卞曉萍，劉 青，孔慶科

(西南大學(xué)動物科技學(xué)院，重慶北碚400715)

近年來，應(yīng)用減毒沙門菌載體遞呈異源抗原開發(fā)口服活疫苗受到廣泛的重視。沙門菌作為活的疫苗載體，其優(yōu)點有：(1)沙門菌疫苗通過常規(guī)的細(xì)菌培養(yǎng)方法即可大量獲得，而且可以通過食物或飲水口服給藥，是大規(guī)模養(yǎng)殖場接種疫苗的經(jīng)濟(jì)、方便選擇；(2)經(jīng)口服接種的減毒沙門菌能夠通過粘膜途徑感染宿主，誘發(fā)特異性粘膜、體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答[1]；(3)沙門菌可以在活細(xì)胞中生物合成多糖，并且這些多糖可以連接至類脂A (Lipid A)的核心寡糖部分，從而誘導(dǎo)針對異源多糖抗原的系統(tǒng)性免疫應(yīng)答[2-3]。此外，使用延遲減毒系統(tǒng)能夠兼顧減毒沙門菌疫苗的安全性和有效性。該系統(tǒng)的主要原理是，用可調(diào)控啟動子(如阿拉伯糖調(diào)控子)將某些基因的啟動子替換，在體外誘導(dǎo)條件下該基因可以正常表達(dá)，沙門菌可以如野生菌一樣感染宿主，而一旦沙門菌到達(dá)缺乏誘導(dǎo)條件的體內(nèi)環(huán)境，該基因不再表達(dá)，從而引起細(xì)菌毒力弱化[4]。外膜多糖是存在于大多數(shù)致病菌的一種毒力因子，經(jīng)修飾后可以被用來預(yù)防相關(guān)致病菌引發(fā)的疾病。因此，使用減毒沙門菌載體開發(fā)多糖疫苗也是相關(guān)研究的熱點之一。本文將對減毒沙門菌載體遞呈異源多糖的研究進(jìn)展及其潛在的免疫機(jī)制進(jìn)行綜述。

1 荷載多糖的減毒沙門菌誘發(fā)免疫的機(jī)制

經(jīng)消化道感染宿主后，在腸道具有侵襲力的減毒沙門菌可以通過以M 細(xì)胞為代表的上皮細(xì)胞途徑侵入皮下組織，然后被位于小腸上皮下穹窿區(qū)的抗原遞呈細(xì)胞(Antigen presenting cell，APC)捕獲，進(jìn)而誘發(fā)機(jī)體的免疫應(yīng)答[5]。而缺乏侵襲力的減毒沙門菌則需要依靠吞噬細(xì)胞的吞噬作用才能被運送到血液中，繼而到達(dá)肝臟和脾臟并誘發(fā)相應(yīng)的免疫應(yīng)答[6]。

細(xì)菌的外膜多糖是非T 細(xì)胞依賴性抗原(TI 抗原)。雖然多糖抗原能在體內(nèi)誘導(dǎo)特異性IgM 應(yīng)答，但不能誘導(dǎo)大量IgM 轉(zhuǎn)換為IgG，也不能誘導(dǎo)免疫應(yīng)答增強(qiáng)(即記憶免疫后的二次抗體應(yīng)答)和持續(xù)的T 細(xì)胞記憶。多糖抗原也不能與MHC-II 類分子結(jié)合，所以無法被遞呈給T 輔助細(xì)胞(Th 細(xì)胞)，繼而導(dǎo)致生發(fā)中心反應(yīng)、B 細(xì)胞受體的相關(guān)同種型轉(zhuǎn)換及親合力成熟和記憶B 細(xì)胞的產(chǎn)生等免疫應(yīng)答過程也無法發(fā)生。為了解決TI 多糖抗原無法誘導(dǎo)有效免疫應(yīng)答的問題，F(xiàn)ikri 等將B 組鏈球菌III 型的莢膜多糖與蛋白載體(卵清蛋白，破傷風(fēng)毒素或卵清蛋白肽)共價結(jié)合，發(fā)現(xiàn)多糖能夠被APC 捕獲并與MHC-II 類分子結(jié)合，然后激活Th 細(xì)胞，進(jìn)而轉(zhuǎn)化為T 細(xì)胞依賴性抗原(TD抗原)[7]。在多糖-蛋白載體共價結(jié)合的情況下，多糖抗原誘導(dǎo)特異性IgM 轉(zhuǎn)換為IgG，記憶B 細(xì)胞發(fā)育和高效記憶T 細(xì)胞產(chǎn)生，從而誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生多糖抗原特異性、適應(yīng)性免疫應(yīng)答反應(yīng)。

