劉 韜，魏文燕，劉家星，汪開(kāi)毓

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)魚(yú)病研究中心，四川成都611130；2.成都市農(nóng)林科學(xué)院，四川成都610000)

魯氏耶爾森菌(Yersinia ruckeri)主要引起魚(yú)類的腸炎紅嘴病(ERM)，該病是一種重要的水生動(dòng)物疾病，最早在1966年美國(guó)愛(ài)德荷州的養(yǎng)殖虹鱒魚(yú)(Rainbow trout/Oncorhynchus mykiss)中暴發(fā)[1]， 隨 后傳至歐洲。目前該病主要在英國(guó)和歐洲大陸之間傳播，宿主一般為在淡、海水中的野生鮭魚(yú)和養(yǎng)殖鮭魚(yú)[2]。然而自ERM 首次報(bào)道以來(lái)，其宿主范圍和地理分布均在逐漸擴(kuò)大。此外，ERM 存在水平傳播的威脅，無(wú)明顯癥狀的帶菌魚(yú)體和部分鳥(niǎo)類均可攜帶Y.ruckeri[3-4]。

本實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)全基因組測(cè)序和比較基因組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)Y.ruckeri具有特異性的四型分泌系統(tǒng)(Type IV secretion system，T4SS)[1]。T4SS 是一種大分子傳遞裝置，進(jìn)化自細(xì)菌的接合系統(tǒng)[5-6]。多數(shù)致病性胞內(nèi)菌利用其傳遞DNA 或毒性蛋白到宿主細(xì)胞內(nèi)，幫助其增殖和逃避宿主的免疫攻擊[6]。根據(jù)T4SS 結(jié)構(gòu)的不同將Y.ruckeri分為 IVA 型(T4ASS)和IVB 型(T4BSS)[7]。本研究分離的Y.ruckeriSC09 株的染色體中帶有virB2-virB11基因簇，屬于T4ASS。綜合上下游基因分析發(fā)現(xiàn)，該基因簇位于一個(gè)基因水平轉(zhuǎn)移的ICE (Integrative and conjugative element)元件內(nèi)部[8]。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)室預(yù)測(cè)到位于ICE 中的mobBC基因是負(fù)責(zé)ICE 元件接合轉(zhuǎn)移的重要因子，可能對(duì)菌株T4SS 功能的發(fā)揮和菌株的毒性有重要影響。目前，關(guān)于Y.ruckeri致病機(jī)制的研究比較有限，而關(guān)于mobBC基因和ICE 的研究還未開(kāi)展。因此，本研究通過(guò)建立Y.ruckeriSC09 無(wú)痕mobBC缺失株并初步研究其致病機(jī)制，旨在為進(jìn)一步研究mobBC基因和ICE 元件在Y.ruckeri致病過(guò)程中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料質(zhì)粒pLP12[9]和大腸桿菌β2163[10]購(gòu)自廣州邁博生物科技有限公司；DH5α λpir 感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；魯氏耶爾森菌(Yersinia ruckeri)SC09 株由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院魚(yú)病研究中心提供[1]。SPF 級(jí)雌性小鼠(25 g～30 g)購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司；虹鱒魚(yú)(80 g～100 g)由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)魚(yú)病研究中心提供；魯氏耶爾森菌(Yersinia ruckeri)SC09 株全菌多克隆抗體(兔)由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)魚(yú)病研究中心提供。

