張 玲，常 江，吳俐勤，裘罕琦，周沁怡，戴賢君，楊 華，夏效東，唐 標(biāo)*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西楊凌712100；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，浙江杭州310021；3.中國計(jì)量大學(xué)現(xiàn)代科技學(xué)院，浙江杭州310018；4.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇南京210095)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是一種常見的革蘭氏陽性食源性致病菌。因腸毒素、溶血毒素、殺白細(xì)胞素等外毒素的產(chǎn)生，而經(jīng)常引起食物中毒并在人類和動(dòng)物中引起各種感染[1]。目前，微生物鑒定方法主要為生化鑒定和分子生物學(xué)鑒定。生化鑒定對(duì)細(xì)菌的培養(yǎng)狀態(tài)有一定的要求，而分子生物學(xué)鑒定過程較繁瑣，技術(shù)要求高?；|(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(Matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)是一種基于蛋白指紋圖譜進(jìn)行微生物鑒定的新型技術(shù)[2-3]，與生化鑒定和分子生物學(xué)鑒定相比，MALDI-TOF MS 鑒定不依賴細(xì)菌的生化反應(yīng)，無需提取DNA，具有操作簡(jiǎn)單、通量高、靈敏度高、試劑耗材經(jīng)濟(jì)等優(yōu)勢(shì)，可以快速的區(qū)分和鑒定同一培養(yǎng)平板上未知細(xì)菌[4-5]。目前有研究表明MALDI-TOF MS 已經(jīng)成功應(yīng)用于沙門氏菌、大腸桿菌、阪崎克羅諾腸桿菌、S.aureus、彎曲桿菌等多種食源性致病菌的鑒定[6-7]。MALDI-TOF MS 作為一種新型的分類方法，具有快速、成本低等優(yōu)點(diǎn)，在細(xì)菌的聚類分析上同樣具有很大的潛力[8]。菌株的獲得是細(xì)菌耐藥性研究的前提，質(zhì)譜法對(duì)于純培養(yǎng)物的特定病原菌的鑒定和未知病原菌的發(fā)現(xiàn)具有明顯優(yōu)勢(shì)，是動(dòng)物源致病菌菌株庫建設(shè)的重要技術(shù)支撐。

可移動(dòng)元件是細(xì)菌介導(dǎo)耐藥基因轉(zhuǎn)移的重要載體，包括轉(zhuǎn)座子、質(zhì)粒和噬菌體等[9]。質(zhì)?？梢越閷?dǎo)多個(gè)耐藥基因?qū)Σ煌N類的抗生素耐藥，在S.aureus的耐藥性傳播中起主要作用。在動(dòng)物養(yǎng)殖和治療過程中，過量、不合理的使用抗生素，對(duì)耐藥基因具有選擇壓力，從而增加了耐藥質(zhì)粒轉(zhuǎn)移和重組概率，進(jìn)而誘發(fā)S.aureus多重耐藥的產(chǎn)生。特別是耐甲氧西林S.aureus(MRSA)，作為一種重要人畜共患病原體，不僅增加治療成本，同時(shí)威脅公共衛(wèi)生安全，是全球范圍的主要健康威脅之一[10-11]。因此，對(duì)養(yǎng)殖場(chǎng)的S.aureus的獸藥敏感性監(jiān)測(cè)非常必要，是指導(dǎo)養(yǎng)殖場(chǎng)合理用藥的重要依據(jù)。

本研究從養(yǎng)殖場(chǎng)生鮮乳中利用MALDI-TOF MS快速分離鑒定了S.aureus，并對(duì)其進(jìn)行了最低抑菌濃度(MIC)測(cè)定。從全基因組的角度，分析了獲得性耐藥基因，并對(duì)攜帶質(zhì)粒進(jìn)行了比對(duì)分析，初步解釋了介導(dǎo)其耐藥性的分子基礎(chǔ)，為奶牛場(chǎng)合理用藥和控制抗藥性提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料浙江省杭州市某奶牛場(chǎng)99 份生鮮牛乳樣品(50 份未患病奶牛牛乳、49 份患有隱腺乳房炎奶牛的牛乳)；質(zhì)控菌株為ATCC 29213(本實(shí)驗(yàn)室保藏)；緩沖蛋白胨水(BPW)、7.5 % NaCl肉湯、Baird-Parker 瓊脂、LB 瓊脂、卵黃亞碲酸鉀增菌劑購自北京陸橋技術(shù)有限公司；MALDI-TOF MS 基 質(zhì) ： α- 氰 基 -4 羥基肉桂酸 (4-Hydroxy-α-cyanocinnamic acid，HCCA)購自 Sigma 公司；基質(zhì)溶劑[乙腈(Acetonitrile，ACN)：水：三氟乙酸(Trifluoroacetic acid，TFA)的比例為 50：47.5：2.5]、蛋白標(biāo)準(zhǔn)品BTS (Bacteria Testing Standards)購自德國布魯克公司；2×TaqMaster Mix 和 DNA Marker 購自TaKaRa 公司；細(xì)菌基因組DNA 提取試劑購自上海捷瑞生物工程有限公司；Gel-red 核酸染料、50×TAE 緩沖液、葡萄球菌溶菌酶(Lysostaphin)購自生工生物工程(上海)股份有限公司；96 孔肉湯微量稀釋法藥敏板購自上海星佰生物技術(shù)有限公司；基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀購自德國布魯克·道爾頓公司。

