高曉藝，韓 燾，王乃迪，王傳彬，楊 林，王新杰，高姍姍，孫曉明，胡祥鈺，石玉祥，劉玉良*

(1.中國動物疫病預(yù)防控制中心，北京102618；2.河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，河北邯鄲056021；3.北京億森寶生物科技有限公司，北京100025)

高致病性禽流感(Highly pathogenic avian influenza，HPAI)是由部分H5 或H7 亞型禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)引起多種禽類急性感染和死亡的一種烈性傳染病，被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)列為法定報告動物疫病，在我國被列為一類動物疫病。在國務(wù)院發(fā)布的《國家中長期動物疫病防治規(guī)劃(2012～2020年)》 中，將其列為優(yōu)先防治和重點防范的5 種一類動物疫病之一。AIV 基因組為分節(jié)段單股負(fù)鏈 RNA，目前已發(fā)現(xiàn)其有 16 種 H 亞型(H1～H16)和 9 種 N 亞型(N1～N9)[1]，研究發(fā)現(xiàn)，HPAIV 包含H5 和H7 兩種亞型，對禽類具有高致病力，可引起禽流感的暴發(fā)和流行[2-3]。在我國，H5N1 亞型禽流感于1996年在廣東首次報道后，每年均引發(fā)數(shù)起疫情[4]。該亞型病毒于1997年在中國香港首次直接感染人并發(fā)生致人死亡事件，之后一直備受廣泛關(guān)注[5]。流行病學(xué)監(jiān)測結(jié)果表明，近年來以H5N6 亞型HPAIV 為主的2.3.4.4 分支病毒在我國為優(yōu)勢流行株，分離率高，造成多起疫情，危害十分嚴(yán)重[6]。而且，測序結(jié)果分析表明，該亞型病毒已發(fā)生變異，導(dǎo)致目前所用的H5 (Re-8)+H7(Re-1)二價疫苗不能提供充分保護(hù)(未發(fā)表數(shù)據(jù))。2013年，我國首次報道H7N9 亞型AIV 致人死亡事件，引發(fā)高度關(guān)注[7]。截止目前，高致病性H7N9亞型AIV 已在我國不同類型和不同規(guī)模的養(yǎng)禽場中造成14 起疫情，經(jīng)濟損失嚴(yán)重[8-9]。

本實驗室前期監(jiān)測結(jié)果顯示，H7N9 AIV 部分毒株的HA 裂解位點與以往毒株相比，插入了多個堿性氨基酸(如PEVPKRKRTAR/GL)，表明該病毒已突變?yōu)镠PAIV (數(shù)據(jù)未發(fā)表)，另外，國家禽流感參考實驗室和其它多家單位也已監(jiān)測和分離到多株H5和H7 亞型HPAIV 毒株。精準(zhǔn)快速的檢測和鑒別診斷是有效防控動物疫病的前提和基礎(chǔ)。目前，對于H5 和H7 亞型AIV 檢測，利用SPF 雞胚分離和增殖病毒的方法存在耗時長、生物安全風(fēng)險大、SPF 雞胚來源受限等缺點；而ELISA 方法特異性和靈敏度較低，容易出現(xiàn)假陰性；普通RT-PCR 方法是AIV檢測的重要手段[10]，但是，該方法存在操作繁瑣、檢測時間長且易污染等弊端。目前，市場上缺乏對以上兩種亞型HPAIV 毒株鑒別檢測的成熟技術(shù)。鑒于此，本研究通過優(yōu)化反應(yīng)條件，建立了快速、精準(zhǔn)、靈敏度高、便攜、可用于基層現(xiàn)場檢測，并且可有效鑒別檢測H5 和H7 兩種亞型HPAIV 的新型凍干微芯片“雙重”熒光定量RT-PCR 檢測方法。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料H5N1 亞型HPAIV、H5N1 亞型LPAIV、H7N9 亞型HPAIV、H7N9 亞型低致病性禽流感病毒(LPAIV)、H9N2 亞型AIV、H6N1 亞型AIV、H1N1 甲型流感病毒、H3N2 亞型AIV，雞傳染性貧血病毒(Chicken infectious anemia virus，CIAV)、禽傳染性喉氣管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus，ILTV)、雞滑液囊支原體(Mycoplasma synoviae，MS)、雞毒支原體(Mycoplasma galliscepticum，MG)、禽腺病毒(Avian adenovirus，AAV)、沙門氏菌(Salmonella)，均由中國動物疫病預(yù)防控制中心實驗室保存，其中H5N1 和H7N9 亞型HPAIV均已滅活；新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)、禽傳染性支氣管炎病毒(Infectious bronchitis virus，IBV)、傳染性法氏囊病毒(Infectious bursal disease virus, IBDV)、禽腦脊髓炎病毒(Avian encephalomyelitis virus，AEV)均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心。Dream-TaqTMHot Start DNA Polymerase、Maxima H Minus Reverse Transcriptase 購自 Thermo Scientific 公司；海藻糖購自北京百奧萊博科技有限公司；RNA 提取試劑盒和AriaYSB 微芯片、總DNA 提取試劑盒均購自北京億森寶生物科技有限公司。30 份組織、血清和咽肛拭子臨床樣品分別采自湖北省(樣品編號A1～C1)、重慶市(樣品編號C2-C11)和湖南省(樣品編號C12-C21)3 個養(yǎng)雞場。8 份AIV 陽性樣品由本實驗室鑒定保存。