1.2 主要試劑2×TSINGKE Master Mix 購(gòu)自北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司；DNA Marker 和DNA純化回收試劑盒均購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；氯霉素、質(zhì)粒DNA 小量提取試劑盒購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；酵母提取物(Yeast extract)、胰酪蛋白胨(Casein Tryptone)購(gòu)自英國(guó)OXOID 公司；2,6 - 二氨基庚二酸(Diaminopimelic acid，DAP)、L- 阿拉伯糖購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；細(xì)菌全基因組提取試劑盒、Goldview、瓊脂糖均購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；重組酶Exnase II購(gòu)自Vazyme 公司；TTC 購(gòu)自Sigma 公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)參考GenBank 中Y.ruckeriSC09 株(NZ_CP025800)mobBC基因序列 (NJ56_12460)， 設(shè)計(jì)擴(kuò)增mobBC基因左、右同源臂引物：mobBCMF1/MR1(上游，A)和mobBC-MF2/MR2(下游，B)，同時(shí)，參考mobBC上、下游基因序列設(shè)計(jì)引物mobBC-TF/TR 用于陽(yáng)性缺失株Y.ruckeriΔmobBC檢測(cè)。引物pLP-UF/UR 用于重組載體pLP12-mobBC檢測(cè)(表 1)。

表1 本研究用到的引物Table 1 All the primers involved in this study

1.4 自殺載體pLP12-mobBC 的構(gòu)建與鑒定構(gòu)建mobBC基因的左右同源臂AB，將AB 克隆入pLP12構(gòu)建重組質(zhì)粒pLP12-mobBC(圖1)。具體操作如下：分別采用引物mobBC-MF1/mobBC-MR1 和mobBCMF2/mobBC-MR2，以提取的Y.ruckeri全基因組DNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增程序：98 ℃3 min；98 ℃ 10 s，56/58 ℃ 20 s，72 ℃ 1 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min。DNA 回收試劑盒純化PCR 產(chǎn)物，獲得mobBC基因左、右同源臂的A、B 序列片段。以體積比1∶1 混合 A、B 片段作為模板進(jìn)行自延伸：98 ℃ 1 min； 98 ℃ 10 s，68 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，7個(gè)循環(huán)；隨后采用引物mobBC-MF1/mobBC-MR2 進(jìn)行左、右同源臂的融合 PCR 擴(kuò)增：98 ℃ 10 s，56/58 ℃ 20 s，72 ℃ 1 min，30 個(gè)循環(huán)，72 ℃ 7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物利用DNA 回收試劑盒純化，得到融合AB片段，-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

利用重組酶Exnase II (ClonExpress II，Vazyme)，37 ℃ 孵育 30 min 后，將質(zhì)粒載體 pLP12 與 AB 融合片段連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α λpir，將轉(zhuǎn)化菌體涂布于20 μg/mL CM-LB 抗性固體培養(yǎng)基(氯霉素，Chloramphenicol)。挑取單個(gè)菌落，采用引物pLP-UF/pLP-UR 進(jìn)行菌落PCR 驗(yàn)證，篩選的陽(yáng)性克隆菌擴(kuò)大培養(yǎng)，并提取質(zhì)粒pLP12-mob-BC，-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 pLP12-mobBC/β2163 供體菌構(gòu)建將 pLP12-mobBC電轉(zhuǎn)化常規(guī)方法制備的大腸桿菌β2163 感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化條件：1.8 kV/cm，200 Ω，25 μF，電轉(zhuǎn)完成后加入1 mL 的DAP-LB 液體培養(yǎng)基，37 ℃復(fù)蘇l h；取復(fù)蘇菌液 100 μL 涂布LB 平板(CM=20 μg/mL，DAP=0.3 mmol/L，0.3%D-葡萄糖)，37 ℃培養(yǎng)12 h。挑取氯霉素抗性的陽(yáng)性菌株并命名為pLP12-mobBC/β2163。

