劉 燁，張家林，王瀟博，石 達(dá)，時(shí)洪艷，陳建飛，張 鑫，馮 力

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150069)

豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由PED 病毒(PEDV)引起的一種急性、高度接觸性腸道傳染病，主要侵害初生仔豬，引起仔豬水樣腹瀉、嘔吐、脫水等癥狀，臨床剖檢常見豬的空腸、回腸的腸絨毛萎縮和脫落[1-2]。目前，PEDV 在各地仍然廣泛流行，能夠感染各個(gè)年齡階段的豬，引起大量仔豬腹瀉和死亡，造成養(yǎng)豬業(yè)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[3]。因此，建立特異有效的檢測PEDV 的方法對于該病的防控具有重要的意義。

PEDV 屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬，編碼4 個(gè)主要的結(jié)構(gòu)蛋白，包括纖突蛋白S、囊膜蛋白E、膜蛋白M 和核衣殼蛋白N。S 蛋白是一種糖蛋白，位于病毒粒子表面，分為 S1(aa1 ～aa735)和 S2(aa736～aa1383)兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，分別在病毒吸附和侵入宿主細(xì)胞的過程中發(fā)揮著重要的作用，其中S1蛋白具有多個(gè)中和表位，是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對病毒特異性中和抗體的重要靶蛋白[4-8]。文獻(xiàn)報(bào)道PEDV自然感染能夠誘導(dǎo)母豬產(chǎn)生針對S 蛋白的特異性IgG 和IgA 抗體，并且持續(xù)時(shí)間長達(dá)6 個(gè)月[9-11]；基于PEDV S1 蛋白的重組疫苗能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較高水平的IgG 和IgA 抗體，同時(shí)免疫保護(hù)作用與兩種抗體水平的變化具有相關(guān)性[12-13]。根據(jù)S 基因的不同將PEDV 分為G1 型和G2 型，G2 型為世界范圍內(nèi)廣泛流行[3,14]。本實(shí)驗(yàn)室分離到一株G2 型PEDV，命名為LNct2a 株(KT323980)，基于該株病毒的S1蛋白建立檢測PEDV 特異性抗體的間接ELISA 方法，為及時(shí)檢測PEDV 的流行情況并監(jiān)測疫苗的免疫效力提供良好的技術(shù)手段。

PEDV 感染主要侵害仔豬的小腸上皮細(xì)胞，腸道局部黏膜免疫發(fā)揮著重要的抗病毒作用[15]，其中PEDV 特異性IgA 抗體在血清中的變化與腸相關(guān)淋巴組織中的抗體分泌細(xì)胞(Antibody-secreting cells，ASC)的應(yīng)答有關(guān)，能夠用于評價(jià)PEDV 感染情況和疫苗免疫的應(yīng)答水平。與原核表達(dá)相比，真核表達(dá)能夠完成對蛋白翻譯后的修飾，包括折疊、糖基化、磷酸化及酰基化等等，這樣獲得的蛋白結(jié)構(gòu)更接近于天然構(gòu)象，生物學(xué)活性更高[16]。研究表明，人源IgG Fc 片段能夠促進(jìn)重組蛋白在真核細(xì)胞中的分泌表達(dá)[17]。因此，本研究構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞，高效地融合表達(dá)S1 蛋白和Fc 片段，隨后以純化的S1 蛋白作為包被抗原，以羊抗豬IgAHRP 作為二抗，對各反應(yīng)條件優(yōu)化后，建立檢測PEDV G2 型特異性 IgA 抗體的間接ELISA 檢測方法，為臨床監(jiān)測豬血清中IgA 抗體水平及疫苗免疫效果的評價(jià)提供有效檢測手段。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料PEDV LNct2a 株為本實(shí)驗(yàn)室前期分離保存。PEDV S1 蛋白真核表達(dá)的優(yōu)化片段、人源IgG Fc 片段、大腸桿菌(E.coli)DH5α 感受態(tài)細(xì)胞、293T 細(xì)胞和pAAV-IRES-hrGFP 重組表達(dá)質(zhì)粒均由本實(shí)驗(yàn)室保存；protein-G 親和層析柱購自GE 公司；限制性內(nèi)切酶、T4 DNA 連接酶、2× PrimeSTAR Max Premix，購自美國NEB 公司；轉(zhuǎn)染試劑(Attractene Transfection Reagent)購自德國 Qiagen 公司；BCA 蛋白定量試劑盒購自TaKaRa 公司；鼠抗S1 蛋白單克隆抗體(MAb)S5F7 由本實(shí)驗(yàn)室制備；羊抗豬IgA-HRP 和羊抗鼠IgG-DY800 購自Abcam 公司；TMB 底物顯色液購自Amresco 公司；PEDV、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、豬德爾塔冠狀病毒(PDCoV)、豬輪狀病毒(PoRV)和豬圓環(huán)病毒(PCV2)陰、陽性血清由本實(shí)驗(yàn)室制備；142 份臨床血清樣品來自黑龍江、河南、山東等地豬場，由本實(shí)驗(yàn)室收集保存。

