陸宇杰，吳克虎，吳曉陽

(1.武漢大學中南醫(yī)院眼科，武漢 430000；2.湖北中醫(yī)藥大學附屬湖北省中醫(yī)院眼科，武漢 430000)

干眼是眼科門診目前常見的疾病之一，已成為除屈光不正以外最常見的眼部疾病。2017年國際淚膜和眼表協(xié)會干眼工作組[1]重新定義干眼為以淚膜穩(wěn)態(tài)失衡為主要特征并伴有眼部不適癥狀的多因素眼表疾病。淚膜不穩(wěn)定、淚液滲透壓力升高、炎癥反應與損傷，同時神經感覺異常，是其最重要的病理生理機制。同時報告了全球的干眼發(fā)病率為5.5%～50%[2]，目前我國的干眼發(fā)病率為21%～30%。結膜上皮細胞在眼表疾病抵御中發(fā)揮重要作用，其分泌的黏蛋白異?？蓪е赂裳郯l(fā)生。海藻糖是一種抗高滲作用的生物保護劑，在干眼癥治療、角膜保存等方面有較大研究進展。Matsuo等[3]進行的角膜上皮細胞存活試驗證明海藻糖能有效抑制在體外干燥環(huán)境中培養(yǎng)的角膜上皮細胞的死亡。本研究擬用海藻糖滴眼液作用于淚液分泌不足型干眼大鼠眼表，采用免疫組織化學方法檢測大鼠結膜上皮組織中凋亡基因蛋白的表達情況，推測結膜上皮細胞凋亡與眼表干眼病變及組織損傷的關系，探討海藻糖治療干眼癥的作用機制，為該病治療提供理論依據。

1 對象與方法

1.1 實驗動物

健康成年SD大鼠30只，由湖北省疾控實驗動物中心提供，體重(180±10) g，雌雄各半。按隨機數字表法分為正常組、實驗組、對照組，每組10只鼠(20只眼)，取雙側眼。實驗過程中對動物處置符合2006年科學技術部發(fā)布的《關于善待實驗動物的指導性意見》。

1.2 干眼動物模型制作

小鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉0.8 mL進行全身麻醉。剪除雙眼顳側及耳后長毛，暴露皮面，消毒鋪巾。左側：左耳下方約1 cm處沿皮紋做橫行切口1.5 cm，暴露皮下見一微黃色圓形腺體(眶外淚腺)，分離周邊包膜將其完整摘除。生理鹽水沖洗局部，4號線皮針間斷縫合皮膚切口。左眼外側l cm處作縱行切口l cm。暴露皮下見一白色質硬膜，切開見下方一三角形腺體(眶內淚腺)，鼻側有伴行血管，下方有大量脂肪組織，上方有肌肉覆蓋，分離周圍組織，將其完整摘除。生理鹽水沖洗，4號線間斷縫合。右側同前。切口局部碘伏消毒，表面涂紅霉素眼膏預防感染[4]。

1.3 治療及眼表檢查

海藻糖滴眼液由Labo ratories Thea公司提供，濃度30 mg/mL，無防腐劑。正常組不給予處置，實驗組和對照組通過摘除大鼠眶內眶外淚腺制作干眼動物模型。對照組和實驗組于造模術后1周后分別給予生理鹽水、海藻糖滴眼液點雙眼，每天4次，給予治療共4周。于造模手術前和術后1，2，3，5周行基礎淚液分泌試驗(濾紙條寬度改為2.5 mm，方法同臨床)、角膜上皮熒光素染色檢測(方法同臨床，評分將角膜分為4個象限，每個象限規(guī)定無染色為0，有染色則分輕、中、重3級，共0～12分，1分為染色少于5個點，3分為出現(xiàn)塊狀染色或者絲狀物，2分介于兩者之間)[5]。其中，術后1周時測得淚液值和角膜評分值是在進行治療之前完成。三組動物均由同一人檢查，每次檢查時間、地點、照明亮度、濕度及溫度均相同。動物模型喂養(yǎng)1周后，與正常組比較，角膜干燥無光澤，熒光素染色呈點狀染色，淚液浸濕試紙長度較實驗前明顯變短，視為干眼模型成功。

