蔣國(guó)民，鄧時(shí)銘，鄒 利，程小飛，李傳武，劉 麗*

(1.湖南省水產(chǎn)科學(xué)研究所，湖南長(zhǎng)沙 410153；2.湖南省水產(chǎn)原種場(chǎng)，湖南長(zhǎng)沙 410153；3.湖南省水產(chǎn)高效健康生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南常德415000)

湘華鯪[Sinilabeodecorustungting(Nichols)]屬于鲃亞科(Barbinae)華鯪屬(Sinilabeo)，是沅水流域重要的名貴魚類之一[1]，為湖南省特有品種，具有肉質(zhì)細(xì)美、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高等優(yōu)良特性[2]。近幾十年來(lái)，湖南省水產(chǎn)科學(xué)研究所一直致力于研究湘華鯪的人工繁養(yǎng)技術(shù)，已突破人工繁殖和馴食技術(shù)難關(guān)[3]，獲得大批量魚苗，目前正在開展規(guī)模人工養(yǎng)殖試驗(yàn)。在養(yǎng)殖過程中，湖南省水產(chǎn)科學(xué)研究所自繁自養(yǎng)的50 月齡湘華鯪出現(xiàn)大量死亡，病魚鰓絲粘液增多，鰭條基部充血發(fā)紅，肛門紅腫。解剖發(fā)現(xiàn)，腹腔積水，肝臟顏色變淡，腸壁彈性差、易斷，腸道內(nèi)有大量白色粘液，死亡率可達(dá)100 %，而同一池塘的鰱魚、鳙魚、草魚、鯽魚均不發(fā)病。為了盡快查明發(fā)病死亡的病原菌，本研究對(duì)病死魚進(jìn)行病原菌的分離純化，結(jié)合微生物形態(tài)與理化特征、常規(guī)生化鑒定和PCR 鑒定方法進(jìn)行純化菌種的鑒定，并經(jīng)藥敏試驗(yàn)篩選出最佳治療藥物；通過觀察病魚肝胰臟和腸道組織切片，比較分析該病的病理組織變化，以期為該病的臨床診斷和防控提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，以豐富湘華鯪細(xì)菌性病害研究資料。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料患病魚為湖南省水產(chǎn)科學(xué)研究所自繁自養(yǎng)的50 月齡湘華鯪，規(guī)格為350 g～400 g/尾。健康湘華鯪(人工感染試驗(yàn))為38 月齡，體重120 g～180 g/ 尾。標(biāo)準(zhǔn)藥敏紙片購(gòu)自杭州微生物制劑有限公司；細(xì)菌基因組DNA 抽提試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；霍亂弧菌O1、O139診斷血清試劑盒購(gòu)自天津生物芯片有限公司。

1.2 分離菌形態(tài)觀察與生化鑒定無(wú)菌條件下，采集患病湘華鯪的腹水和腸道粘液，分別接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，28 ℃恒溫培養(yǎng)18 h～24 h，選擇典型優(yōu)勢(shì)可疑的單個(gè)菌落純化培養(yǎng)，4 ℃保存?zhèn)溆谩Ｌ羧〖兓赀M(jìn)行革蘭氏染色和一系列過氧化氫酶、硫化氫、甲基紅等生理生化特性鑒定，結(jié)合常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[4]、伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)(第9 版)[5]進(jìn)行分離菌的初步判斷。

1.3 人工感染試驗(yàn)對(duì)室內(nèi)小水泥池暫養(yǎng)10 d 的健康湘華鯪進(jìn)行感染試驗(yàn)，隨機(jī)分成3 組，每組20尾，每組設(shè)一平行。1.2 分離的菌株XHL-03 在28 ℃恒溫培養(yǎng)18 h～24 h，用無(wú)菌生理鹽水，制成細(xì)菌懸濁液，根據(jù)麥?zhǔn)媳葷峁艽_定菌液約為3.0×107cfu/mL、3.0×106cfu/mL，前兩組腹腔注射以上2 種濃度菌液，每尾0.5 mL，對(duì)照組注射相同體積生理鹽水。試驗(yàn)期間每天可適量投喂，連續(xù)觀察7 d，并對(duì)瀕死湘華鯪進(jìn)行細(xì)菌分離。

1.4 分離菌的16S rDNA 序列分析按照細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒說明方法提取1.2 中分離的菌株總 DNA，以 27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'/1492R： 5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3' 為引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，采用DNA 純化回收試劑盒純化回收16S rDNA 產(chǎn)物，由鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司測(cè)序。所得 16S rDNA 序列在 NCBI 的 Gen-Bank/Blast 中進(jìn)行同源性比對(duì)分析。通過ClustalW、DNAstar 和Mega4 等軟件，采用鄰接法(Neighbour-Joining method)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 病原菌血清型鑒定采用霍亂弧菌O1、O139血清診斷試劑盒進(jìn)行病原菌霍亂弧菌O1 群、O1(小川)、O1(稻葉)和O139 血清型的鑒定，對(duì)照為0.65 %生理鹽水。