1.2 重組真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及蛋白的表達(dá)純化

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 由華大基因優(yōu)化LNct2a 株S1 基因，利用Oligo 7.0 軟件針對PEDV LNct2a 株的S1基因(KT323980)設(shè)計(jì)1 對引物L(fēng)NCT-optiS1-F：ATA TGCAGAATTCATGAAGTCCCTGACCTACTTC(EcoRⅠ)/LNCT-optiS1-R：CAGCATGAGCATCCGGACCG ACAAAACTCACACATGCCCA；針對人源 Fc 片段(KY053479.1)設(shè)計(jì)一對引物：LNCT optiS1 Fc-F：TGGGCATGTGTGAGTTTTGTCGGTCCGGATGCTC ATGCTG/LNCT/optiS1 Fc-R：TATATAAACTCGAGT TATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCT (XhoⅠ )。引物由吉林庫美公司合成。

1.2.2 重組真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 以優(yōu)化的LNct2a株S1 基因?yàn)槟０?，LNCT-optiS1-F/LNCT-optiS1-R 為引物，PCR 擴(kuò)增S1 片段；以人源IgG 分子的Fc 基因片段為模板，LNCT optiS1 Fc-F/LNCT optiS1 Fc-R為引物，PCR 擴(kuò)增Fc 片段。反應(yīng)程序：98 ℃ 10 s；55 ℃ 5 s，72 ℃ 15 s，35 個(gè)循環(huán)；4 ℃ 10 min。將PCR 產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳回收兩個(gè)目的片段，采用引物L(fēng)NCT-optiS1-F/LNCT optiS1 Fc-R 進(jìn)行融合PCR。PCR 產(chǎn)物命名為LNCT2-S1-Fc，膠回收目的片段。使用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ對真核表達(dá)載體pAAV-IRES-hrGFP 和目的片段LNCT2-S1-Fc分別雙酶切后連接，構(gòu)建的重組質(zhì)粒將經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定和測序鑒定，正確的重組質(zhì)粒命名為pAAV-LNCT2-S1-Fc。

1.2.3 重組蛋白的表達(dá)、純化及鑒定 利用轉(zhuǎn)染試劑將重組質(zhì)粒pAAV-LNCT2-S1-Fc 轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞，利用倒置熒光顯微鏡觀察GFP 蛋白的綠色熒光后，收集上清，采用Protein G 樹脂及AKATA 純化儀器純化融合蛋白，并命名為PEDV-LNCT2-S1-Fc，經(jīng)BCA 蛋白定量試劑盒測定該融合蛋白的濃度。將純化的蛋白經(jīng) SDS-PAGE 電泳后，以鼠抗 S1 蛋白MAb S5F7 (1∶500)作為一抗，以羊抗鼠IgG-DY800(1∶15 000)作為二抗，利用Odyssey 紅外熒光掃描成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描，對S1 蛋白進(jìn)行western blot 鑒定和分析。