多糖- 蛋白載體進(jìn)入體內(nèi)后，能夠被APC (如巨噬細(xì)胞、B 細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等)捕獲，然后與APC 的受體結(jié)合并交聯(lián)，進(jìn)而通過胞吞作用(外源抗原遞呈途徑)被內(nèi)化到核內(nèi)體中。在溶酶體中，某些氧化劑如活性氧(Reactive oxygen species，ROS)可以將多糖解聚為更小的碳水化合物(寡糖)，而蛋白質(zhì)部分被酸性蛋白酶加工成短肽類。從而產(chǎn)生短肽、寡糖以及寡糖- 短肽復(fù)合物等。隨后，寡糖- 短肽復(fù)合物的短肽部分被遞呈至細(xì)胞表面并與MHC-II類分子結(jié)合，MHC-II 類分子將更親水的寡糖遞呈至CD4+T 細(xì)胞的 αβ 受體(T cellαβ receptor，TCRαβ)，TCRαβ 可以識別寡糖以及寡糖- 短肽復(fù)合物中的糖鏈。從抗原結(jié)合到APC 受體直至其被呈遞給T 細(xì)胞，整個過程約需要30 min～60 min[8]。寡糖與MHC-II 類分子結(jié)合可以活化T 細(xì)胞，并誘發(fā)T 細(xì)胞產(chǎn)生白介素-4 (IL-4)和 IL-2 等細(xì)胞因子。在這些細(xì)胞因子的誘導(dǎo)下B 細(xì)胞開始在生發(fā)中心反應(yīng)、誘導(dǎo)免疫球蛋白的同種型轉(zhuǎn)換、體細(xì)胞高度突變以及記憶B 細(xì)胞的生成等。最終，機(jī)體產(chǎn)生針對寡糖的特異性IgG抗體(圖1)。因此，通過多糖與蛋白載體的共價結(jié)合，可以將多糖抗原轉(zhuǎn)化為TD抗原。

圖1 多糖- 蛋白載體激活T 細(xì)胞的機(jī)制[7]

2 減毒沙門菌遞呈異源多糖抗原的應(yīng)用

2.1 減毒沙門菌載體的開發(fā)減毒沙門菌因其特殊的優(yōu)勢被廣泛用于細(xì)菌、病毒、寄生蟲以及腫瘤等方面的研究。與應(yīng)用減毒沙門菌載體遞呈蛋白抗原一樣，用于遞呈異源多糖的沙門菌也必須經(jīng)過適當(dāng)?shù)亩玖θ趸?。早期通過化學(xué)物質(zhì)誘變和紫外線照射的方法使沙門菌減毒，但這兩種方法存在很大的盲目性，可能存在未知的突變和回復(fù)突變，從而造成弱毒株的不穩(wěn)定。如在20 世紀(jì)60年代初，房曉文等通過化學(xué)誘變的方法選育出預(yù)防仔豬副傷寒的減毒沙門菌疫苗，命名為C500[9]。該疫苗使用以來，我國的仔豬副傷寒得到了有效的控制，但同時該弱毒株的副作用較大，部分豬在接種后出現(xiàn)發(fā)抖，高燒甚至死亡。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，目前大多數(shù)都采用基因工程的方法在沙門菌染色體中隨機(jī)插入一個轉(zhuǎn)座子或刪除某些基因，以改變其編碼的毒力因子或編碼關(guān)鍵代謝途徑的酶基因序列，以及控制菌株在體內(nèi)生存的調(diào)節(jié)基因，使毒力基因突變，從而使其減毒，但不改變其免疫原性[10]。沙門菌的基因缺失途徑可以分為營養(yǎng)缺失途徑和代謝缺失途徑。如芳香族氨基酸合成相關(guān)的aroA、嘌呤合成相關(guān)的pur、全局調(diào)控基因phoP/Q和cAMP 利用相關(guān)的crp/cya等。但是，在開發(fā)減毒沙門菌載體的同時，還應(yīng)考慮到對沙門菌的毒力弱化要適度，既要保證安全性，又要避免過度減毒而影響其侵入機(jī)體、定植免疫器官和誘導(dǎo)有效免疫反應(yīng)的能力。

