李俊雅　李君　梁曉

【摘 要】 目的：研究陰地蕨中化學(xué)成分木犀草素的動態(tài)積累。方法：采用反相-高效液相色譜法測定不同產(chǎn)地、不同采收期、不同部位陰地蕨藥材中木犀草素的含量，色譜柱：色譜柱為菲羅門ODS（150mm×4.6mm，4μm），流動相：乙腈-0.1%磷酸水溶液（45∶55）;體積流量：1mL·min-1;檢測波長：360nm。樣品平均回收率為98.18%，RSD為1.09%（n=6）。結(jié)果：陰地蕨藥材中木犀草素的含量在不同生長時(shí)期、不同部位有明顯的變化規(guī)律。不同部位木犀草素的含量由高到低的順序?yàn)椋喝~、莖、根;一年生長期內(nèi)在8月份陰地蕨根、莖、葉中木犀草素的含量最高。結(jié)論：陰地蕨中木犀草素的積累動態(tài)將為陰地蕨生物特性的形成及陰地蕨藥材采收期提供一定的科學(xué)依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】 陰地蕨;木犀草素;反相-高效液相色譜法;動態(tài)積累

【中圖分類號】R284.9 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號】1007-8517（2019）15-0021-04

陰地蕨為陰地蕨科植物陰地蕨Botrychium ternatum （Thunb.）Sw.的全草。廣泛分布于云南、貴州、湖北、湖南、廣西等地，《中華本草》[1]和《中藥大辭典》中均有收錄[2]。傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為陰地蕨味甘、苦，性微寒，具有清熱解毒，平肝熄風(fēng)，明目去翳之功效。臨床常用于小兒高熱驚搐，肺熱咳嗽，目赤翳障等癥的治療?，F(xiàn)代藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，陰地蕨中的木犀草素具有多種藥理活性：抗炎、抗過敏、鎮(zhèn)咳、抗纖維化、抑制腫瘤細(xì)胞增殖等作用[3～5]。

隨著最近幾年國家的 “精準(zhǔn)扶貧”政策，廣大山區(qū)種植中藥材業(yè)已成為不少農(nóng)村脫貧致富的好途徑，陰地蕨作為云貴地區(qū)的民族藥，分布十分廣泛，具有較大的研究和開發(fā)意義。但作為人工種植的陰地蕨藥材，目前國內(nèi)尚無統(tǒng)一的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。為了更好地開發(fā)利用這一藥材資源，筆者對其中木犀草素含量的動態(tài)積累規(guī)律進(jìn)行了研究。

1 儀器和試劑

1.1 儀器 UV-2201型紫外分光光度計(jì)（日本島津儀器公司），LC-20A T高效液相色譜儀（日本島津儀器公司，SPD-20A型紫外檢測器，CTO-10AS vp型柱溫箱，CBM-102型工作站），SY25-1200型超聲波清洗器（張家港市三友超音設(shè)備有限公司），0.45μm微孔濾膜（天津津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），高速萬能粉碎機(jī)（長沙旭眾機(jī)械設(shè)備有限公司）。

1.2 藥材 研究所用陰地蕨樣品分別在國內(nèi)3個(gè)省區(qū)（云南省昆明市西山區(qū)，貴州省銅仁市萬山區(qū)，湖南省益陽市安化縣）收集，共24份，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)劉塔斯教授鑒定，所采集樣品均為陰地蕨科（Botrychiaceae）植物陰地蕨（Botrychium ternatum）的全株。2018年6月至2019年9月采收陰地蕨全株，洗凈，曬干。

1.3 試劑 木犀草素對照品（中國食品藥品檢驗(yàn)研究院，批號：111520-201605），乙腈（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號：20170615）、甲醇（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號：20170814）、異丙醇（天津四友精細(xì)化學(xué)品有限公司，批號：20170513）為色譜純，實(shí)驗(yàn)研究所用其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液制備 取木犀草素對照品0. 50mg，精密稱量，置于5mL的容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2 陰地蕨供試品溶液制備 取陰地蕨樣品粉末（過三號篩）1.0g，精密稱定，將藥材粉末置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25mL，稱定重量，超聲（功率500W，頻率40kHz）處理45min，放冷，再次稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得[6-7]。

2.3 色譜條件及適應(yīng)性試驗(yàn) 色譜柱為菲羅門ODS（150mm×4.6mm，4μm）;流動相為乙腈-0.1%磷酸水溶液（45∶55）;流速1mL·min-1;柱溫為30℃;檢測波長為350nm。在此條件下，理論板數(shù)按木犀草素峰計(jì)算應(yīng)不低于5000。

2.4 測定法 分別精密吸取木犀草素對照品溶液與陰地蕨供試品溶液各20μL，注入液相色譜，測定，即得，結(jié)果見圖1、圖2。

2.5 線性關(guān)系考察 分別從0.104mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液中吸取5、10、15、20、25μL，作HPLC分析。以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，木犀草素對照品含量（X）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。數(shù)據(jù)經(jīng)回歸處理，得木犀草素的線性方程為：Y=2175628X+2104，r=0.9998，表明木犀草素的進(jìn)樣量在0.251～2.004μg范圍內(nèi)時(shí)線性良好。

