張召興，李佩國，李蘊玉，賈青輝，張香齋，吳同壘，張志強

(1.河北科技師范學(xué)院河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點實驗室，河北秦皇島066604；2.河北旅游職業(yè)學(xué)院畜牧獸醫(yī)系，河北承德067000)

雞大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌(PathogenicEscherichia coli，E.coli)引起的雞敗血癥、臍炎、氣囊炎、卵黃腹膜炎等一系列疾病的總稱，是危害蛋雞養(yǎng)殖業(yè)的主要細(xì)菌性傳染病之一[1-2]。卵黃性腹膜炎主要發(fā)生于高產(chǎn)蛋雞，引起蛋雞生產(chǎn)性能下降、消瘦，還可以繼發(fā)其它疾病，嚴(yán)重者可造成急性死亡，尤其是高產(chǎn)蛋雞卵黃性腹膜炎發(fā)病死亡率較高并導(dǎo)致種蛋受精率和出雛率下降，成為蛋雞生產(chǎn)中最常見的傳染病之一，給蛋雞養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟損失[3-4]。致病性E.coli擁有多種血清型，同一血清型中不同的菌株無交叉免疫保護性，給致病性E.coli疫苗的研制帶來一定的困難，是導(dǎo)致大腸桿菌病廣泛流行的主要原因之一[5]?？咕幬锸强刂拼竽c桿菌病的主要手段，但由于抗菌藥物大量不合理使用導(dǎo)致E.coli耐藥基因發(fā)生變異，改變其耐藥機制，致使E.coli耐藥菌株不斷出現(xiàn)，并使其產(chǎn)生廣譜的耐藥性，同時也造成蛋、肉等畜產(chǎn)品中的抗菌藥物殘留，威脅人類的健康，導(dǎo)致公共安全衛(wèi)生問題的產(chǎn)生[6]。因此，在蛋雞養(yǎng)殖過程中應(yīng)注意抗菌藥物的合理使用。

2015年～2018年本研究室從邢臺和秦皇島地區(qū)蛋雞養(yǎng)殖場中分離到了42 株致雞卵黃性腹膜炎E.coli。本實驗對臨床分離的42 株致雞卵黃性腹膜炎E.coli分離株的系統(tǒng)進化分群、12 種抗菌藥物耐藥表型和耐藥基因進行檢測，并分析耐藥表型和耐藥基因型之間的相關(guān)性，為致蛋雞卵黃性腹膜炎大腸桿菌的防控及臨床用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌 株2015年～2018年從邢臺和秦皇島地區(qū)不同的蛋雞養(yǎng)殖場患病的40 周齡～50 周齡產(chǎn)蛋雞肝臟、卵黃等組織中分離到的42 株致雞卵黃性腹膜炎E.coli以及E.coli參考菌株ATCC25922 均由河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點實驗室保存。

1.2 主要試劑普通營養(yǎng)肉湯購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒、DNA 回收試劑盒等均購自O(shè)MEGA 公司；ExTaqDNA 聚合酶購自TaKaRa 公司；DL2000 DNA Marker 購自北京中科瑞泰生物科技公司；96 孔細(xì)菌培養(yǎng)板購自美國Corning 公司；阿莫西林 - 克拉維酸(A/C)、頭孢曲松(CRO)、頭孢噻呋(EFT)等11 種抗菌藥物購自河北遠(yuǎn)征生物工程有限公司；美羅培南(MEM)購自上海宸功生物技術(shù)有限公司。

1.3 分離菌系統(tǒng)進化分群鑒定參考文獻[7]設(shè)計E.coli系統(tǒng)進化分群引物即分別擴增chuA、yiaA和TspE4.C2基因的引物(表1)，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。利用細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒提取42 株致雞卵黃性腹膜炎E.coli分離株基因組DNA，以其為模板， 采用三重PCR 擴增分離菌菌株的chuA、yiaA和TspE4.C2基因，判定分離菌株的系統(tǒng)進化群。