基因檢索號(hào)：S.aureusSABHZ053 和SABHZ079基因組序列的檢索號(hào)分別為QZVV00000000、QZVW00000000；質(zhì)粒pSA053-1、pSA053-2、pSABHZ079-1、pSABHZ079-2 和 pSABHZ079-3 的檢索號(hào)分別為 NZ_CM011642、NZ_CM011643、NZ_CM011644、NZ_CM011645 和 NZ_CM011646。

1.2 S.aureus 的分離參考GB 4789.10-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》中的方法分離S.aureus。取1 mL 生鮮牛乳樣品加入10 mL 7.5 %的NaCl 肉湯中，37 ℃培養(yǎng)24 h；將增菌液劃線于Baird-Parker 瓊脂(每 95 mL加5 mL 的卵黃亞碲酸鉀增菌劑)，37 ℃培養(yǎng)24 h；挑取帶有透明圈和沉淀環(huán)的黑色單菌落-劃線于LB瓊脂上37 ℃培養(yǎng)24 h，其他疑似菌落于相同條件下劃線培養(yǎng)。

1.3 菌落的MALDI-TOF MS 鑒定分析將可疑單菌落均勻涂布至MALDI 靶板上的小孔中，加入1 μL 70 %的甲酸溶液破壁，自然晾干，再加入1 μL HCCA 基質(zhì)溶液覆蓋，自然晾干、結(jié)晶。使用儀器前，先用標(biāo)準(zhǔn)品BTS 校正，再進(jìn)行待測(cè)菌圖譜的采集。利用MALDI Biotyper RTC 軟件[12]進(jìn)行樣品指紋圖譜的自動(dòng)采集及分析，將采集的指紋圖譜與數(shù)據(jù)庫中的細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行比較，并給出相應(yīng)的分值，分值越高鑒定準(zhǔn)確的可信度越高，分值為2.3～3.0 表示完全可靠的鑒定到種水平，分值為2.0～2.299 表示鑒定到種水平，分值為1.7～1.9 表示鑒定到屬水平，分值在1.7 以下表示沒有可信的鑒定結(jié)果。根據(jù)Biotyper RTC 獲得的高質(zhì)量圖譜，利用MALDI Biotyper FlexAnalysis 軟件先對(duì)其指紋圖譜進(jìn)行基線校正、平滑，然后通過MALDI BioTyper 主成分分析(PCA)樹狀圖構(gòu)建方法，采用默認(rèn)參數(shù)構(gòu)建聚類分析樹。

1.4 S.aureus 16S rDNA 測(cè)序分析參照細(xì)菌基因組 DNA 提取試劑盒說明書提取S.aureus基因組DNA，利用溶葡菌酶破壁。抽取的基因組DNA 通過瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop ONE 進(jìn)行檢測(cè)，質(zhì)量合格后于-20 ℃保存?zhèn)溆?。利?6S rDNA 基因通用引物(27F：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG/1525R：AAGGAGGTGWTCCARCC)對(duì) 1.3 鑒定的S.aureus進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)條件為 94 ℃ 5 min；98 ℃10 s、57 ℃ 20 s、72 ℃ 60 s，共 35 個(gè)循環(huán)；PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，由杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果通過BLAST 比對(duì)鑒定。將測(cè)得的16S rDNA 基因序列用Clustal W 軟件進(jìn)行對(duì)位分析，采用MEGA X 軟件以最大似然法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，進(jìn)化樹分支模式的穩(wěn)定性分析采用bootstrap 方法，重復(fù)次數(shù)為1 000 次。