1.2 引物、TaqMan-MGB 探針的設(shè)計根據(jù)已報道 的 H5 (MK046067.1)和 H7 亞 型 (MF455308.1)HPAIV HA 基因 ORF 序列及 HA 基因裂解位點序列，設(shè)計多對引物和探針。經(jīng)過反復(fù)比對篩選，確定一組最佳引物和一條TaqMan-MGB 探針(表1)。其中H5 亞型的探針報告基因為FAM，H7 亞型的探針報告基因為ROX。

表1 擴增HA 基因所用引物和探針Table 1 Primers and probes used for amplification of HA gene

1.3 病毒基因組的提取利用總RNA 提取試劑盒提取病毒基因組RNA，病毒包括：H5N1 亞型HPAIV、H5N1 亞 型 LPAIV、H7N9 亞 型 HPAIV、H7N9 亞 型 LPAIV、H9N2 亞型 AIV、H6N1 亞 型AIV、H1N1 甲型流感病毒、H3N2 亞型AIV、NDV、IBV、IBDV、AEV。利用總DNA 提取試劑盒提取病原基因組DNA，病原包括： CIAV、ILTV、MS、MG、AAV、Salmonella。將提取的核酸置于冰上立即用于熒光RT-PCR 擴增，或暫放于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 凍干微芯片反應(yīng)體系的優(yōu)化采用方陣法對反應(yīng)體系的引物和探針濃度(0.1 μmol/L、0.2 μmol/L、0.3 μmol/L、0.4 μmol/L、0.5 μmol/L)、Mg2+濃度(1 mmol/L、2 mmol/L、3 mmol/L、4 mmol/L)、反轉(zhuǎn)錄酶及HotStartTaqDNA 聚合酶終濃度(0.3 U/μL、0.5 U/μL、1 U/μL、2 U/μL)等進(jìn)行了優(yōu)化。擴增反應(yīng)體系和程序優(yōu)化如下：反轉(zhuǎn)錄溫度設(shè)為50 ℃，時間分別為5 min、10 min、20 min、30 min；預(yù)變性設(shè)為95 ℃，時間分別為1 min、3 min、5 min 及10 min；循環(huán)次數(shù)分別為35 個循環(huán)、40 個循環(huán)、45個循環(huán)。預(yù)變性溫度為95 ℃，時間分別為3 s、5 s、10 s、15 s，隨后設(shè)置退火及延伸溫度為55 ℃和60 ℃，時間分別為15 s、30 s、45 s、60 s，在此步驟收集熒光信號。利用上述不同參數(shù)，對凍干微芯片體系進(jìn)行優(yōu)化。凍干微芯片上樣孔為30 個，將所有反應(yīng)試劑充分混勻后以1.2 μL/ 孔加入微芯片孔。根據(jù)樣品量情況，在配制反應(yīng)液時需多配制2～3 個樣品的反應(yīng)液母液，以保證反應(yīng)液足夠。將加有有RT-PCR 反應(yīng)試劑的微芯片先置于-80 ℃冷凍1 h，然后凍干：先將隔板溫度下降至-55 ℃，預(yù)凍1 h；然后設(shè)備開啟抽真空，保持冷凍干燥1 h；解析干燥階段，將隔板溫度升至-25 ℃保持1 h；然后將隔板溫度升至37 ℃并保持2 h；最后將隔板降至25 ℃并保持1 h。

