fā)病機(jī)制，但MKP-1可能不是通過(guò)JNK信號(hào)通路發(fā)揮作用。同時(shí)，氟西汀可通過(guò)降低海馬組織內(nèi)MKP-1蛋白表達(dá)水平來(lái)改善大鼠抑郁樣行為。