1.5 S.aureus 的藥敏試驗(yàn)根據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(Clinical And Laboratory Standards Institute，CLSI)2015 版 M100-S25 文件[13]，采用肉湯微量稀釋法測(cè)定S.aureus對(duì)18 種抗菌藥物的MIC，質(zhì)控菌株為ATCC 29213。同時(shí)利用mecA基因引物(mecAF： TCATAGCGTCATTATTCCAGG/mecAR：AATTTGTCTGCCAGTTTCTCCT)對(duì) 5 株S.aureus進(jìn)行PCR 擴(kuò)增鑒定，對(duì)兩種檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析。1.6 兩株S.aureus的全基因組測(cè)序及分析 利用Illumina Hiseq 測(cè)序平臺(tái)對(duì)兩株耐甲氧西林的S.aureus(SABHZ053 和SABHZ079)進(jìn)行全基因組測(cè)序，利用Velvet 軟件對(duì)序列組裝。利用ResFinder 3.1 軟件(https://cge.cbs.dtu.dk/services/ResFinder/)對(duì)耐藥基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，利用PlasmidFinder 2.0 軟件(https://cge.cbs.dtu.dk/services/PlasmidFinder/)進(jìn)行質(zhì)粒復(fù)制子類型的預(yù)測(cè)。預(yù)測(cè)到的質(zhì)粒序列經(jīng)PCR、測(cè)序和拼接后獲得完整質(zhì)粒序列，利用EasyFig 和BRIG 軟件對(duì)質(zhì)粒序列比較分析。

2 結(jié) 果

2.1 S.aureus 的分離結(jié)果從99 份生鮮牛乳樣品中共分離得到5 株S.aureus(分離率5.1 %)，均分離自患有隱性乳房炎的奶牛，未患病奶牛未分離到S.aureus。表明奶牛生鮮乳中S.aureus污染風(fēng)險(xiǎn)低，奶牛乳房炎不僅僅是由S.aureus引起的。

2.2 不同形態(tài)葡萄球菌的MALDI-TOF MS 鑒定利用MALDI-TOF MS 對(duì)Baird-Parker 瓊脂上的細(xì)菌進(jìn)行鑒定，與S.aureus具有相近形態(tài)的代表性菌落得到快速區(qū)分：SABHZ053 為S.aureus，其菌落為圓形、黑色、有光澤，周圍有混濁帶，外層有透明圈；SABHZ055 為表皮葡萄球菌(S.epidermidis)；SABHZ092 為克氏葡萄球菌(S.kloosii)；SABHZ088為馬胃葡萄球菌(S.equorum)；SABHZ041 為產(chǎn)色葡萄球菌(S.chromogenes)；SABHZ046 為糞腸球菌(Enterococcus faecalis)；SABHZ001 為模仿葡萄球菌(S.simulans)；SABHZ026 為溶血性葡萄球菌(S.haemolyticus)(圖1)。

圖1 Baird-Parker 瓊脂上不同形態(tài)的菌落Fig.1 Different forms of colonies on Baird-Parker agar

2.3 16S rDNA 與 MALDI BioTyper PCA 系統(tǒng)發(fā)育樹比較將分離獲得的5 株S.aureus、7 株其他葡萄球菌進(jìn)行 16S rDNA 聚類分析(圖2A)，同時(shí)采用MALDI-TOF MS 聚類分析(圖2B)，糞腸球菌作為外類群。兩種方法獲得的樹形具有較高的一致性，其中S.aureus均聚成一個(gè)分支，并且聚類分析樹在質(zhì)譜鑒定后即可獲得，速度上具有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，顯示出了MALDI-TOF MS 聚類分析的潛力。

圖2 16S rDNA 最大似然法系統(tǒng)發(fā)育樹(A)和質(zhì)譜PCA 樹狀圖(B)比較Fig.2 16S rDNA maximum likelihood tree (A)and MALDI BioTyper PCA dendrogram (B)

2.4 S.aureus 的藥敏試驗(yàn)PCR 擴(kuò)增證實(shí) SABHZ079、SABHZ053 兩株菌mecA基因陽性，均為耐甲氧西林S.aureus(MRSA)，其中SABHZ079 表現(xiàn)出7 重耐藥，SABHZ053 對(duì)2 種抗生素耐藥；但5 株S.aureus均對(duì)青霉素(PEN)耐藥(表 1)。

表 1 5 株 S.aureus 的 MICTable 1 MICs of five Staphylococcus aureus strains

2.5 菌株SABHZ053 和SABH079 的質(zhì)粒序列比較分析對(duì)菌株SABHZ053 和SABHZ079 進(jìn)行全基因組測(cè)序，測(cè)序深度分別為967X、887X。組裝獲得的基因組通過預(yù)測(cè)，兩株菌的MLST 基因型均為ST965。前者有2 個(gè)質(zhì)粒，后者有3 個(gè)質(zhì)粒(圖3)。