1.6 插入突變株、缺失突變株和回補(bǔ)株的構(gòu)建及鑒定將 pLP12-mobBC/β2163 與魯氏耶爾森菌 SC09株共培養(yǎng)并產(chǎn)生接合效應(yīng)，隨后在LB 平板(20 μg/mL CM+0.3 % D-葡萄糖)篩選發(fā)生第一次同源重組的插入突變的SC09 菌株。具體操作如下：將pLP12-mobBC/β2163 與Y.ruckeriSC09，分別過(guò)夜培養(yǎng)后，各取100 μL 菌液混合，離心棄上清，再加入10 μL新鮮LB 重懸并涂布DAP-LB 平板，30 ℃培養(yǎng)12 h。用1 mL LB 洗下所有菌體并取100 μL 涂布CM-LB平板。取平板上單菌落，以引物mobBC-MF1/mob-BC-MR2 進(jìn)行菌落PCR 鑒定。將正確的插入突變株命名為pLP12-mobBC/SC09。

將 pLP12-mobBC/SC09 在 LB 平 板 (0.4 % L- 阿拉伯糖)進(jìn)行篩選，得到發(fā)生第二次同源重組的mobBC基因缺失株。具體操作如下：將pLP12-mob-BC/SC09 接種LB 液體培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)2 h，取100 μL 菌液涂布 0.02 % L- 阿拉伯糖的 LB 平板，37 ℃培養(yǎng)12 h；取平板上單菌落，擴(kuò)大培養(yǎng)后提取其全基因組DNA，以引物mobBC-TF/mobBC-TR 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，并由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序鑒定。將鑒定正確的無(wú)痕突變株命名為Y.ruckeriΔmobBC，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

本研究針對(duì)mobBC基因的敲除策略如圖1 所示。

圖1 魯氏耶爾森菌SC09 mobBC 基因的缺失策略Fig.1 The strategy of mobBC gene knockout in Y.ruckeri SC09

同時(shí)，參考Luo P 等[9]的方法，利用pBAD33cmmobBC載體以接合轉(zhuǎn)移的形式回補(bǔ)SC09ΔmobBC菌株，并以阿拉伯糖誘導(dǎo)mobBC基因表達(dá)，同上經(jīng)PCR 鑒定并測(cè)序后得到回補(bǔ)株，命名為Y.ruckeriΔmobBC+pMobBC。

1.7 菌體電鏡學(xué)形態(tài)觀察和生長(zhǎng)曲線測(cè)定將培養(yǎng)后的野生型Y.ruckeri和Y.ruckeriΔmobBCPBS 洗滌8 次，0.5 %戊二醛固定，送成都里來(lái)生物科技有限公司進(jìn)行掃描電鏡和透射電鏡觀察。

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的野生型Y.ruckeri和Y.ruckeriΔmobBC、回補(bǔ)株Y.ruckeriΔmobBC+pMobBC 分別培養(yǎng)至OD600nm值為0.1，隨后于37 ℃振蕩培養(yǎng)，每隔2 h 定時(shí)取樣于分光光度計(jì)上測(cè)定OD600nm值，并繪制菌株生長(zhǎng)曲線，比較三者生長(zhǎng)特性。

1.8 缺失株感染實(shí)驗(yàn)將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Y.ruckeri和Y.ruckeriΔmobBC分別以 3×107cfu 的劑量經(jīng)肌肉接種SPF 小鼠，每組30 只；將大腸桿菌DH5α 以同樣的方法感染30 只小鼠作為陰性對(duì)照。記錄小鼠死亡情況，并利用GraphPad Prism version 8.0 軟件進(jìn)行小鼠生存曲線分析和繪制。