首先，減毒沙門菌經(jīng)口服免疫到達(dá)腸道后，需承受胃酸以及其它宿主防衛(wèi)因子如膽堿，抗菌肽等的攻擊，這對減毒沙門菌在腸道中的定植至關(guān)重要。研究表明，每種微生物均含有不同的耐酸反應(yīng)(Acid tolerance response，ATR)系統(tǒng)，它能夠使細(xì)菌在宿主體內(nèi)耐受低酸環(huán)境，因此不同的微生物表現(xiàn)出不同程度的耐酸性。盡管沙門菌編碼ATR1、ATR3 (精氨酸脫羧酶系統(tǒng))、ATR4 (賴氨酸脫羧酶系統(tǒng))和ATR5 (鳥氨酸脫羧酶)系統(tǒng)，但它僅具有中等耐酸性，可能是由于缺乏耐低酸的ATR2(谷氨酸脫羧酶系統(tǒng))[11]。Kopecko 等為了提高傷寒沙門氏菌(SalmonellaTy21a，S.Ty21a)的耐酸性，在可調(diào)控的阿拉伯糖啟動子誘導(dǎo)下將gad(谷氨酸依賴性耐酸基因)克隆到多拷貝質(zhì)粒(pGad)中。pGad 在pH2.5 的低酸環(huán)境下復(fù)制3 h 后，將 Ty21a 的耐酸性增加了5 個對數(shù)，此時細(xì)菌在阿拉伯糖存在的條件下正常生長并且增強(qiáng)了耐酸性[12]。隨后，該研究者為了gad基因能夠100 %穩(wěn)定表達(dá)，將該基因插入S.Ty21a 染色體中，并去除抗生素抗性標(biāo)記。通過培養(yǎng)單核細(xì)胞/ 巨噬細(xì)胞，測定重組菌的生長曲線和存活率，結(jié)果表明：Ty21a中Gad 蛋白的表達(dá)不會對該重組菌的減毒產(chǎn)生任何影響。Wu 等以Ty21a 為載體遞呈異源抗原開發(fā)二聯(lián)苗，通過插入與異源抗原基因共表達(dá)的gad來構(gòu)建重組耐酸菌，從而增強(qiáng)重組菌在胃酸性環(huán)境中的生存能力。動物實驗發(fā)現(xiàn)，重組菌具有良好的耐酸性[13]。再者，減毒沙門菌還需通過定植在腸道細(xì)胞和其它細(xì)胞內(nèi)，然后與免疫細(xì)胞作用誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。Kong 等應(yīng)用阿拉伯糖調(diào)控的延遲減毒系統(tǒng)構(gòu)建了減毒沙門菌，使沙門菌在進(jìn)入體內(nèi)(無阿拉伯糖環(huán)境)的早期階段具有類似野生型沙門菌定植的能力，而定植到宿主后致弱，然后重組菌在阿拉伯糖缺少的條件下會進(jìn)行程序式裂解，從而釋放外源多糖抗原誘導(dǎo)相應(yīng)的免疫應(yīng)答[14]。最后，利用基因重組技術(shù)，可以將沙門菌開發(fā)為載體遞呈異源多糖抗原。那么重組減毒沙門菌怎樣才能誘發(fā)宿主產(chǎn)生針對異源多糖抗原的特異性免疫應(yīng)答，這對開發(fā)多糖疫苗十分重要。目前，通用的方法是將整個多糖基因簇整合到沙門菌中。Han 等將禽致病性大腸桿菌(Avian pathogenicEscherichia coli，APEC)O1 和 O2 抗原的整個基因簇整合到減毒沙門菌中，并且經(jīng)動物實驗發(fā)現(xiàn)重組菌能夠誘發(fā)針對異源多糖抗原的免疫反應(yīng)[2-3]。此外，由于沙門菌自身具有O- 抗原多糖，利用這一特性可以改造沙門菌自身的O- 抗原多糖合成基因，使其能夠表達(dá)異源多糖抗原。Li 等改造減毒傷寒沙門菌的O- 抗原多糖基因簇，使其表達(dá)腸炎沙門菌的O9 多糖抗原，結(jié)果發(fā)現(xiàn)減毒傷寒沙門菌能夠很好的表達(dá)異源多糖[15]。但這種方法要求異源多糖的結(jié)構(gòu)與載體自身的O- 抗原多糖結(jié)構(gòu)具有相似處，因而具有一定的局限性。