1.4 分離菌的最小抑菌濃度(MIC)及其耐藥性檢測參考文獻[8]，采用96 孔板微量肉湯稀釋法測定臨床分離的42 株致雞卵黃性腹膜炎E.coli對12 種常用抗菌藥物的體外MIC，并用E.coli參考菌株ATCC25922 作為質(zhì)控菌株，參照美國臨床檢驗標(biāo)準(zhǔn)委員會(NCCLS)推薦的藥敏試驗操作方法和標(biāo)準(zhǔn)，對12 種常用抗菌藥物MIC 值的結(jié)果進行判定[9]。將臨床分離的42 株E.coli培養(yǎng)至對數(shù)期并計數(shù)，調(diào)整菌液濃度為108cfu/mL，取100 μL 菌液，接種于含不同藥物濃度的96 孔細(xì)菌培養(yǎng)板中，同時設(shè)陰性對照、陽性對照，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。計算分離菌株對藥物的 MIC50、MIC90及MIC 值，并統(tǒng)計分離菌株對12 種抗菌藥的耐藥率(包括中介)和耐藥表型。

1.5 細(xì)菌耐藥基因的檢測根據(jù)臨床分離的42 株E.coli的耐藥表型，擴增分離菌株的相應(yīng)的耐藥基因。根據(jù)GenBank 中登錄的E.coli耐藥基因序列和文獻報道，設(shè)計各耐藥基因的引物[10]：TEM、SHV、CTX-M(ESBLs 類)，MOXACC、DHA(頭孢菌素類)，NDM(碳青烯酶類)，Sul1、Sul2(磺胺類)，aac(3)-Ⅰv、aac(6')-Ⅰb(氨基糖苷類)，gyrA、gyrB、qurS(喹諾酮類)，TetA、TetR(四環(huán)素類)，floR(酰胺醇類)，mcr-1(多肽類)，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。以1.3 提取的分離菌株的基因組DNA 為模板對上述耐藥基因進行PCR 擴增，將PCR 產(chǎn)物回收后由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序鑒定，測序結(jié)果采用NCBI-BLAST 比對，鑒定標(biāo)準(zhǔn)按照同源性≥97 %判定。

1.6 細(xì)菌耐藥表型與耐藥基因相關(guān)性分析采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS19.0 對臨床分離的42 株E.coli的耐藥表型及耐藥基因型進行統(tǒng)計，并分析42 株分離菌株的耐藥表型和耐藥基因型之間相關(guān)性，計算二者的符合率。

2 結(jié) 果

2.1 分離菌株系統(tǒng)進化分群檢測結(jié)果利用大腸桿菌分子分群的chuA、yiaA和TspE4.C2基因進行三重PCR 擴增方法檢測臨床分離株的系統(tǒng)進化分群情況。結(jié)果顯示，42 株分離菌株中，7 株屬于A 群、9 株屬于 B1 群、14 株屬于 B2 群、12 株屬于 D 群，分別占分離菌株的16.67 %、21.43 %、33.33 %、28.57 %，其中A+B1 群占分離菌株的38.10 %，B2+D 群占分離菌株的61.90 %。表明臨床分離的42株致雞卵黃性腹膜炎E.coli分離株以B2+D 群流行為主。

2.2 分離菌株耐藥表型檢測結(jié)果采用96 孔板微量肉湯稀釋法測定臨床分離的42 株致雞卵黃性腹膜炎E.coli對 12 種常用抗菌藥物的 MIC，統(tǒng)計其MIC50、MIC90，分析其耐藥性。結(jié)果顯示，42 株分離菌株對阿莫西林- 克拉維酸、磺胺間甲氧嘧啶、多西環(huán)素、多黏菌素4 種藥物耐藥率較高，耐藥率在80.95 %～100 %；對氟苯尼考、丁胺卡那、大觀霉素、環(huán)丙沙星、恩諾沙星5 種藥物的耐藥率為45.24 %～76.19 %；對頭孢曲松、頭孢噻呋、美羅培南3 種藥物的耐藥性相對較低，為19.04 %～38.10 % (表2)，表明臨床分離的42 株致雞卵黃性腹膜炎E.coli分離株耐藥性嚴(yán)重。

表2 致雞卵黃性腹膜炎E.coli 分離菌株耐藥性檢測結(jié)果Table 2 Drug resistance test of E.coli isolates causing salpingo peritonitis in layer chicken

臨床分離的42 株E.coli中，耐12 種抗菌藥物的有8 株、耐11、3 種抗菌藥物各4 株、耐10、2、1 種抗菌藥物各2 株、耐9 種抗菌藥物有7 株、耐8、6 種抗菌藥物各有1 株，耐7 種抗菌藥物5 株，耐5 種抗菌藥物有6 株，耐12、9 種抗菌藥物的分離菌株最多，分別占分離菌株的19.05 %、16.67 %(表3)。表明分離菌株呈現(xiàn)多重耐藥性。

