孫必強(qiáng)　李美珍　李果麗　周英　陳志勇　陳妍焰　詹育和

【摘 要】目的：探討大承氣湯對腸源性膿毒血癥大鼠免疫功能的影響。方法：60只SD大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、大承氣湯5g/kg組、大承氣湯10g/kg組、激素組和假手術(shù)組，其中采用經(jīng)典的盲腸結(jié)扎穿刺法復(fù)制腸源性膿毒血癥大鼠模型。正常組、模型組和假手術(shù)組生理鹽水灌胃，大承氣湯5g/kg組、大承氣湯10g/kg組、激素組0.5mg/kg分別灌胃對應(yīng)藥物，所有動物給藥體積為10mL/kg，連續(xù)7d。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后8h，獲取大鼠外周血血清，采用ELISA 法測IgA、IgG、IgM水平，然后解剖大鼠，分離胸腺和脾臟，計(jì)算胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)。結(jié)果：大承氣湯能提高外周血血清IgA、IgG、IgM水平，提高模型動物胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)。結(jié)論：大承氣湯可對膿毒血癥大鼠有免疫調(diào)節(jié)和免疫保護(hù)作用。

【關(guān)鍵詞】 大承氣湯;腸源性膿毒血癥;免疫功能

【中圖分類號】R285.5 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號】1007-8517（2019）15-0013-03

大承氣湯由大黃、芒硝、厚樸和枳實(shí)4味中藥組成，方中大黃為君藥，行瀉熱通便之效;芒硝為臣藥，行瀉熱軟堅(jiān)潤燥之效，助大黃通腑實(shí)積滯;枳實(shí)、厚樸共為佐使藥，有行氣散結(jié)，消痞除滿之效，共助大黃、芒硝蕩滌腸中積滯。全方用藥雖少，但其峻下熱結(jié)功效顯著，主治陽明腑實(shí)證、熱結(jié)旁流以及里熱實(shí)證之熱厥、痙病或發(fā)狂等。中醫(yī)學(xué)中并無膿毒血癥之謂，但究其臨床特點(diǎn)，其病機(jī)主要是熱毒積阻，氣血瘀滯，治宜清熱解毒，通腑利氣，活血化瘀。因此，大承氣湯對膿毒血癥有比較好的治療價值[1-2]，并進(jìn)行了相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究。

膿毒血癥是一種由感染引起的全身性炎癥反應(yīng)，且伴隨感染出現(xiàn)的器官功能性損害的臨床綜合征[3-4]。膿毒血癥發(fā)生過程中，炎癥級聯(lián)反應(yīng)啟動，刺激誘發(fā)細(xì)胞因子風(fēng)暴，多種促炎性細(xì)胞因子和抑炎細(xì)胞因子被激活，大量淋巴細(xì)胞被誘導(dǎo)凋亡，導(dǎo)致機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)機(jī)能紊亂，甚至被抑制[5-6]。在膿毒血癥病理過程中，免疫細(xì)胞過度激活和淋巴細(xì)胞受抑制的持續(xù)存在，會導(dǎo)致機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)機(jī)能和淋巴細(xì)胞的分泌和增殖功能受到抑制，持續(xù)造成組織和器官損傷[7]。本次實(shí)驗(yàn)旨在探討大承氣湯對膿毒血癥大鼠的免疫功能影響作用，探討和分析其內(nèi)在的機(jī)理。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動物 SPF級SD大鼠，雌雄各半，體重180～220g，購自湖南斯萊達(dá)景克實(shí)驗(yàn)動物有限公司（許可證號：SCXK（湘） 2014-0003）。

1.2 藥物 大承氣湯藥物按大黃：厚樸：枳實(shí)：芒硝體質(zhì)量比4∶5∶5∶3組成。藥材用蒸餾水清洗3次，再蒸餾水中浸泡30min，武火將厚樸、枳實(shí)武火煮沸20min后，改用文火煎煮10min，再加入大黃續(xù)煎10min后澄取煎液，頭煎和復(fù)煎液混勻，芒硝倒入，充分融化，用四層無菌紗布過濾，55℃水浴濃縮至含生藥1.0g/mL，置4℃冰箱保存?zhèn)溆?。醋酸潑尼松片，國藥?zhǔn)字H33021207，批號：150117，浙江仙琚制藥股份有限公司生產(chǎn)。

1.3 儀器和試劑 GHP-9160隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒公司生產(chǎn)），分析天平（湖南湘儀公司），臺式變頻TGL16M型高速冷凍離心機(jī)（長沙科威實(shí)業(yè)有限公司），ELISA 酶標(biāo)儀（Thermo公司），IgA、IgG、IgM ELISA試劑盒（上海研謹(jǐn)生物科技有限公司）。

2 方法

2.1 腸源性膿毒癥模型制備[8] 參照經(jīng)典的盲腸結(jié)扎穿刺法（ceca ligation and puncture，CLP）復(fù)制動物模型，2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠后，大鼠板固定，手術(shù)常規(guī)消毒后，沿腹中線切開，在盲腸遠(yuǎn)端結(jié)扎盲腸，18G針頭在結(jié)扎處遠(yuǎn)端垂直于盲腸對穿盲腸2次，輕輕擠出腸內(nèi)容物，復(fù)位，然后縫合。假手術(shù)組動物打開腹腔后，不結(jié)扎不對穿，鈍性攪動盲腸后縫合，不做其他處理。