2.6 精密度試驗(yàn) 取木犀草素對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測得各次峰面積，并計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）值，結(jié)果見表1。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取陰地蕨藥材藥材粉末1g，精密稱定，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按 “2.3”項(xiàng)下色譜條件分別于0、4、8、12、16、20、24h依次注入高效液相色譜儀，進(jìn)行HPLC分析，測得每個(gè)時(shí)間點(diǎn)木犀草素的峰面積，并計(jì)算其RSD（%）值，結(jié)果見表2。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取陰地蕨藥材1g，精密稱定，按照“2.2項(xiàng) 陰地蕨供試品溶液制備”的方法，平行制備樣品溶液6份，分別進(jìn)樣20μL，進(jìn)行HPLC分析，測定樣品含量，并其計(jì)算RSD值，結(jié)果見表3。

2.9 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的陰地蕨藥材樣品粉末6份，各約0.5g，精密稱定。分別精密加入濃度為0.104mg·mL-1的木犀草素對照品溶液1.5mL，按 “2. 2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣20μL，按 “2. 3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，計(jì)算回收率。結(jié)果見表4。

2.10 樣品測定 取不同產(chǎn)地、不同采收期、不同部位（根、莖、葉）的陰地蕨藥材適量，精密稱定，按供試品溶液制備（2.2）項(xiàng)下制備樣品溶液。取樣品溶液和木犀草素對照品溶液各20μL，注入高效液相色譜儀，測定，計(jì)算木犀草素的含量，結(jié)果見表5。

3 結(jié)論

經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)可知[8-9]：陰地蕨木犀草素易溶于甲醇，故在實(shí)驗(yàn)中選擇甲醇作為提取溶劑。在實(shí)驗(yàn)中先后考察了回流提取法與超聲提取法，通過HPLC分析對比，發(fā)現(xiàn)上述兩種提取方法所得的陰地蕨藥材中木犀草素含量相似。但超聲提取法更快捷、方便， 故選用超聲提取法對陰地蕨藥材樣品進(jìn)行處理。同時(shí)，在實(shí)驗(yàn)中還對流動相的比例（體積）進(jìn)行了充分的考察，選用甲醇-乙腈-水（20∶40∶40）、乙腈-水（42∶58）、甲醇-醋酸-水（60∶0.1∶39）等作流動相，木犀草素的分離度和理論塔板數(shù)均達(dá)不到要求。經(jīng)過多次、反復(fù)摸索實(shí)驗(yàn)條件，發(fā)現(xiàn)采用乙腈-0.1%磷酸水溶液（45∶55）為流動相，木犀草素可以與相鄰成分達(dá)到基線分離，峰形較好，基線平穩(wěn)，符合要求[10-11]。

分別對不同產(chǎn)地、不同采收期、不同藥用部位陰地蕨中木犀草素的含量進(jìn)行了測定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：不同產(chǎn)地的陰地蕨藥材在同一采收期木犀草素的含量無明顯差異;不同部位陰地蕨藥材中木犀草素的含量差別很大，即葉>莖>根;不同產(chǎn)地陰地蕨藥材中木犀草素的含量呈規(guī)律性變化，其中6月初到7月中旬木犀草素的含量呈上升趨勢，7月下旬到8月上中旬含量較高，隨后逐漸下降。故建議陰地蕨的根不作為入藥部位，以地上部分作為入藥部位，每年8月份為陰地蕨藥材的最佳采收期。

參考文獻(xiàn)

[1]國家中藥管理局編委會.中華本草（第二冊）[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1999：69.

[2]南京中醫(yī)藥大學(xué).中藥大辭典[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2006：1362.

[3]劉立新，鄒冬玉，張羽男，等.木犀草素·4，4′-聯(lián)吡啶藥物共晶對小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的抗炎作用研究[J].中國藥房，2018，29（5）：602-606.

[4]趙健榮，郭美仙，劉曉波.花生殼醇提物鎮(zhèn)咳祛痰及平喘作用研究[J].中國民族醫(yī)藥雜志，2014，36（10）：11-12.

[5]王少明，阮君山.陰地蕨對A549腫瘤細(xì)胞增殖黏附及遷移能力的影響[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2011，31（24）：2008-2011.

[6]戴勝，秦亞東，梁楓.不同產(chǎn)地壯藥夜香牛中木犀草素的含量測定[J].中國民族民間醫(yī)藥，2017，26（20）：18-20.

[7]李潔玉，周濃，陽文武，等.HPLC法測定仙桃草中蘆丁、犀草苷、木犀草素的含量[J].西南師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2017，42（8）：80-84.

[8]戴勝，秦亞東，梁楓.UPLC同時(shí)測定野菊花藥材中10個(gè)黃酮和有機(jī)酸的含量[J].藥物分析雜志，2019，39（3）：451-457.

[9]木合塔爾·吐爾洪，楚剛輝，尹學(xué)博，等.高效液相色譜法測定野生和人工種植庫魯木提草 中柚皮苷和木犀草素的含量[J].分析化學(xué)學(xué)報(bào)，2018，34（2）：186-190.

[10]黃慧，王曉琴，杜月，等.HPLC法同時(shí)測定漏蘆花中6個(gè)成分的含量[J].藥物分析雜志，2017，37（6）：956-961.

[11]魏敏，孫璇.RP-HPLC同時(shí)測定硬尖神香草中4種成分含量[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2016，22（11）：77-79.

（收稿日期：2019-05-09 編輯：劉斌）