1.4 干眼模型凋亡基因蛋白表達

1.4.1 實驗方法

實驗組和對照組于造模術后5周將大鼠以空氣栓塞致死，取其結膜，并取正常組作為對照組。經4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，做4 μm連續(xù)切片。主要試劑及配制：Bax小鼠IgG2b單抗、Bcl-2小鼠IgG1單抗、SP試劑盒[含內源性過氧化物酶阻斷劑(A)、封閉用正常山羊血清工作液(B)、生物素標記羊抗小鼠IgG(C)、辣根酶標記鏈酶卵白素工作液(D)]、防脫片劑APES，DAB顯色劑(均購自北京中山生物技術有限公司)，具體實驗方法根據試劑說明書操作。

1.4.2 陽性結果判斷和定量測定

采用計算機顯微圖像分析儀NikonALPHAPHOT-2 YS2-H雙目顯微鏡及照相系統(tǒng)，正常組、實驗組和對照組動物各隨機選取5個不重疊的視野下的1 000個結膜上皮細胞，所選取圖片均事先估測染色合格讀取Bax和Bcl-2染色陽性(胞質中出現(xiàn)棕黃色顆粒)的細胞數，每組取其平均值。陽性細胞數越大，說明陽性反應程度越高。

1.5 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件進行數據分析。本研究檢測指標的數據資料經檢驗呈正態(tài)分布，以均數±標準差()表示。采用完全隨機分組實驗設計，正常組、對照組、實驗組眼基礎淚液分泌量、角膜熒光素鈉染色評分和凋亡細胞計數總體差異比較采用單因素方差分析。采用雙尾檢測法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 實驗動物數量

參加實驗的30只大鼠，除對照組1只大鼠在制作干眼模型死亡外，其余動物模型均進入結果分析。

2.2 基礎淚液分泌實驗

各時間點基礎淚液分泌結果見圖1。試驗結果顯示：造模術后各時間點實驗組和對照組的淚液分泌量較正常組[(6.4±1.3) mm]明顯減少，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。用藥28 d，即術后第5周后，海藻糖實驗組[(4.8±0.8) mm]較生理鹽水對照組[(3.9±0.9) mm]淚液分泌量增加，兩組相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，其余時間點差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

2.3 角膜熒光染色評分

實驗開始前，各組評分均為0分。造模術后1周，對照組(6.3±0.9)和實驗組(6.4±1.1)角膜熒光素染色評分明顯高于正常組；給藥7 d，即術后2周后，對照組(7.2±1.3)和實驗組(6.8±1.1)評分差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。隨著時間的延長，術后第3周和第5周，對照組(7.8±1.2；9.2±1.5)和實驗組(7.2±0.9；6.7±1.2)評分差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，圖2)，且實驗組評分小于對照組。術后第5周，正常組大鼠角膜有細微點染，實驗組角膜上皮熒光色染色評分有一定程度增加，角膜呈局部點片狀染色(圖3A)，對照組評分顯著增加，角膜大范圍出現(xiàn)彌漫性粗點狀染色，局部呈片狀染色(圖3B)。

圖1 基礎淚液分泌值比較Figure 1 Comparison of basic tear secretion values

圖2 角膜上皮熒光索染色評分Figure 2 Fluorescent cord staining score of corneal epithelium

2.4 免疫組織化學染色結果

術后第5周將大鼠空氣栓塞處死進行免疫組織化學檢測，結膜上皮細胞Bax和Bcl-2基因蛋白表達的細胞數情況見圖4，圖5。正常組(301.1±132.3)結膜上皮細胞Bax蛋白陽性表達的細胞數較對照組(499.3±212.5)和實驗組(378.4±153.3)少，且正常組與對照組表達細胞數比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，圖6)，與實驗組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；正常組可見大量Bcl-2蛋白陽性表達(354.8±104.6)，且多于實驗組(303.4±143.7)，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，多于對照組(206.1±101.3)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，圖7)，呈棕黃色顆粒主要表達在細胞質。對照組結膜上皮細胞中見大量Bax蛋白陽性表達于細胞質，呈棕黃色顆粒，實驗組中Bax蛋白表達相對于對照組明顯較少(圖4)，兩者差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；實驗組結膜上皮細胞中可見大量Bcl-2蛋白表達，對照組中Bcl-2蛋白表達數相對于實驗組明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，圖5)。