1.6 病原菌藥物敏感試驗(yàn)選取16 種常用藥物，采用紙片法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)[4]，每種藥片重復(fù)3 次。試驗(yàn)結(jié)果判斷按中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部紙片法抗菌藥物敏感試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)(WS/T 125)進(jìn)行。

1.7 湘華鯪消化道組織病理切片觀察無(wú)菌條件下，取健康湘華鯪和患病湘華鯪的肝臟、胰臟和中間腸道組織制作常規(guī)病理切片[6]，光學(xué)顯微鏡下拍照觀察，比較分析患病湘華鯪組織病理變化。

2 結(jié) 果

2.1 分離菌的形態(tài)特征及生化鑒定結(jié)果從患病湘華鯪的腹水和腸道粘液分離獲得一純化菌株，命名為XHL-03。該分離菌接種普通瓊脂培養(yǎng)基28 ℃培養(yǎng)24 h，在培養(yǎng)基表面上形成圓形、乳白色、不透明的菌落，表面濕潤(rùn)、光滑，菌邊緣光滑。該分離菌經(jīng)革蘭氏染色為陰性，紫紅色、可彎曲、兩端鈍圓長(zhǎng)短不一的桿狀菌(圖1)。表明分離菌XHL-03 為可彎曲的革蘭氏陰性桿菌。

經(jīng)生化鑒定結(jié)果顯示，菌株XHL-03 能夠分解葡萄糖、蔗糖，淀粉等，不分解木糖、肌醇、阿拉伯糖等，MR 試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)陽(yáng)性，VP 試驗(yàn)陰性(表1)，結(jié)合細(xì)菌表型特性和生理生化特性可初步判斷分離菌為霍亂弧菌(Vibrio cholera)[5]。

圖1 革蘭氏染色后的細(xì)菌形態(tài)Fig.1 The micrograph showing Grarm staining of the isolate XHL-03 (1 000×)

表1 分離菌生理生化特性Table 1 Physiological and biochemical characteristics of the bacterial isolate

2.2 分離菌的人工感染試驗(yàn)注射分離菌XHL-03菌液，感染健康湘華鯪，第2 d 開始其出現(xiàn)游動(dòng)遲緩、背鰭基部充血、肛門紅腫、食欲下降等癥狀，實(shí)驗(yàn)魚陸續(xù)死亡。3.0×107cfu/mL 濃度組菌液感染湘華鯪后3 d 內(nèi)全部死亡，發(fā)病率達(dá)到100 %；3.0×106cfu/mL 濃度組感染湘華鯪后5 d 內(nèi)，死亡率達(dá)55 % (表2)；解剖感染后死亡的湘華鯪，可見其肝胰臟顏色略白，腸道粘膜紅腫，腸腔內(nèi)有白色粘液，與自然發(fā)病癥狀相似。對(duì)照組未出現(xiàn)異常癥狀，吃食正常。取人工感染的湘華鯪再次進(jìn)行病原菌分離，獲得了與XHL-03 形態(tài)、理化特性一致的菌株，表明菌株XHL-03 具有致病性，為湘華鯪死亡的病原菌。

2.3 16S rDNA 基因序列測(cè)定與系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析以提取的分離菌XHL-03 基因組總DNA 為模板，PCR 擴(kuò)增其16S rDNA 基因序列。產(chǎn)物純化回收后直接用于測(cè)序分析，測(cè)得該16S rDNA 基因序列長(zhǎng)度 1 392 bp，其 GenBank 登錄號(hào)為 MK615861。通過NCBI 中Blast 在線比對(duì)分析，結(jié)果顯示XHL-03菌株 16S rDNA 基因序列與霍亂弧菌 RC483 株(EF684899.1)相應(yīng)基因序列同源性最高，達(dá)97 %～99 %，構(gòu)建其系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果顯示，XHL-03 菌株與霍亂弧菌的親緣關(guān)系最為接近(圖2)。綜合常規(guī)生化鑒定，進(jìn)一步表明本研究獲得的XHL-03 菌株為霍亂弧菌。

表2 人工感染試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of artificial infection test

圖2 分離菌株XHL-03 及相關(guān)菌株16S rDNA 基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of the XHL-03 isolate and its relatives based on 16S rDNA gene sequences

2.4 病原菌的血清型鑒定結(jié)果通過霍亂弧菌O抗原玻片凝集試驗(yàn)，結(jié)果顯示分離菌XHL-03 與霍亂弧菌O1 群、O1 群稻葉型、O1 群小川型、O139診斷血清均不發(fā)生凝集反應(yīng)(表略)，表明該菌株XHL-03 屬于非O1/非O139 群霍亂弧菌。

2.5 病原菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，本實(shí)驗(yàn)分離的霍亂弧菌XHL-03 菌株對(duì)青霉素、氨芐西林、萬(wàn)古霉素等耐藥，對(duì)頭孢拉啶為中度敏感，對(duì)其它10 種藥物均為高度敏感(表3)。10 種高度敏感藥物可以有效地抑制其生長(zhǎng)增殖，為養(yǎng)殖生產(chǎn)上防控該病的可選藥物。