2.2 動物分組及干預(yù)措施 模型動物按體重隨機(jī)分為模型組、大承氣湯5g/kg組、大承氣湯10g/kg組和激素組，另設(shè)正常組和假手術(shù)組，每組動物10只。動物給藥劑量按照體表面積折算法進(jìn)行，其中正常組、模型組和假手術(shù)組動物生理鹽水灌胃，大承氣湯5/kg組、大承氣湯10g/kg組、激素組0.5mg/kg分別灌胃對應(yīng)藥物，所有動物給藥體積為10mL/kg，連續(xù)7d。

2.3 樣本取材和觀察指標(biāo) 最后一次灌胃給藥結(jié)束后8h，腹主動脈取大鼠外周血，低速冷凍離心分離血清，-70℃冰箱凍存?zhèn)錂z測各組動物血清IgA、IgG、IgM水平（ELISA法）;解剖大鼠，分離大鼠脾臟和胸腺，無菌生理鹽水沖洗干凈，分析天平稱重，分別計(jì)算脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)，其中脾臟（胸腺）指數(shù)=脾臟（胸腺）重量（g）/體重（kg）。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS l9.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量指標(biāo)用均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，用F檢驗(yàn)分析處理組間差異;計(jì)數(shù)資料用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大承氣湯對膿毒癥大鼠胸腺和脾臟指數(shù)的影響 從表1可知，模型組胸腺指數(shù)和脾指數(shù)顯著低于正常組和假手術(shù)組，說明膿毒血癥大鼠對免疫器官受到顯著的抑制作用（P< 0.01）;但在大承氣湯治療7d后，膿毒血癥大鼠的胸腺指數(shù)和脾指數(shù)得到一定提高，和模型組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01或P<0.05）;與激素組相比，大承氣湯10g/kg組胸腺指數(shù)和脾指數(shù)有一定程度提高（P<0.05）。結(jié)果表明大承氣湯可以保護(hù)膿毒血癥中免疫器官，對機(jī)體的正常免疫應(yīng)答有正向調(diào)節(jié)作用。

3.2 大承氣湯對膿毒癥大鼠血清IgA、IgG、IgM水平的影響 正常組與模型組比較，模型組 IgG、IgA、IgM 含量顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），提示模型動物體內(nèi)炎性因子大量釋放，導(dǎo)致外周血清中免疫細(xì)胞數(shù)目顯著減少;大承氣湯干預(yù)治療后，血清IgA、IgG、IgM水平能明顯的回升（P<0.01或P<0.05），說明大承氣湯能促進(jìn)機(jī)體的主動免疫反應(yīng);與激素組相比，大承氣湯10g/kg組也明顯具有優(yōu)勢（P<0.05）。見表2。

4 討論

在膿毒血癥病理過程中，促炎因子大量釋放的同時，也會激發(fā)大量抑炎因子被釋放，導(dǎo)致患者的正常免疫功能受到抑制[9-10]。在CLP復(fù)制膿毒血癥小鼠中，Hotchkiss等[11]研究發(fā)現(xiàn)動物體內(nèi)存在淋巴細(xì)胞凋亡，原發(fā)性低免疫反應(yīng)和T淋巴細(xì)胞免疫功能抑制。當(dāng)膿毒血癥患者進(jìn)入免疫抑制階段，過渡活化淋巴細(xì)胞會發(fā)生大概率凋亡，其增殖能力受到顯著抑制，導(dǎo)致機(jī)體自身免疫保護(hù)能力降低[12]。

藥理研究證實(shí)[13-14]，大承氣湯有攻下瀉熱逐瘀之效，其能降低腸粘膜和腸細(xì)胞膜通透性，減輕腸粘膜組織炎癥病理損傷，減少血清內(nèi)毒素和炎性細(xì)胞因子的釋放。另外，大承氣湯能雙向調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞免疫功能，其適當(dāng)劑量能促進(jìn)正常巨噬細(xì)胞釋放TNF-α，TNF-α可進(jìn)而作用于并激活T、B淋巴細(xì)胞，最終增強(qiáng)T、B淋巴細(xì)胞免疫功能[15]。胸腺和脾臟是機(jī)體重要的免疫器官，其體質(zhì)量是反映免疫器官功能的重要指標(biāo)，因此選用胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)來評價本實(shí)驗(yàn)研究中膿毒血癥大鼠的免疫水平。研究結(jié)果表明：大承氣湯可明顯提高模型動物的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)（P<0.01或P<0.05），且呈現(xiàn)一定的劑量正相關(guān)性，可見大承氣湯可對抗膿毒血癥大鼠胸腺和脾臟萎縮，提高機(jī)體免疫能力。存在于血液、體液、組織液中的免疫球蛋白，是機(jī)體具有抗體活性的蛋白，可發(fā)揮抗感染免疫功能。血清中IgA、IgG、IgM水平的變化，能提示膿毒血癥病變進(jìn)程和治療效果。實(shí)驗(yàn)中，膿毒血癥大鼠血清IgA、IgG、IgM水平較正常組顯著降低（P<0.01），提示其免疫反應(yīng)受到抑制，機(jī)體免疫反應(yīng)低下。大承氣湯可有效提高血清IgA、IgG、IgM水平（P<0.01或P<0.05），說明其可有效調(diào)節(jié)漿細(xì)胞分泌球蛋白，參與機(jī)體體液免疫反應(yīng)，提高機(jī)體免疫能力，從而減緩器官和組織免受損傷。綜合來看，大承氣湯可有效調(diào)節(jié)膿毒血癥中抗炎與抑炎失衡所導(dǎo)致的免疫功能紊亂，來發(fā)揮其治療作用，機(jī)理值得進(jìn)一步深入探討。

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（收稿日期：2019-05-24 編輯：劉斌）