2.2 減毒沙門菌載體遞呈的多糖減毒沙門菌載體的研究在國外很早就有報道，雖然近幾年國內(nèi)也有很多關(guān)于使用減毒沙門菌載體遞呈異源抗原的研究，但所遞呈的大部分都是蛋白類等抗原，關(guān)于異源多糖抗原的遞呈鮮有報道。S.Ty21a 是國際上唯一許可的減毒沙門菌口服活疫苗，因其遺傳背景較清晰，所以較多使用S.Ty21a 作為載體遞呈多糖抗原。其次，減毒鼠傷寒沙門菌(Salmonella enterica serovar typhimurium，S.typhimurium)載體也有較多研究。而對其它減毒沙門菌如豬霍亂沙門菌(Salmonella enterica serovar Choleraesuis，S.Choleraesuis)遞呈異源多糖的報道幾乎沒有，除此之外減毒沙門菌所遞呈的多糖抗原大都為革蘭氏陰性菌的外膜多糖(表1)。

表1 減毒沙門氏菌載體遞呈的異源多糖

外膜多糖位于細(xì)菌的表面，它直接與宿主相互作用，這大大增加了致病菌逃避免疫系統(tǒng)細(xì)胞的吞噬作用以及促進(jìn)了致病菌的粘附等，因此多糖是一個重要的毒力因子。純化的多糖不能誘導(dǎo)良好的免疫反應(yīng)，但與蛋白載體共價結(jié)合后，可誘導(dǎo)較高的免疫反應(yīng)，因此多糖也是一種重要的免疫因子。目前，異源多糖抗原在減毒沙門菌中的表達(dá)主要有兩種方式。一種是將多糖基因簇整合到沙門菌的染色體中，另外一種是將編碼多糖基因簇的質(zhì)粒導(dǎo)入沙門菌中。由于沙門菌能夠生物合成多糖，因此這兩種方式均能夠使多糖與沙門菌的Lipid A 連接，進(jìn)而誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生針對異源多糖抗原的免疫應(yīng)答。Dharmasena 等一直研究S.Ty21a 作為多功能口服疫苗載體，并嘗試用它來遞呈多種異源多糖抗原[16]。起初，他們將S.Ty21a 分別導(dǎo)入編碼宋內(nèi)志賀氏菌(Shigellasonnei)和痢疾志賀氏菌(S.dysenteriae)脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)基因簇的質(zhì)粒，所得到的重組菌在非選擇性培養(yǎng)基中生長＞50 代后，仍然能夠穩(wěn)定攜帶這些質(zhì)粒，但仍含有抗生素抗性標(biāo)記。但刪除抗生素抗性標(biāo)記后，發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒表達(dá)變得不穩(wěn)定。為此，研究者將編碼S.sonneiLPS 基因簇的約12 kb 區(qū)域插入到由于突變而無功能的S.Ty21a 基因組中，構(gòu)建了能夠表達(dá)同源和異源O- 抗原的重組菌，并且在刪除抗生素抗性標(biāo)記后顯示100 %的遺傳穩(wěn)定性。為了使減毒沙門菌載體誘發(fā)更廣泛的免疫交叉保護(hù)，Dharmasena 等將噬菌體SfII 攜帶的bgt-gtrII 基因克隆到質(zhì)粒的2a rfb 操縱子上游區(qū)，噬菌體SF6 攜帶的oac基因和噬菌體 SfX 攜帶的gtrX、gtrA和gtrB基因及其同源啟動子串聯(lián)克隆到質(zhì)粒的2a rfb 操縱子上游區(qū)。通過上述方法得到的重組菌能夠同時表達(dá)弗氏志賀氏菌(Shigellaflexneri)2a 和3a O-抗原，并且能夠誘發(fā)有效的免疫應(yīng)答[18]。為了能夠穩(wěn)定表達(dá)外源多糖抗原，并誘發(fā)有效的免疫應(yīng)答。Han 等用新型酵母細(xì)菌穿梭載體pSS26 克隆 10.8 kb 的 APEC O1 和 O2 O- 抗原多糖基因簇，并將所得到的質(zhì)粒導(dǎo)入減毒鼠傷寒沙門菌載體中[2-3]。通過玻片凝集，銀染和蛋白印跡等試驗證實O1 和O2 O-抗原多糖能夠在減毒鼠傷寒沙門菌中穩(wěn)定合成。其結(jié)果還顯示減毒沙門菌疫苗中產(chǎn)生的APEC O1 和O2 O- 抗原多糖能夠附著于減毒沙門菌的表面，并且異源多糖抗原的存在不影響減毒沙門菌表面脂多糖等其它佐劑的表達(dá)。動物實驗表明，該重組菌能夠為禽類提供針對APEC O1 O2 抗原攻擊的保護(hù)，并誘導(dǎo)針對異源多糖的高IgG 和IgA 免疫應(yīng)答。新型酵母細(xì)菌穿梭載體的應(yīng)用使異源多糖基因簇能夠成功連接到沙門菌的Lipid A 并暴露于沙門菌的表面，這使重組菌能夠誘發(fā)針對異源多糖的有效免疫應(yīng)答。