1.5 凍干微芯片特異性試驗利用優(yōu)化后的凍干微芯片雙重?zé)晒釸T-PCR 反應(yīng)條件和程序檢測H5 和H7 亞型 HPAIV、H5 和 H7 亞型LPAIV，利用相同反應(yīng)條件同時檢測H9N2 AIV、H6N1 AIV、H1N1甲型流感病毒、H3N2 AIV、NDV、IBV、IBDV、AEV、CIAV、ILTV、MS、MG、AAV 和沙門氏菌。以無核酸酶滅菌雙蒸水作為陰性對照。每個循環(huán)延伸結(jié)束時，采集熒光信號，分析本研究所建立的方法的特異性。

1.6 凍干微芯片敏感性試驗將1×107TCID50/mL的 H5 和 H7 亞型HPAIV 10 倍倍比稀釋后，取 1×100TCID50/mL～1×106TCID50/mL 共 7 個不同濃度分別提取基因組RNA 作為模板，以無核酸酶滅菌雙蒸水作為陰性對照，采用建立的凍干微芯片雙重?zé)晒舛縍T-PCR 方法檢測。同時，根據(jù)本實驗室摸索建立的條件，用同樣稀釋的相同模板進(jìn)行常規(guī)熒光定量RT-PCR 擴增(表2)，以確定和比較兩種檢測方法的敏感性。

常規(guī)熒光定量RT-PCR 反應(yīng)：50 ℃30 min，95 ℃5 min、95 ℃ 15 s、60 ℃ 45 s，40 個循環(huán)，每個循環(huán)結(jié)束時進(jìn)行熒光信號采集和檢測。

1.7 重復(fù)性試驗利用本研究所建立的方法初步組裝成試劑盒，選用同一批次的8 個檢測試劑盒對8份AIV 陽性樣品常規(guī)處理后進(jìn)行檢測，評價其批內(nèi)重復(fù)性；選用3 個不同批次的試劑盒對同樣8 份陽性樣品進(jìn)行檢測，評價其批間重復(fù)性。樣本標(biāo)準(zhǔn)差代表所采用的樣本X1、X2...Xn 的均值；變異系數(shù)CV=(標(biāo)準(zhǔn)差SD/平均值)×100 %。

表2 常規(guī)熒光定量RT-PCR 反應(yīng)體系配制表Table 2 Preparation of conventional real-time RT-PCR reaction system

1.8 臨床樣品的檢測將采自湖北省(樣品編號A1～C1)、重慶市(樣品編號C2-C11)和湖南省(樣品編號C12-C21)3 個養(yǎng)雞場共30 份組織、血清和咽肛拭子臨床樣品經(jīng)常規(guī)處理后利用上述1.3 中核酸提取方法提取總RNA 為模板，利用本研究所建立的凍干微芯片雙重?zé)晒釸T-PCR 方法對提取的總RNA 進(jìn)行擴增檢測和比較分析。同時，利用本實驗室建立的常規(guī)熒光定量RT-PCR 方法對HA 基因進(jìn)行擴增鑒定和測序驗證。樣品信息見表5。

2 結(jié) 果

2.1 檢測體系優(yōu)化結(jié)果通過比較，確定本研究凍干微芯片檢測方法的最佳反應(yīng)條件如表3 所示。

反應(yīng)最佳條件為：50 ℃ 10 min；95 ℃ 1 min；95 ℃ 5 s，60 ℃15 s，40 個循環(huán)，每個循環(huán)延伸結(jié)束時，采集熒光信號和檢測。

2.2 特異性檢測結(jié)果利用本實驗建立的方法檢測H5 和H7 亞型HPAI HA 基因，同時應(yīng)用該方法檢測其它禽病病原。結(jié)果顯示，僅在H5 亞型HPAIV及H7 亞型HPAIV 出現(xiàn)特異性擴增曲線峰，Ct 值分別為18.86 和25.96，而其它亞型AIV 和禽病病原，以及陰性對照均未有擴增曲線出現(xiàn)(圖1)。表明該方法具有較強的特異性。

2.3 敏感性檢測結(jié)果將H5 亞型HPAIV 10 倍倍比稀釋后，利用本研究建立的方法進(jìn)行敏感性檢測，結(jié)果顯示，該方法檢測下限為病毒濃度為1×101TCID50/mL，Ct 值為 32.79 (圖2A)；而常規(guī)熒光定量 RT-PCR 檢測的最低病毒濃度為 1 ×102TCID50/mL，Ct 值為30.97 (圖2B)。表明凍干微芯片雙重?zé)晒舛縍T-PCR 方法敏感性比常規(guī)熒光定量RT-PCR 約高10 倍。H7 亞型HPAIV 敏感性結(jié)果同H5 亞型(圖略)。