在小鼠感染實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，進(jìn)一步驗(yàn)證菌株在虹鱒魚(yú)體內(nèi)的毒性。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期野生型Y.ruckeri和Y.ruckeriΔmobBC及Y.ruckeriΔmobBC+pMobBC 回補(bǔ)株分別以腹腔注射的方式(劑量：5×107cfu)接種隨機(jī)分組的30 條虹鱒魚(yú)，記錄魚(yú)死亡情況，并利用GraphPad Prism version 8.0 軟件進(jìn)行虹鱒魚(yú)生存曲線分析。同時(shí)無(wú)菌采集各組死亡虹鱒魚(yú)的肝臟、脾臟和腎臟各50 mg 分別勻漿后，10 倍稀釋5 次，利用平板技術(shù)法在含有TTC 的營(yíng)養(yǎng)瓊脂的平板上進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)各臟器細(xì)菌感染數(shù)量。同樣方法采集感染中期(感染后48 h)虹鱒魚(yú)腎臟(細(xì)菌感染魚(yú)類的主要靶器官)制備常規(guī)石蠟切片和HE 染色，觀察，拍照，利用純化的兔抗Y.ruckeri多克隆抗體，利用免疫組織化學(xué)方法對(duì)虹鱒魚(yú)的腎臟石蠟切片進(jìn)行細(xì)菌感染分布的研究，進(jìn)一步確認(rèn)不同菌株的感染強(qiáng)度。

2 結(jié) 果

2.1 mobBC 基因同源臂構(gòu)建采用引物mobBCMF1/mobBC-MR1 擴(kuò)增得mobBC基因A 片段，得到545 bp 目的片段；采用引物mobBC-MF2/mobBCMR2 擴(kuò)增得mobBC基因 B 片段，得到504 bp 目的片段。以上述A、B 片段為模板，進(jìn)行融合PCR 擴(kuò)增，AB 片段采用膠回收DNA 純化試劑盒純化，經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示融合AB 片段長(zhǎng)1 004 bp，與預(yù)期相符(圖2)。結(jié)果表明，同源臂正確構(gòu)建。

圖2 mobBC 同源臂構(gòu)建Fig.2 mobBC homologous arms

2.2 pLP12-mobBC/β2163 供菌體的構(gòu)建利用引物pLP-UF/pLP-UR PCR 鑒定，結(jié)果顯示正確克隆得到 1 213 bp 的 PCR 產(chǎn)物(圖3)，空載體為 260 bp 產(chǎn)物，表明 pLP12-mobBC已轉(zhuǎn)化 DH5α λpir。擴(kuò)大培養(yǎng)陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒pLP12-mobBC，電轉(zhuǎn)化大腸桿菌β2163，涂布LB 平板，挑陽(yáng)性克隆，利用上述PCR 鑒定，結(jié)果顯示得到含質(zhì)粒pLP12-mobBC的pLP12-mobBC/β2163。以上結(jié)果表明 pLP12-mobBC載體和供體菌pLP12-mobBC/β2163正確構(gòu)建。

2.3 插入突變株的構(gòu)建挑取篩選平板上單克隆并純化，進(jìn)行菌落PCR 鑒定，結(jié)果顯示，野生株擴(kuò)增的到3 483 bp 片段，插入突變產(chǎn)生965 bp 片段(圖4)。一次同源重組未刪除野生株染色體序列，所以插入突變株仍能檢測(cè)到3 483 bp 的片段，但野生株卻無(wú)965 bp 的片段(圖4)。表明插入突變株pLP12-mobBC/SC09 正確構(gòu)建。

圖3 pLP12-mobBC 質(zhì)粒構(gòu)建鑒定結(jié)果Fig.3 Identification of recombination plasmid pLP12-mobBC

圖4 插入突變株P(guān)CR 檢測(cè)結(jié)果Fig.4 Identification of insertional mutants

2.4 缺失突變株構(gòu)建取插入突變克隆進(jìn)行二次同源重組，挑取平板上的克隆，以引物mobBC-TF/mobBC-TR 進(jìn)行檢測(cè)，并測(cè)序驗(yàn)證比對(duì)，結(jié)果顯示正確的缺失突變克隆擴(kuò)增得到1 230 bp 片段，而野生型菌株及回補(bǔ)株(圖略)擴(kuò)增片段長(zhǎng)3 748 bp (圖5)。表明mobBC無(wú)痕缺失突變株Y.ruckeriΔmobBC正確構(gòu)建。