通過ResFinder 預(yù)測(cè)兩株分離株的耐藥基因分別為aph(3')-III、ant(6)-Ia、blaZ、mecA、tet(K)和blaZ，aph (3')-III、ant (6)-Ia、aph (2'')-Ia、mecA、blaZ、erm(B)、erm(C)、tet(K)。SABHZ053 的兩個(gè)耐藥基因tet(K)、blaZ分別存在于質(zhì)粒 pSA053-1(NZ_CM011642，4 439 bp)、pSA053-2(NZ_ CM011643，34 609 bp)中，而 SABHZ079 的 5 個(gè)耐藥基因aph(2'')-Ia、blaZ、erm(B)、erm(C)和tet(K)分別位于質(zhì)粒 pSABHZ079-1 (NZ_CM011644， 39 227 bp)、pSABHZ079-2 (NZ_CM011645， 2 473 bp)、 pSABHZ079-3(NZ_CM011646，4 439 bp)中(表 2)。存在于該兩株菌的質(zhì)粒pSABHZ079-3 和pSA053-1 中的tet(K)基因介導(dǎo)四環(huán)素類耐藥、pSABHZ079-1 和pSA053-2 中的blaZ基因?qū)η嗝顾啬退嶽14]，區(qū)別在于菌株 SABH079 的質(zhì)粒 pSABHZ079-1 中的aph(2'')-Ia基因?qū)c大霉素耐藥[15]，質(zhì)粒pSABHZ079-1 中的erm(B)基因和質(zhì)粒pSABHZ079-2 中的erm(C)基因?qū)Υ蟓h(huán)內(nèi)酯類ERY、CLI、TIL 耐藥起到主要作用[16-17](表2)。結(jié)果顯示，aph(2'')-Ia與erm(B)基因在質(zhì)粒pSABHZ079-1 中相對(duì)質(zhì)粒pSA053-2 是插入，在該兩個(gè)基因前可以預(yù)測(cè)到轉(zhuǎn)座酶，作為一個(gè)轉(zhuǎn)座單元介導(dǎo)大環(huán)內(nèi)脂和氨基糖苷類藥物的耐藥(圖3)。

通過與GenBank 數(shù)據(jù)庫比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，質(zhì)粒pSABHZ079-1 和pSA053-2 在已登錄的核酸序列中不存在與該兩個(gè)質(zhì)粒完全匹配的質(zhì)粒。將檢索獲得的同源質(zhì)粒與pSABHZ079-1 進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)該質(zhì)粒可明顯分為骨架I 和骨架II 兩部分(圖4)。質(zhì)粒pSA053-2、pN315(AP003139，24 653 bp)、pWBG752(GQ900394， 24 654 bp)、 pNCCP14558 (CP013954，24 729 bp)、 pNCCP14562 (CP013956， 24 657 bp)、pTZ2162 (AB304512，35 380 bp)與 pSABHZ079-1 骨架I 的核酸序列同源性平均為99.8%(大小為24.6 kb)，且均來源于S.aureus；質(zhì)粒 pFORC59 (CP020355，35 269 bp)、 pFORC_039 (CP015818， 35 415 bp)、pNTUH_3874 (LC102479， 14 566 bp)、 pMCCL2(AP009486，80 545 bp)與該質(zhì)粒骨架II 的核酸序列同源性平均為99.9 % (大小為14.5 kb)，該骨架包含Tn551-erm(B)-aph(2'')-Ia轉(zhuǎn)座單元。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)質(zhì) 粒 pN315、 pWBG752、 pNCCP14558、 pNCCP14562 與質(zhì)粒的pSABHZ079-1 骨架 I 全長(zhǎng)匹配；pNTUH_3874 與該質(zhì)粒的骨架II 全長(zhǎng)匹配，推斷質(zhì)粒pSABHZ079-1 可能是分離自臨床的pNTUH_3874與pN315 或其相似質(zhì)粒雜合而來(圖4)。

表2 菌株SABHZ053 和SABHZ079 的耐藥譜與耐藥基因Table 2 Antimicrobial resistance profiles and genes of strain SABHZ053 and SABHZ079

圖3 菌株SABHZ053 和SABHZ079 耐藥質(zhì)粒的比較分析Fig.3 Comparative analysis of plasmids between SABHZ053 and SABHZ079 strains