圖3 角膜熒光染色Figure 3 Fluorescent staining of the cornea

圖4 眼表凋亡相關基因Bax表達的比較Figure 4 Comparison of expression of apoptosis-related gene Bax in ocular surface

圖5 眼表凋亡相關基因Bcl-2表達的比較Figure 5 Comparison of expression of apoptosis-related gene Bcl-2 in ocular surface

圖6 Bax蛋白陽性表達(IHC，×200)Figure 6 Positive expression of Bax protein (IHC, ×200)

圖7 Bcl-2蛋白陽性表達(IHC，×200)Figure 7 Positive expression of bcl-2 protein (IHC, ×200)

3 討論

干眼是眼科門診常見的疾病之一，是以淚膜穩(wěn)態(tài)失衡為主要特征并伴有眼部不適的多因素眼表疾病。較嚴重者眼睛會出現(xiàn)紅腫、充血及角質化，角膜上皮剝脫而有絲狀物黏附，日久則可造成角結膜病變影響視力[3,6]。由于瘢痕或繼發(fā)感染引起的嚴重干眼病是一種潛在的致盲疾病[7]。調查結果[8]顯示：近幾年美國平均每年用于治療干眼的費用約為38.4億美元，平均每位干眼患者每年在干眼治療上的花費超過500美元，而在英國則達到270～1 100美元。干眼的治療原則為改善患者眼部不適和保護患者視功能，Craig等[9]基于干眼嚴重程度的分級提出治療建議。目前臨床上缺乏有效防治干眼的藥物，探索新的藥物仍然具有重要的臨床意義。干眼癥與淚液含水量減少和淚液脂質、黏蛋白異常有關，眼表水合不全，導致淚膜高滲透，最終出現(xiàn)不適。高滲透壓會誘發(fā)眼表炎癥反應，引起角膜上皮屏障破壞。已發(fā)現(xiàn)干眼結膜上皮促細胞凋亡蛋白如FAS，CD40表達與干眼嚴重程度呈正相關。雖尚未確定細胞凋亡是干眼的結果或原因，越來越多的研究[6]表明：細胞凋亡在角結膜炎中發(fā)揮重要作用，抑制細胞凋亡是治療干眼癥的一個重要方向。

淚液是由眼眶外淚腺和眶內淚腺分泌，同時包含由結膜杯狀細胞和瞼板腺分泌的成分，共同組成淚膜。淚膜自外至內由脂質層、水樣層和黏蛋白層構成。眼表黏蛋白是淚膜的重要組成部分，具有清除、潤滑、抗菌、抗黏附[10]、眼表屏障、感受滲透壓以及信號轉導等功能。這些黏蛋白帶有水溶性及脂溶性，能降低淚膜表面張力。2017年國際淚膜與眼表協(xié)會[2]將干眼分為水樣液缺乏型、蒸發(fā)過強型及混合型，水樣液缺乏型干眼由淚液分泌障礙引起，蒸發(fā)過強型由暴露眼球表面的水分過量蒸發(fā)損失引起，混合型為上述兩者共同引起。干眼炎性反應和組織損傷是一種惡性循環(huán)，其發(fā)展到一定程度均會同時具有水液缺乏和蒸發(fā)過強的特征。液生成不足型干眼動物模型常有自身免疫性介導、摘除淚腺、阻斷神經、藥物因素如阿托品介導[4]。手術摘除淚腺是建立淚液分泌不足型干眼動物模型常用方法，病程維持時間較長，可達8周以上，由于疾病程度輕，該模型適合用來估算各種人工淚液對眼表的作用[11]。結膜損害往往早于角膜出現(xiàn)，因為結膜富含血管、淋巴組織，在干眼炎癥中扮演重要角色。結膜上皮細胞(包括杯狀細胞及非杯狀細胞)分泌的黏蛋白是淚膜的主體結構[12]。杯狀細胞是插入到結膜上皮細胞間的特化細胞,在維持眼表健康、保持清晰視力及防御感染方面有重要作用。結膜上皮細胞作為眼表防御系統(tǒng)的一部分，不僅維持眼表穩(wěn)定，其細胞間隙還可發(fā)揮免疫作用及藥物轉運。淚膜不穩(wěn)定是干眼核心機制之一，結膜上皮細胞分泌的黏蛋白是淚膜重要成分，在干眼中發(fā)揮重要作用。當結膜上皮受損時，淚膜中黏蛋白將會出現(xiàn)質或量異常，導致淚膜異常，進而發(fā)生干眼。