圖5 缺失株P(guān)CR 檢測(cè)結(jié)果Fig.5 Identification of deletion mutants by PCR

2.5 菌體電鏡觀察利用透射電鏡進(jìn)行觀察，可見(jiàn)缺失株和野生型菌株在菌體形態(tài)上未表現(xiàn)出明顯差異(圖6)，表明mobBC基因與Y.ruckeri菌體結(jié)構(gòu)無(wú)明顯相關(guān)性。

圖6 魯氏耶爾森菌野生株與缺失突變株的電子顯微鏡照片F(xiàn)ig.6 Electron microscope of wild type Y.ruckeri and Y.ruckeri ΔmobBC

2.6 細(xì)菌生長(zhǎng)曲線測(cè)定取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的野生型Y.ruckeri和Y.ruckeriΔmobBC及回補(bǔ)株Y.ruckeriΔmobBC+pMobBC 分別培養(yǎng)，測(cè)定各時(shí)間點(diǎn)OD600nm值，繪制生長(zhǎng)曲線，結(jié)果顯示，在18 h 的培養(yǎng)過(guò)程中，Y.ruckeriΔmobBC生長(zhǎng)性能始終低于野生型菌株，而Y.ruckeriΔmobBC+pMobBC 回補(bǔ)株的生存曲線與野生菌株接近，且分光光度值也始終高于缺失株(圖7)。表明mobBC基因缺失對(duì)菌株的增殖生長(zhǎng)有較大影響。

圖7 Y.ruckeri 野生型、缺失株Y.ruckeriΔmobBC及回補(bǔ)株的生長(zhǎng)曲線Fig.7 Growth curve of wild type Y.ruckeri, deletion mutants and complemented strains

2.7 小鼠感染試驗(yàn)結(jié)果為了初步了解缺失株Y.ruckeriΔmobBC在生物體內(nèi)毒性的變化，本研究進(jìn)行了小鼠的急性感染實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，感染野生型Y.ruckeri后所有小鼠在第7 d 全部死亡，而感染Y.ruckeriΔmobBC的小鼠約在第 14 d 全部死亡。大腸桿菌的感染基本不會(huì)在14 d 內(nèi)造成小鼠死亡。同時(shí)，生存曲線分析顯示感染Y.ruckeriΔmobBC和感染野生型Y.ruckeri菌株之間存在顯著差異(p＜0.01；**)(圖8)。以上結(jié)果表明，Y.ruckeriΔmobBC對(duì)模式小鼠仍然存在毒性，但是其毒性明顯弱于野生型菌株。這表明mobBC基因可能是Y.ruckeri潛在的毒力因子。

2.8 虹鱒魚(yú)感染試驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步驗(yàn)證Y.ruckeriΔmobBC在易感魚(yú)類的毒性變化，將野生型菌株和Y.ruckeriΔmobBC， 以及回補(bǔ)株Y.ruckeriΔmob-BC+pMobBC 分別腹腔感染虹鱒魚(yú)。結(jié)果顯示。感染野生型Y.ruckeri后所有虹鱒魚(yú)在第64 h 全部死亡，而感染Y.ruckeriΔmobBC的虹鱒魚(yú)在整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期(96 h)的后期(87 h～96 h)才開(kāi)始出現(xiàn)明顯死亡。同時(shí)，生存曲線分析顯示感染Y.ruckeriΔmobBC和感染野生型Y.ruckeri菌株的虹鱒魚(yú)之間存在顯著差異(p＜0.01；**)，而Y.ruckeriΔmobBC+pMobBC 回補(bǔ)株與野生型菌株感染虹鱒魚(yú)后其生存曲線相似，無(wú)顯著性差異，但與缺失株Y.ruckeriΔmobBC感染虹鱒魚(yú)的生存曲線存在顯著差異(p＜0.01；**)。以上結(jié)果表明，急性感染實(shí)驗(yàn)中Y.ruckeriΔmobBC對(duì)易感魚(yú)類仍然存在較弱的毒性，但其毒性強(qiáng)度明顯低于野生型菌株(圖9)。這進(jìn)一步表明mobBC基因可能是Y.ruckeri潛在的毒力因子。