3 討 論

本研究從杭州某奶牛場(chǎng)生鮮乳中分離葡萄球菌，通過MALDI-TOF MS 快速鑒定得到5 株S.aureus，且均來自患有隱形乳房炎的奶牛。這表明該奶牛場(chǎng)S.aureus的污染程度不高，S.aureus的存在是導(dǎo)致奶牛患隱形乳房炎的原因之一。對(duì)其中5 株S.aureus和7 株葡萄球菌通過MALDI BioTyper 軟件的PCA 分析進(jìn)行了樹形圖的構(gòu)建，發(fā)現(xiàn)該樹形圖和16S rDNA 系統(tǒng)發(fā)育樹一致性較高。該方法在動(dòng)物源病原菌的分離鑒定和分型過程中顯示出速度優(yōu)勢(shì)。通過質(zhì)譜鑒定，可以快速判斷是否為目標(biāo)菌株，同時(shí)也獲得了其他非目標(biāo)菌株的種屬，有利于致病菌菌株庫的構(gòu)建。

圖4 質(zhì)粒pSABHZ079-1 與同源質(zhì)粒的比較分析Fig.4 Comparative analysis of plasmid pSABHZ079-1 with homologous plasmids

藥敏結(jié)果顯示，5 株S.aureus均對(duì)青霉素耐藥，其中 2 株S.aureus對(duì)頭孢西丁耐藥，其中 SABHZ079 對(duì)7 種抗生素耐藥。養(yǎng)殖場(chǎng)抗生素的不合理使用容易引發(fā)致病菌多重耐藥，不僅給動(dòng)物治療帶來了困難，同時(shí)還會(huì)威脅人類健康。指導(dǎo)養(yǎng)殖場(chǎng)合理的使用抗生素是遏制細(xì)菌耐藥性的關(guān)鍵一環(huán)，因此針對(duì)致病菌的藥敏監(jiān)測(cè)非常重要。

頭孢西丁可以作為苯唑西林耐藥性檢測(cè)的替代物，可以根據(jù)頭孢西丁結(jié)果判斷細(xì)菌對(duì)苯唑西林敏感或耐藥[13]。在此研究中分離獲得的S.aureus通過藥敏試驗(yàn)后，僅對(duì)頭孢西丁具有抗性的菌株通過PCR 驗(yàn)證，確認(rèn)兩株為MRSA。分離得到的兩株MRSA 菌株的基因型同為ST965，在臨床樣品中也發(fā)現(xiàn)存在這一類型[9]。兩株菌含有一個(gè)相同的質(zhì)粒，還存在與該兩個(gè)質(zhì)粒同源性較高的質(zhì)粒，區(qū)別在于這兩個(gè)質(zhì)粒一個(gè)質(zhì)粒含有耐藥基因erm(B)，一個(gè)含有aph(2'')-Ia的轉(zhuǎn)座元件。相比菌株 SABHZ053，SABHZ079 多了一個(gè)2.4 kb 的質(zhì)粒，攜帶有erm(C)。erm(B)和erm(C)均可以介導(dǎo)S.aureus對(duì)大環(huán)內(nèi)脂類耐藥[16-18]，在本研究中兩株菌對(duì)紅霉素、克林霉素和替米考星耐藥，上述兩個(gè)基因哪一個(gè)占主導(dǎo)作用還不明確。另外，相比菌株SABHZ053，SABHZ079 插入的aph(2'')-Ia基因應(yīng)該明確為介導(dǎo)慶大霉素耐藥的因素。在質(zhì)粒的同源性比較中發(fā)現(xiàn)，分離測(cè)序獲得的pSABHZ079-1 質(zhì)粒是全新的質(zhì)粒，從質(zhì)粒的比對(duì)來看，它由兩個(gè)分離自人源樣本的S.aureus全長(zhǎng)質(zhì)粒雜合而來。這進(jìn)一步體現(xiàn)了該奶牛場(chǎng)S.aureus攜帶耐藥質(zhì)粒傳播與變異的復(fù)雜性。表明質(zhì)粒是造成該奶牛場(chǎng)S.aureus耐藥的重要原因，而轉(zhuǎn)座插入又增加了耐藥基因傳播的風(fēng)險(xiǎn)。

該實(shí)驗(yàn)過程中分離獲得的其它葡萄球菌目前未做藥敏實(shí)驗(yàn)，耐藥情況未知，但其無疑是重要的耐藥質(zhì)?；蚧驍y帶菌[19]，與S.aureus會(huì)彼此水平傳播耐藥基因。本實(shí)驗(yàn)室將會(huì)針對(duì)奶牛場(chǎng)葡萄球菌的耐藥組和質(zhì)粒組進(jìn)行深入研究。