2.6 發(fā)病湘華鯪消化道病理組織學(xué)變化患病湘華鯪的消化道組織呈現(xiàn)不同的病理變化：肝臟動(dòng)脈血管管壁增厚，管腔縮小(圖3A)；靜脈血管淤積大量血細(xì)胞，管壁脫離、破裂(圖3B)；毛細(xì)血管擴(kuò)張，肝血竇充血，肝組織中可見大量紅細(xì)胞(圖3C)；肝細(xì)胞索模糊，胞核核仁固縮，胞膜消失，胞質(zhì)流失，細(xì)胞縮小、形狀多樣，細(xì)胞分界不清(圖3A)。胰腺?gòu)浬⒎植加诟闻K中，間質(zhì)纖維組織減少，有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，腺泡細(xì)胞膜模糊，酶原顆粒少，胞核腫大，核仁固縮并逐步解體，核仁膜變粗(圖3E)。腸道粘膜有大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)并穿腸而出，固有層血細(xì)胞淤積(圖3G)；粘膜下層、靜脈血管有少量淤血，有充血的小結(jié)節(jié)(圖3H)。表明，患病后的湘華鯪有急性胰腺炎和腸炎的綜合病理癥狀。

表3 藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of drug sensitivity test

3 討 論

通過常規(guī)分離純化獲得XHL-03 菌株，經(jīng)人工感染試驗(yàn)鑒定為致病菌。經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察、生化試驗(yàn)、16S rDNA 基因測(cè)序比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育樹聚類和血清凝集試驗(yàn)，分離菌XHL-03 株為非O1/ 非O139 霍亂弧菌，為一種烈性腸炎的病原菌[7]。它侵入湘華鯪體內(nèi)，促使其腸道收縮，誘導(dǎo)機(jī)體排出腸道有益微生物[8]，然后定植于腸道上皮組織，引起腸道大量淋巴細(xì)胞浸入腸腔，導(dǎo)致炎癥現(xiàn)象十分明顯。同時(shí)致使發(fā)病湘華鯪肝臟充血，肝細(xì)胞解體，彌散分布于肝臟中的胰腺酶原顆粒減少，腺泡細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的壞死，炎性細(xì)胞增加，呈現(xiàn)急性胰腺炎的病理癥狀[9]。由此可見，湘華鯪非O1/ 非O139 霍亂弧菌急性腸炎疾病會(huì)并發(fā)肝胰臟器官功能障礙，導(dǎo)致急性胰腺炎的發(fā)生。

圖3 湘華鯪消化道組織病理特征Fig.3 Histopathology features of digestive tract tissues in infected Sinilabeodecorustungting

霍亂弧菌廣泛存在于自然環(huán)境中，為水體的天然居民[10]，以生物膜的形式抵抗不良環(huán)境[11]，偏嗜富營(yíng)養(yǎng)化的堿性養(yǎng)殖水體[12]，能夠感染水產(chǎn)動(dòng)物引起泥鰍[13]、黃金鯽[14]、草魚[15]等魚類大量死亡。而非O1/ 非O139 霍亂弧菌感染人工養(yǎng)殖的湘華鯪時(shí)，同一池塘草魚、鯽魚等不發(fā)生感染，導(dǎo)致該現(xiàn)象的發(fā)生可能是喜生活在略偏堿性(pH7.6±0.3)水體[16]的湘華鯪較同一池塘、早已適應(yīng)人工養(yǎng)殖環(huán)境的草魚、鯽魚對(duì)本研究的非O1/ 非O139 霍亂弧菌更為敏感。同時(shí)人工養(yǎng)殖條件下，湘華鯪攝食習(xí)性改變，攝食量顯著增加，消化系統(tǒng)負(fù)擔(dān)過重，腸道菌群易紊亂，機(jī)體免疫系統(tǒng)受到的不良影響較同一池塘的草魚、鯽魚強(qiáng)烈，因此較易受到非O1/非O139霍亂弧菌的侵襲。

就目前我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)，細(xì)菌性疾病的防控還是以抗生素藥物。因此，本實(shí)驗(yàn)測(cè)定16 種藥物對(duì)湘華鯪源非O1/ 非O139 霍亂弧菌的抑制能力，結(jié)果顯示諾氟沙星、呋喃唑酮、頭孢噻肟、頭孢曲松等10 種藥物均能顯著地抑制該病原菌的生長(zhǎng)，使其對(duì)這幾種藥物呈現(xiàn)高度敏感性。但由于諾氟沙星、呋喃唑酮為我國(guó)食用動(dòng)物養(yǎng)殖中禁用藥物。因此，湘華鯪養(yǎng)殖過程中可選擇頭孢噻肟、頭孢曲松、新霉素等8 種敏感藥物進(jìn)行防治，可有效地控制本研究的非O1/ 非O139 霍亂弧菌引起的急性腸炎。