通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖分析結(jié)果顯示，凍干微芯片雙重?zé)晒舛縍T-PCR 擴增效率為107.00 % (A)，而常規(guī)熒光定量RT-PCR 擴增效率為89.96 % (B)，表明本研究所建立的方法的擴增效率比常規(guī)熒光定量RT-PCR 高。兩種方法所對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線公式及相關(guān)系數(shù)均較接近，兩種方法的相關(guān)系數(shù)均為0.997 (圖3)。H7 亞型 HPAIV 結(jié)果相似(圖略)。

表3 凍干微芯片雙重?zé)晒舛縍T-PCR 反應(yīng)體系Table 3 The lyophilized microchip duplex real-time RT-PCR reaction system

2.4 重復(fù)性檢測結(jié)果利用所建立的方法進(jìn)行批內(nèi)和批間重復(fù)性檢測，結(jié)果顯示，批內(nèi)(0.42%～0.92%)及批間(0.08 %～1.45 %)變異系數(shù)均＜2 % (表 4)，表明該試劑盒具有較好的重復(fù)性。

2.5 臨床樣品檢測結(jié)果利用所建立的凍干微芯片雙重?zé)晒釸T-PCR 方法，對采集的經(jīng)常規(guī)方法處理后的30 份臨床樣品提取基因組進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示有15 份樣品為H5 和H7 亞型HPAIV，15 份樣品為陰性。樣品信息和檢測結(jié)果分別見表5 和圖4。所有30 份樣品均用普通RT-PCR 擴增HA 基因ORF，然后將擴增產(chǎn)物電泳和純化后，測序驗證(結(jié)果略)。結(jié)果顯示，凍干微芯片雙重?zé)晒釸T-PCR 方法檢測結(jié)果與普通RT-PCR 檢測結(jié)果以及測序結(jié)果完全一致。表明本研究建立的凍干微芯片雙重?zé)晒釸T-PCR 方法可用于H5 和H7 亞型HPAIV 臨床鑒別檢測。

圖1 H5 和H7 亞型HPAIV 特異性檢測結(jié)果Fig.1 Specificity of H5 and H7 HPAIV detection

圖2 凍干微芯片熒光RT-PCR(A)和常規(guī)熒光定量RT-PCR (B)敏感性檢測結(jié)果Fig.2 Sensitivity test of the lyophilized microchip duplex real-time RT-PCR (A)and conventional real-time RT-PCR (B)

圖3 兩種方法檢測H5 亞型HPAIV 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of H5 HPAIV detection by lyophilized microchip duplex real-time RT-PCR and conventional real-time RT-PCR

表4 批內(nèi)和批間重復(fù)性檢測結(jié)果Table 4 Results of repeatability test

3 討 論

目前，熒光定量RT-PCR 方法在H5 和H7 亞型AIV 檢測中得到廣泛應(yīng)用，但所報道的常規(guī)熒光定量RT-PCR 方法一般只檢測H5 或H7 亞型，不能同時檢測兩種亞型。另外，所用試劑需在冷凍或低溫條件下保存運輸，所用儀器設(shè)備體積大，沉重不便攜帶，價格昂貴，這些缺點均限制了該方法的現(xiàn)場檢測和應(yīng)用?；谝陨犀F(xiàn)實情況，本研究設(shè)計合成了 H5 和 H7 亞型 HPAIV 特異性引物和TaqMan-MGB 探針，首先建立雙重?zé)晒舛縍T-PCR 方法，并采用本實驗室已建立成熟的凍干技術(shù)，將PCR 反應(yīng)試劑凍干在微芯片上，最終首次摸索建立了凍干微芯片雙重?zé)晒舛縍T-PCR 檢測方法。該方法可同時檢測H5 和H7 兩種亞型HPAIV，為“雙重”熒光定量RT-PCR 檢測方法。