2.3 分離菌株耐藥基因檢測結(jié)果采用PCR 的方法對臨床分離的42 株致雞卵黃性腹膜炎E.coli分離株的18 種耐藥基因進行檢測。結(jié)果顯示，42 株E.coli分離株中檢出15 種不同的耐藥基因，檢出率為 83.33 % (15/18)，其中耐藥基因tetA、Sul1、TEM、Sul2、mcr-1、floR、SHV、tetR檢出率較高，為 59.52 %～95.24 %；耐藥基因aac(6')-Ⅰb、qurS、aac(3)-Ⅰv、gyrA、MOX、ACC檢出率相對較低，為14.29 %～38.10 %；NDM、DHA、CTX-M3 種耐藥基因未檢出，上述耐藥基因測序結(jié)果與GenBank參考株相應(yīng)基因序列同源性為97.9 %～99.9 % (表4)。表明15 種不同的耐藥基因廣泛分布于42 株致雞卵黃性腹膜炎E.coli分離株中。

表3 致雞卵黃性腹膜炎E.coli 分離菌株耐藥表型分析結(jié)果Table 3 Phenotypic analysis of drug resistance of the E.coli isolates causing salpingo peritonitis in layer chicken

表4 致雞卵黃性腹膜炎E.coli 分離菌株耐藥基因的檢測結(jié)果Table 4 Detection of resistance genes in E.coli isolates causing salpingo peritonitis in layer chicken

2.4 分離菌株耐藥表型和耐藥基因型相關(guān)性分析結(jié)果采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS19.0 對臨床分離的42 株致雞卵黃性腹膜炎E.coli分離株的耐藥表型和耐藥基因型之間進行了相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，磺胺類、酰胺醇類、多肽類的耐藥表型和耐藥基因型符合率最高，為97.5 %、100 %、100 %；四環(huán)素類、ESBLs 類、頭孢菌素類的耐藥表型和耐藥基因型符合率在58.3 %～81.8 %之間；喹諾酮類中耐藥表型和gyrA+qurS耐藥基因型符合率為52.6 %，與gyrA+gyrB及gyrA+gyrB+qurS耐藥基因型符合率比較低，氨基糖苷類的耐藥表型和耐藥基因型符合率較低(表5)。表明臨床分離的42 株E.coli的耐藥表型和耐藥基因型之間存在一定相關(guān)性。

3 討 論

E.coli是重要人畜共患病原，根據(jù)其遺傳特點和臨床致病型特征分為腸外致病性大腸桿菌(Ex PEC)、腸內(nèi)致病性大腸桿菌、共生型大腸桿菌3 個類型，禽致病性大腸桿菌(APEC)屬于ExPEC，APEC 是危害蛋雞養(yǎng)殖主要的傳染病病原，尤其是對產(chǎn)蛋高峰期的蛋雞[1-2,11]。E.coli可以分為A、B1、B2、D 4 個系統(tǒng)進化群，許多相關(guān)研究表明了E.coli的B2 和D 群是主要致病群。諸葛祥凱等報道了APEC 和人腸道外大腸桿菌分離菌株多屬于B2 群[12]。Matija 等報道E.coli的D 群是主要致病群[13]。王明城等報道了分離的腸外大腸桿菌分離菌株以B2 群為主要的流行菌群，其毒力強于其它菌群[14]。本實驗結(jié)果顯示，臨床分離的42 株致雞卵黃性腹膜炎E.coli分離株以B2+D 群流行為主，與上述報道一致。

表5 致雞卵黃性腹膜炎E.coli 分離菌株耐藥表型和耐藥基因型相關(guān)性分析結(jié)果Table 5 Correlation analysis of drug resistance phenotype and genotype of E.coli isolates causing salpingo peritonitis in layer chicken