將編碼多糖基因簇的質(zhì)粒導(dǎo)入減毒沙門菌中會面臨質(zhì)?？赡軄G失的問題，而應(yīng)用以營養(yǎng)選擇標(biāo)志代替抗生素抗性標(biāo)志為主要特征的宿主- 載體平衡致死系統(tǒng)能夠使外源基因在宿主菌中穩(wěn)定表達(dá)。目前，應(yīng)用較多的是asd宿主- 載體平衡致死系統(tǒng)。該系統(tǒng)的原理是：asd基因負(fù)責(zé)編碼的天冬氨酸B- 半醛脫氫酶，是沙門菌的賴氨酸、蘇氨酸、甲硫氨酸、二氨基庚二酸(DAP)合成途徑中的一種關(guān)鍵酶，DAP 是構(gòu)成沙門菌細(xì)胞壁中肽聚糖的基本成分，是保持細(xì)胞完整性不可或缺的物質(zhì)。asd基因發(fā)生突變后，沙門菌由于不能合成DAP 而導(dǎo)致溶菌死亡[24]。當(dāng)導(dǎo)入帶有asd完整基因的互補(bǔ)質(zhì)粒后，質(zhì)粒與缺陷菌株能夠以遺傳互補(bǔ)的方式共同構(gòu)成宿主- 載體平衡致死系統(tǒng)，含有互補(bǔ)質(zhì)粒的缺陷菌可在體內(nèi)復(fù)制。此時，互補(bǔ)質(zhì)粒對其宿主菌的生長成為必需，一旦質(zhì)粒丟失，沙門菌則由于不能合成必需物質(zhì)而死亡，因此凡是能在體內(nèi)生長的缺陷菌株必定含有重組質(zhì)粒[25]。除此之外，編碼胸腺嘧啶核苷酸合成酶的thyA基因、編碼谷氨酰胺合成酶的glnA基因等平衡致死系統(tǒng)也有應(yīng)用，其原理與asd宿主載體平衡致死系統(tǒng)類似[25]。