圖8 野生株與Y.ruckeriΔmobBC 感染模式小鼠生存曲線分析Fig.8 Survival curve analysis of Y.ruckeri acute infection in mice

圖9 野生株與Y.ruckeriΔmobBC 感染虹鱒魚(yú)生存曲線分析Fig.9 Survival curve analysis of Y.ruckeri acute infection in rainbow trout

為進(jìn)一步充分驗(yàn)證Y.ruckeriΔmobBC在易感魚(yú)類上的毒性強(qiáng)度減弱的趨勢(shì)，將上述急性感染魚(yú)體(分別取15 條魚(yú))的重要組織器官(肝臟、脾臟和腎臟)分離勻漿后進(jìn)行組織內(nèi)感染細(xì)菌平板計(jì)數(shù)，結(jié)果顯示，各組織中Y.ruckeriSC09ΔmobBC感染的細(xì)菌數(shù)量均低于野生型菌株，但是肝臟和脾臟總體細(xì)菌感染量(103cfu～104cfu)均低于腎臟組織的細(xì)菌感染數(shù)量(105cfu)(圖10)。且ΔmobBC感染與野生型菌株感染和Y.ruckeriΔmobBC+pMobBC 回補(bǔ)株感染多器官之間細(xì)菌計(jì)數(shù)結(jié)果均存在顯著差異(p＜0.01；**)。表明腎臟組織可能是菌株感染的重要靶器官。

圖10 虹鱒魚(yú)各組織感染細(xì)菌的平板計(jì)數(shù)Fig.10 The bacterial load in the tissues of rainbow trout

進(jìn)一步對(duì)急性感染虹鱒魚(yú)(感染后48 h)的腎臟組織進(jìn)行常規(guī)組織病理學(xué)觀察和免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，感染野生型菌株虹鱒魚(yú)的腎臟組織出現(xiàn)明顯的腎小管透明滴狀變，滴狀物大小不等、圓形、半透明、紅染(圖11A)；同時(shí)，免疫組化分析中感染野生型菌株虹鱒魚(yú)的腎臟組織中存在大量陽(yáng)性信號(hào)(圖11C 箭頭所示)。感染Y.ruckeriΔmobBC的虹鱒魚(yú)腎臟組織結(jié)構(gòu)未見(jiàn)明顯病理變化(圖11B)，且免疫組化分析中未見(jiàn)有明顯陽(yáng)性信號(hào)(圖11D)。表明Y.ruckeriΔmobBC感染虹鱒魚(yú)48 h 內(nèi)，其感染靶器官(腎臟)的感染強(qiáng)度明顯低于野生型菌株。進(jìn)一步表明mobBC基因的缺失會(huì)導(dǎo)致菌株毒性降低。

圖11 野生株與Y.ruckeriΔmobBC 感染虹鱒魚(yú)的腎臟組織病理和免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果Fig.11 Histopathology and immunohistochemistry of infected rainbow trout kidney during Y.ruckeri acute infection