1.3 間接ELISA 方法的建立及反應(yīng)條件的優(yōu)化采用方陣滴定法，確定間接ELISA 的S1 蛋白最佳抗原包被濃度 (6 μg/mL、 3 μg/mL、 1.5 μg/mL、0.75 μg/mL、0.325 μg/mL)，最佳血清稀釋度(1∶50、1∶100、1∶200、1∶400)，羊抗豬 IgA-HRP 二抗最佳稀釋度(1∶5 000、1∶10 000、1∶15 000、1∶20 000)，最佳孵育時(shí)間(30 min、45 min、60 min)，TMB 底物顯色液的最佳顯色時(shí)間(5 min、10 min、15 min)，建立檢測血清IgA 抗體的間接ELISA 方法。

1.4 臨界值的確定利用IFA 方法從實(shí)驗(yàn)室保存的豬血清中篩選出90 份陰性血清，按優(yōu)化后的間接ELISA 方法檢測該陰性血清，并設(shè)立陰性對照和陽性對照。將每份血清經(jīng)間接ELISA 檢測得到的OD450nm值轉(zhuǎn)換為樣品百分反應(yīng)活性(Percent reactivity，PR)，即(待檢血清 OD450nm值- 陰性血清 OD450nm值)/(陽性血清 OD450nm值 - 陰性血清 OD450nm值)，計(jì)算PR 值的平均值()和標(biāo)準(zhǔn)方差(SD)。當(dāng)樣品PR值 ＜+2SD 時(shí)，判為陰性；當(dāng)樣品 PR 值 ＞時(shí)，判為陽性；介于二者之間，判為疑似，需二次檢測，如果PR 值仍小于時(shí)則判為陰性。

1.5 特異性試驗(yàn)利用建立的間接ELISA 方法對本實(shí)驗(yàn)室制備的TGEV、PDCoV、PoRV 和PCV2 陽性血清進(jìn)行檢測，并設(shè)立PEDV 陽性、陰性血清對照，每份樣品設(shè)3 個(gè)重復(fù)。評估該ELISA 方法的特異性。

1.6 敏感性試驗(yàn)將PEDV 陽性血清經(jīng)2 倍倍比稀釋(1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600)后，按已建立的IgA 抗體的間接ELISA 方法操作，評估該ELISA 方法的敏感性。

1.7 重復(fù)性試驗(yàn)按本研究建立的IgA 抗體間接ELISA 方法操作，使用同批次包被的ELISA 板，對陽性、弱陽性和陰性血清各2 份，共6 份血清，每份血清重復(fù)6 孔，進(jìn)行批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)；以不同批次包被的ELISA 板，對該6 份血清進(jìn)行批間重復(fù)性試驗(yàn)，評估該方法的重復(fù)性。

1.8 臨床樣品的檢測利用本試驗(yàn)建立的間接ELISA 方法與文獻(xiàn)中報(bào)道的金標(biāo)準(zhǔn)IFA 方法[18]對來源于黑龍江、河南、山東等地142 份豬血清進(jìn)行檢測。比較兩種方法的檢測結(jié)果，并計(jì)算二者的符合率。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒的鑒定重組質(zhì)粒pAAV-LNCT2-S1-Fc 用EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定(S1 基因片段與Fc 基因片段分別為2 382 bp 和681 bp，融合片段約為3 000 bp)，結(jié)果顯示，在約3 000 bp 和6 200 bp處分別有兩條目的片段，與預(yù)期結(jié)果一致(圖1)。測序結(jié)果顯示重組質(zhì)粒無堿基缺失、突變，與目的片段序列一致。表明重組質(zhì)粒pAAV-LNCT2-S1-Fc 正確構(gòu)建。

圖1 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定Fig.1 Identification of recombinant plasmid pAAV-LNCT2-S1-Fc by double enzyme digestions