表5 臨床樣品信息和檢測結(jié)果Table 5 Clinical samples and result of testing

圖4 臨床樣品檢測擴增峰圖Fig.4 Results of clinical sample detection

應(yīng)用本研究所建立的方法，對HPAIV、LPAVI、NDV、IBV、IBDV 等15 種常見禽病病毒以及MS、MG、沙門氏菌等病原體進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，所建立的方法可特異性檢測出H5 或H7 亞型禽流感病毒，可見特異性擴增曲線峰，而對其它所有病原體檢測結(jié)果均為陰性，無任何特異擴增曲線峰。因此，該方法具有較強的特異性。王振全等建立了可同時檢測H5 亞型HPAIV、狂犬病病毒、豬鏈球菌2 型等6 種病原的雜交基因芯片檢測方法，檢測的靈敏度在 1.38×10-5pg/μL～151 pg/μL 之間，略高于常規(guī)熒光定量RT-PCR 方法[11]。本研究建立的方法最低可檢測到1×101TCID50/mL 的AIV，比常規(guī)熒光定量RT-PCR 檢測方法高約10 倍，因此本研究建立的方法與已報道的基因芯片檢測方法在敏感性上類似或略高，完全達(dá)到常規(guī)檢測的要求。推測本研究方法因擴增反應(yīng)體積非常小(＜2 μL)，而且 PCR 反應(yīng)室的芯片為特制材料，不同于普通塑料，反應(yīng)時升降溫迅速，溫控好，芯片內(nèi)溫度均勻，因此，在反應(yīng)中酶的活性能更充分地發(fā)揮，最終使得反應(yīng)體系的擴增效率和敏感性更高，反應(yīng)過程也更穩(wěn)定。此外，本研究選取8 份陽性樣本，利用同一批次和不同批次的試劑盒，對陽性樣本進(jìn)行檢測，分析檢測結(jié)果，評價其批內(nèi)和批間重復(fù)性檢測情況。結(jié)果顯示，批內(nèi)和批間重復(fù)性檢測的變異系數(shù)均＜2 %，表明該方法的重復(fù)性好。最后，本研究對30 份臨床樣品進(jìn)行了檢測，結(jié)果與普通RT-PCR 和測序結(jié)果完全一致，證實該方法可在基層用于臨床樣品現(xiàn)場檢測。因此，該檢測方法克服了傳統(tǒng)檢測方法的缺點，具有單管封閉操作防污染、自動化程度高、特異性強、靈敏度高、操作簡便、耗時少、可實時監(jiān)控等優(yōu)點。

核酸分析是微芯片在熱循環(huán)期間同時讀取在每個反應(yīng)器上由PCR 產(chǎn)物產(chǎn)生的熒光信號，本研究采用的微芯片技術(shù)不同于目前常用的塑料PCR 管作為載體盛載PCR 反應(yīng)體系，而是采用金屬載體微芯片，反應(yīng)體系及樣本直接加到金屬載體上進(jìn)行RT-PCR 擴增。金屬載體熱傳導(dǎo)效率和升降溫速率快，可大幅度縮短反應(yīng)時間，而且，一次反應(yīng)可同時檢測30 個樣品。本研究結(jié)果顯示，所建立的檢測方法運行時間不到40 min，而常規(guī)熒光定量RT-PCR 反應(yīng)時間一般約為120 min，因此，該方法大大縮短了反應(yīng)時間，將運行時間縮短約2/3；另外，該檢測方法所需的反應(yīng)體系最少僅為1.2 μL，只需微量試劑和病毒核酸即可檢測，而常規(guī)熒光定量RT-PCR 反應(yīng)體系一般為20 μL 左右，因此，與常規(guī)熒光定量RT-PCR 相比，反應(yīng)體系縮小了近20倍；所需的擴增反應(yīng)試劑因已凍干，無需冰凍，可方便地進(jìn)行常溫保存和運輸至基層應(yīng)用，解決了常規(guī)方法中試劑需低溫保存運輸以及試劑反復(fù)凍融可能會影響檢測結(jié)果的問題，因此，該方法非常適用于基層養(yǎng)殖場現(xiàn)場檢測。另外，該方法可同時檢測H5 和H7 亞型AIV，大大減少了成本和人力。所配套的熒光RT-PCR 循環(huán)儀體積小、重量輕，僅約2.5 kg，便于隨身攜帶進(jìn)行現(xiàn)場檢測。

綜上所述，本研究通過設(shè)計和優(yōu)化特異性引物和探針，巧妙地將雙重?zé)晒釸T-PCR 技術(shù)、凍干技術(shù)以及微芯片技術(shù)相結(jié)合，最終建立了可有效鑒別檢測H5 亞型和H7 亞型HPAIV 的新型檢測方法。應(yīng)用該技術(shù)對臨床采集的樣品進(jìn)行檢測后證實，該方法敏感、特異、簡便、快速，具有廣闊的市場開發(fā)和應(yīng)用前景。