3 討 論

目前對(duì)于mobBC基因的研究，尤其是其對(duì)菌株毒性的影響的研究還較薄弱。為了解mobBC基因?qū).ruckeri的毒性影響，本研究通過(guò)無(wú)痕基因缺失的方法獲得了缺失株Y.ruckeriΔmobBC。研究發(fā)現(xiàn)，在外部充足營(yíng)養(yǎng)條件下，Y.ruckeriΔmobBC與野生型菌株相比，雖然外觀超微結(jié)構(gòu)變化并不顯著，但是表現(xiàn)出較弱的菌株增殖力，且還表現(xiàn)出對(duì)模式小鼠和虹鱒魚(yú)明顯減弱的毒性。尤其在腎臟等靶器官感染過(guò)程中，Y.ruckeriΔmobBC對(duì)組織的感染能力和引起的組織損傷程度均明顯低于野生型菌株。由此，推測(cè)mobBC基因缺失雖然只是菌株基因組層面的變化，不會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌外形結(jié)構(gòu)改變，但將導(dǎo)致菌株復(fù)制能力下降，從而降低菌株在宿主體內(nèi)的毒性。菌株復(fù)制和增殖力的下降可能是菌株毒性下降的重要標(biāo)志。在后期的菌株毒性研究中，可把與菌株增殖力相關(guān)的基因也納入毒性基因的考量范疇，這將增加對(duì)菌株毒性研究的深度。mobBC基因缺失也為后期對(duì)該基因和SC09 株的T4SS 的功能性探索奠定了基礎(chǔ)。

過(guò)去，基于sacB基因的反向篩選一般是原核生物基因缺失策略首選方案[11]，但sacB基因編碼的SacB 蛋白活性卻對(duì)培養(yǎng)基中的NaCl 敏感，而培養(yǎng)基中NaCl 是必要添加物[12]。SacB 活性降低會(huì)導(dǎo)致篩選正確突變株的成功率極大降低。因此，缺少合適的反向篩選標(biāo)記是細(xì)菌基因編輯面臨的主要障礙。2007年，Roux 等利用基于ccdB基因的自殺載體構(gòu)建了vsm 基因缺失的燦爛弧菌[13]。但源自大腸桿菌F 質(zhì)粒的CcdB 蛋白的性未必對(duì)所有細(xì)菌有效，因?yàn)镃cdB 的活性是失活細(xì)菌的GyrA (DNA 促旋酶亞基)[14]，而細(xì)菌之間的GyrA 蛋白構(gòu)象存在差異，導(dǎo)致CcdB 活性失效。2015年，Peng Luo 等探索了大腸桿菌LP79 中來(lái)自擬態(tài)弧菌接合轉(zhuǎn)移的MGIV-mi1 基因島中的vmi480 基因和vmi470 基因的功能[9]。vmi480 和vmi470 組成了有獨(dú)立啟動(dòng)子的操縱子，結(jié)構(gòu)類似于 TA (toxin-antitoxin)系統(tǒng)[15-16]。Peng Luo等試圖單獨(dú)缺失vmi470，未果，而缺失vmi480 或者將vmi470 和毗鄰的vmi480 一起缺失卻獲得成功[9]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)單獨(dú)表達(dá)vmi480 對(duì)細(xì)菌細(xì)胞致死，而致死效應(yīng)在 vmi470 和vmi480 共表達(dá)時(shí)消除[9]。Vmi480 對(duì)大腸桿菌表現(xiàn)出強(qiáng)致死性，表明雖然毒性蛋白來(lái)自于弧菌，但它對(duì)各種來(lái)源的細(xì)菌均產(chǎn)生毒性作用[17-19]。另一方面，vmi470 和vmi480 只存在少數(shù)弧菌中[20]，因此vmi480 可作為一種新反向篩選標(biāo)記應(yīng)用于細(xì)菌基因缺失中。本研究中基于vmi480 基因的自殺質(zhì)粒pLP12 和β2163 高效接合系統(tǒng)首次在Y.ruckeri中缺失了T4SS 的核心基因mobBC，獲得了無(wú)抗生素標(biāo)記的Y.ruckeri的mobBC基因無(wú)痕缺失突變株。因此，本實(shí)驗(yàn)同時(shí)表明vmi480 可以應(yīng)用于魯氏耶爾森氏菌基因編輯中的反向篩選。

綜上所述，本文首次研究了Y.ruckeriSC09 的mobBC基因的毒性影響，為該病原菌的毒力研究增加了新的基礎(chǔ)。同時(shí)也為vmi480 在魯氏耶爾森氏菌研究中的應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。