2.2 重組蛋白的SDS-PAGE 檢測和western blot鑒定將重組質(zhì)粒pAAV-LNCT2-S1-Fc 轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞，收集細(xì)胞的培養(yǎng)液上清，利用親和層析柱純化蛋白，經(jīng)BCA 蛋白定量試劑盒測定PEDV-LNCT2-S1-Fc 融合蛋白的濃度為6.25 μg/mL。將該融合蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 檢測和western blot 鑒定(利用The Sequence Manipulation Suite 軟件在線預(yù)測S1 蛋白和Fc 蛋白大小分別約為87 ku 和26 ku)。結(jié)果顯示在150 ku 處有目的條帶，與預(yù)期融合的S1 蛋白和Fc蛋白大小基本相符(真核表達(dá)的蛋白由于翻譯后的修飾使蛋白實(shí)際大小大于預(yù)期結(jié)果)(圖2A、2B)。結(jié)果表明，目的融合蛋白以分泌的形式表達(dá)，蛋白純化效果較好，且具有較好的反應(yīng)原性。

圖2 重組融合蛋白的SDS-PAGE(A)及western blot(B)鑒定Fig.2 SDS-PAGE (A)and western blot(B)analysis of recombinant protein PEDV-LNCT2-S1-Fc

2.3 間接ELISA 方法的建立及反應(yīng)條件的確定經(jīng)優(yōu)化，該方法的最佳反應(yīng)條件見表1。

2.4 間接ELISA 臨界值的確定應(yīng)用本研究優(yōu)化的ELISA 方法檢測90 份PEDV 陰性血清樣品。結(jié)果顯示，檢測數(shù)據(jù)經(jīng)計(jì)算平均值為8.8，標(biāo)準(zhǔn)方差SD 為 5.9，陰性臨界值+2SD 為20.6，陽性臨界值+3SD 為 26.5 (圖3)。當(dāng) PR 值大于 26.5，判定樣品為陽性；當(dāng)PR 值小于20.6，判定為陰性；當(dāng)PR 值介于20.6 和26.5 之間的樣品則判為疑似，若重復(fù)之后結(jié)果仍低于26.5 則判定為陰性。

表1 間接ELISA 檢測方法反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果Table 1 The optimized conditions of indirect ELISA

圖3 臨界值的確定Fig.3 The cut-off value determination

2.5 特異性試驗(yàn)結(jié)果利用建立的間接ELISA 方法對TGEV、PDCoV、PoRV 和PCV2 的陽性血清進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示PR 值均低于26.5，該方法的包被抗原S1 蛋白僅能與PEDV 陽性血清反應(yīng)，與其它幾種病毒陽性血清均無交叉反應(yīng)(圖4)。表明本研究建立的間接ELISA 方法具有較強(qiáng)的特異性。

圖4 間接ELISA 特異性試驗(yàn)Fig.4 Specificity test of the indirect ELISA

2.6 敏感性試驗(yàn)結(jié)果利用建立的間接ELISA 方法對2 倍倍比稀釋的PEDV 陽性血清進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示當(dāng)陽性血清400 倍稀釋時(shí)其PR 值仍大于26.5，為陽性(圖5)，而當(dāng)該陽性血清800 倍稀釋時(shí)，其PR 值25.9 小于26.5，結(jié)果為陰性，因此該間接 ELISA 的敏感性為 1 ∶400。表明所建立的ELISA 方法具有較高的敏感性。

圖5 敏感性試驗(yàn)結(jié)果Fig.5 Sensitivity test of the indirect ELISA

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果利用建立的IgA 抗體間接ELISA 方法，選取6 份臨床已知的陽性、弱陽性和陰性血清分別進(jìn)行批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)，對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果顯示，批內(nèi)和批間重復(fù)變異系數(shù)均小于10 % (表2)。表明本研究建立的間接ELISA 方法具有較好的重復(fù)性。

2.8 臨床樣品的檢測結(jié)果分別用建立的ELISA方法和IFA 對黑龍江、河南、山東等地的142 份豬血清進(jìn)行檢測，以IFA 為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算間接ELISA 與IFA 的符合率。結(jié)果顯示，IFA 共檢出57 份陽性血清，間接ELISA 方法共檢出55 份陽性血清， IFA檢出85 份陰性血清，間接ELISA 方法共檢出87 份陰性血清。經(jīng)計(jì)算間接ELISA 方法和IFA 的陽性符合率為96.5 %，陰性符合率為100 %，總符合率為98.6 % (表3)。表明本研究建立的間接ELISA 方法可以用于臨床樣品檢測。