3 問題與展望

多糖疫苗在20 世紀(jì)80年代末首次用于人體免疫。b型流感嗜血桿菌(Hib)一直是引起細(xì)菌性腦膜炎的主要原因，但多糖疫苗上市后病原體引起的腦膜炎發(fā)病率降低95 %。這一巨大成功為進(jìn)一步研究多糖疫苗打開了大門。2005年以后，我國至少有4 個以上廠家制造的Hib 結(jié)合疫苗先后注冊上市。但是，國產(chǎn)的Hib 結(jié)合疫苗普遍采用溴化氫活化莢膜多糖或其衍生物與蛋白共價結(jié)合來制備疫苗，結(jié)合方法過于單一、制造成本高且有著顯著的局限性(如免疫原性較差、不能提供群體免疫力等)[26]。而用減毒沙門菌載體遞呈異源多糖抗原構(gòu)建多糖疫苗，其載體本身具有免疫佐劑作用。例如，LPS 的刺激可以增強(qiáng)樹突狀細(xì)胞捕獲和加工MHC-Ⅰ類抗原的能力，有利于將重組沙門氏菌的抗原遞呈給特異性的B、T 細(xì)胞[5]。而且，定植的減毒沙門菌可以持續(xù)地表達(dá)外源多糖抗原、刺激宿主，不需要反復(fù)免疫。此外，沙門氏菌是胞內(nèi)侵襲菌，能夠激活相應(yīng)的細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞(CTL)，經(jīng)純化并共價結(jié)合的蛋白-多糖則沒有此作用。

在過去的十幾年里，對減毒沙門菌載體的研究向前跨越了一大步。已經(jīng)有不少實驗證實了減毒沙門菌載體遞呈異源多糖的潛力，但其真正用于臨床還需解決幾個問題。減毒沙門菌載體的安全性是首先需要考慮的。如果未經(jīng)充分減毒，經(jīng)口服途徑給藥的沙門菌可能在宿主體內(nèi)大量增植并造成嚴(yán)重的毒副作用。針對這種情況，可以考慮應(yīng)用可調(diào)控的延遲減毒系統(tǒng)，該系統(tǒng)的應(yīng)用使沙門菌充分減毒的同時又能保持其良好的侵襲力與定植[27]?？傊趯ι抽T菌減毒的同時，既要保證其安全性，又要保證其良好的免疫原性。其次，如其它載體一樣，減毒沙門菌用于遞呈異源多糖也需要考慮遞呈效率。酵母細(xì)菌穿梭載體可以用于克隆表達(dá)多糖基因簇，該方法的主要原理在于利用酵母能在體內(nèi)組裝同源片段(酵母具有復(fù)制子ARS4 和CEN5以及原核復(fù)制子pSC101)，然后形成大質(zhì)粒的特性(該質(zhì)粒具有TRP、Spec、asd 的篩選標(biāo)記，可以實現(xiàn)在酵母和原核宿主中的篩選，可以同時容納多個DNA 片段用于克隆長片段DNA 或基因簇的克隆和穩(wěn)定表達(dá))，再結(jié)合沙門菌的低拷貝質(zhì)粒能容納大片段的特性及專門用于疫苗遞送的質(zhì)粒載體即平衡致死系統(tǒng)組合而成的這一種方法。此外，載體與多糖之間的相互作用仍需進(jìn)一步研究，這對應(yīng)用減毒沙門菌載體開發(fā)多糖疫苗成功應(yīng)用到臨床至關(guān)重要。例如，沙門菌自身的O- 抗原多糖對異源多糖的表達(dá)是否有影響、減毒沙門菌載體遞呈異源多糖對其糖鏈的修飾有何影響以及多糖與lipidA 連接后誘發(fā)機(jī)體免疫的機(jī)制都尚不清楚。本實驗室正著力于優(yōu)化重組減毒沙門菌載體，并嘗試以沙門菌為載體來遞呈不同的多糖抗原，以開發(fā)安全有效的、可用于遞呈異源多糖的沙門菌疫苗。

雖然以減毒沙門菌為載體開發(fā)多糖多價疫苗還未達(dá)到預(yù)期的成果，但應(yīng)用沙門菌開發(fā)多糖多價疫苗有著諸多的優(yōu)點和潛力，仍值得繼續(xù)研究。相信隨著相關(guān)研究的進(jìn)一步深入以及現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，當(dāng)前遇到的問題將來都可以得到解決。