由于E.coli對抗菌藥物易產(chǎn)生耐藥性被認(rèn)為是耐藥決定因子的“貯藏庫”，E.coli基因組中編碼的耐藥質(zhì)?？梢酝ㄟ^接合、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種方式在不同血清型菌株之間傳播，使抗菌藥物敏感菌株成為耐藥菌株，耐藥質(zhì)?？梢酝ㄟ^主動外排系統(tǒng)、整合子/ 基因盒系統(tǒng)改變E.coli細(xì)胞膜的通透性，致使抗菌藥物難以進入細(xì)胞靶位，因而導(dǎo)致多重耐藥性E.coli的產(chǎn)生[12-13]。因此，對E.coli耐藥表型檢測尤為重要。本實驗研究顯示42 株分離菌株對阿莫西林- 克拉維酸、磺胺間甲氧嘧啶、多西環(huán)素等9種藥物耐藥率在45.24 %以上，對頭孢曲松、頭孢噻呋、美羅培南3 種藥物的耐藥性相對較低，耐12種、9 種抗菌藥物分離菌株最多。從而證實了邢臺和秦皇島地區(qū)分離的致蛋雞卵黃性腹膜炎E.coli的耐藥性呈現(xiàn)嚴(yán)重多重耐藥性。美羅培南是碳青霉烯類抗生素。主要用治療多重耐藥革蘭陰性菌感染，但42 株分離菌株對其也產(chǎn)生了耐藥性。與于靜晨等[13]、劉璨穎等[14]、賈青輝等[15]報道存在一定的差異性?？赡苡捎诓煌貐^(qū)的E.coli菌株用藥情況和遺傳特性不同，導(dǎo)致耐藥種類的差異性。

E.coli編碼的耐藥基因主要位于質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座子等可移動基因元件中，質(zhì)粒中攜帶的許多不同耐藥基因，在抗菌藥物對細(xì)菌產(chǎn)生選擇壓力時，致使E.coli耐藥基因發(fā)生變異，從而導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生和擴散[15]。因此，耐藥基因在細(xì)菌耐藥性中起著重要的作用。本研究耐藥基因檢測結(jié)果顯示，42株分離菌株中耐藥基因tetA、Sul1、TEM、Sul2、mcr-1、floR、SHV、tetR檢出率在59.52 %以上，其它耐藥基因檢出率14.29 %～38.10 %，其中多肽類、酰胺醇類、四環(huán)素類等7 類抗菌藥物的耐藥表型和耐藥基因型符合率在52.6 %以上，其中酰胺醇類、多肽類的耐藥表型與耐藥基因型的符合率為100 %。多肽類、酰胺醇類、四環(huán)素類等7 類抗菌藥物耐藥基因在受試耐藥菌株中檢出率較高，因而證實了E.coli編碼的耐藥基因在受試菌株的耐藥性中起著重要的作用。與于靜晨等報道江蘇、安徽等地分離的53 株APEC 耐藥基因與相關(guān)耐藥菌株檢出率基本呈正相關(guān)一致[13]。本實驗中氨基糖苷類耐藥表型和耐藥基因型符合率為33.3 %，相對較低，可能由于氨基糖苷類耐藥基因編碼氨基糖苷類修飾酶的aac(3)-Ⅰv和aac(6')-Ⅰb基因不是導(dǎo)致耐氨基糖苷類耐藥性的主要因素，可能還存在其它耐藥機制。相關(guān)研究表明多黏菌素是治療革蘭陰性菌引起腸道感染的首選藥，被喻為“抗生素最后一道防線”，對多黏菌素產(chǎn)生的耐藥是由耐藥基因mcr-1介導(dǎo)的，其可以在不同種屬菌株之間轉(zhuǎn)移與傳播[16]。本實驗中多黏菌素耐藥表型和耐藥基因符合率為100 %，表明多黏菌素耐藥性及耐藥基因mcr-1廣泛存在于致雞卵黃性腹膜炎E.coli分離株中。張萊民也報道了養(yǎng)雞業(yè)中大量使用多黏菌素引起E.coli耐藥基因mcr-1在肉雞產(chǎn)業(yè)鏈中的廣泛傳播[17]。耐藥基因floR主要由質(zhì)粒介導(dǎo)大腸桿菌對氟苯尼考的耐藥性，其可以傳遞給其它動物和人類[18]。本實驗分離的E.coli分離株對氟苯尼考產(chǎn)生很強的耐藥性，與其耐藥基因floR的符合率為100 %，表明分離菌株對氟苯尼考的耐藥性是由耐藥基因floR介導(dǎo)的，其是否能夠在其它菌株之間傳播還有待進一步研究。因此，在蛋雞養(yǎng)殖過程中應(yīng)該重視抗菌藥物的使用，注意休藥期，減少相關(guān)抗菌藥物耐藥性的轉(zhuǎn)移與傳播。本實驗為致蛋雞卵黃性腹膜炎大腸桿菌病防控及臨床用藥提供了參考。