表2 間接ELISA 重復(fù)性試驗(yàn)(n=6)Table 2 Repeatability assay for indirect ELISA (n=6）

表3 間接ELISA 方法與IFA 對臨床樣品的檢測結(jié)果Table 3 Comparisons of the detection result of iELISA and IFA

3 討 論

目前G2 型PEDV 廣泛流行，主要侵害豬的小腸組織，引起嚴(yán)重的腹瀉癥狀，基于腸道局部黏膜免疫的特點(diǎn)，IgA 抗體在該過程中發(fā)揮重要的作用，IgA 抗體水平的變化與疾病的進(jìn)程和機(jī)體的抗病毒能力具有相關(guān)性[9,11,13]。研究表明針對PEDV S1 蛋白的特異性IgA 抗體與機(jī)體免疫水平具有相關(guān)性[6,13]。基于以上的理論基礎(chǔ)，本研究以G2 型PEDV S1 蛋白為診斷抗原建立了特異性IgA 抗體間接ELISA 檢測方法，通過該方法能夠有效地反映臨床PEDV 的感染水平和免疫水平。

雖然基于PEDV 的S 蛋白、N 蛋白和M 蛋白作為包被抗原均能用于ELISA 方法的建立，但是S1蛋白具有多個(gè)中和表位，是刺激機(jī)體產(chǎn)生PEDV 特異性中和抗體的重要靶蛋白[6]。因此，本研究構(gòu)建了重組質(zhì)粒pAAV-LNCT2-S1-Fc，并利用真核表達(dá)系統(tǒng)獲得了具有雙重功能的融合蛋白LNCT2-S1-Fc，不僅具有S1 蛋白的功能，還引入了人源IgG Fc 片段，利于蛋白胞外分泌表達(dá)和純化[17]，并通過商品化親和層析柱獲得高純度、高濃度的目的蛋白。Western blot 結(jié)果顯示蛋白條帶單一，表明該融合蛋白特異性良好、生物活性高。由于真核表達(dá)系統(tǒng)能夠?qū)Φ鞍走M(jìn)行翻譯后修飾[16]，因此所獲得的蛋白大小大于預(yù)期S1 蛋白與Fc 蛋白的總和，其可以為后續(xù)ELISA 抗原包被及其它試驗(yàn)提供真核細(xì)胞修飾的S1 蛋白。

本研究以純化的S1 蛋白作為包被抗原，以羊抗豬IgA-HRP 作為二抗，采用方陣滴定法對ELISA 反應(yīng)條件進(jìn)行了的優(yōu)化，最終確定了IgA 間接ELISA檢測方法最佳的操作條件和步驟。根據(jù)臨床上廣泛采用的臨界值判定方法確定了該檢測IgA 抗體間接ELISA 方法的陰陽性臨界值，并依次對該方法進(jìn)行了特異性、敏感性和重復(fù)性試驗(yàn)。特異性試驗(yàn)顯示該間接 ELISA 方法對 PDCoV、TGEV、PoRV 和PCV2 陽性血清無交叉反應(yīng)，以PEDV-S1-Fc 融合蛋白為診斷抗原具有較強(qiáng)的特異性，為鑒別檢測PEDV IgA 抗體陽性樣品提供了可行的方法。敏感性試驗(yàn)與重復(fù)性試驗(yàn)表明該方法具有良好的敏感性和重復(fù)性。對現(xiàn)地血清樣品的檢測結(jié)果顯示，間接ELISA 方法與IFA 總符合率高達(dá)98.6 %。同時(shí)，IgA 抗體在機(jī)體免疫保護(hù)過程中發(fā)揮著重要的作用，因此，本研究建立的IgA 抗體間接ELISA 檢測方法能夠作為臨床樣品檢測和機(jī)體免疫保護(hù)水平監(jiān)測的有效方法。