海藻糖是由兩個葡萄糖分子通過半縮醛羥基結合而成的非還原性雙糖，廣泛存在于細菌、藻類、酵母、低等植物，尤其在霉菌、蘑菇等真菌中含量高達干重的20%[13]。它是一種具有獨特抗脫水、抗冷凍、抗高滲保護作用的非特異性生物保護劑，在干眼治療、角膜保存等方面有較大研究，是一種有效的預防、治療干眼癥的潛在藥物[14]。研究[6]表明：海藻糖是細胞暴露于干燥環(huán)境中存活的關鍵因素，作為對長期干燥的應激，海藻糖不斷累積產生，賦予生物體長時間幾乎完全脫水并隨后恢復活力的能力，具有這種特征的稱為脫水生物，其作用機制仍不明，可能與海藻糖作為“水替代品”或重新排列細胞內水結構有關。海藻糖抑制角膜和結膜上皮細胞中促炎細胞因子的誘導和基質金屬蛋白酶的表達，加入透明質酸鹽后，海藻糖的作用增強，成為具有潤滑和保水性質的糖胺聚糖多糖[15]。Chiambaretta等[16]比較了含有海藻糖和透明質酸的新滴眼液和僅含有透明質酸的滴眼液在干眼患者中的療效，發(fā)現(xiàn)前者不良事件少于后者。當用海藻糖處理受傷的角膜時，角膜炎癥，瘢痕形成和新血管形成等被抑制[14]。海藻糖可減少細胞凋亡并降低眼表面氧化、炎癥和蛋白水解活性。在紫外線照射的角膜中，海藻糖抑制了射線引起的光損傷[17]，減少了角膜內皮炎癥，抑制了新生血管形成。Matsuo等[3]進行的角膜上皮細胞存活率試驗證明：海藻糖可顯著降低角膜上皮細胞在干燥環(huán)境中的病死率，在隨后評價海藻糖用于治療干眼的臨床試驗都取得了良好的效果。同時海藻糖作為一種滲透保護劑可保護眼表細胞免于高滲透壓損傷[18]。

Li等[19]發(fā)現(xiàn)海藻糖可降低干眼模型小鼠眼表炎癥因子表達。Chen等[20]發(fā)現(xiàn)海藻糖溶液在恢復小鼠角膜表面細胞完整性方面相對于自體血清更有效。Hill-Bator等[21]在體外干燥環(huán)境中培養(yǎng)人角膜上皮細胞，與市售干眼制劑相比，海藻糖對其保護效果最佳。上述結果均證明海藻糖在干眼癥中的潛在治療功效。為增加眼表水性液體，常規(guī)干眼用藥為無防腐劑的人工淚液和包含生長因子的自體血清。無論嚴重程度如何，人工淚液頻繁使用仍是干眼廣泛接受的治療。干眼眼表促炎因子多，市售許多干眼用藥可防止水液流失，促進傷口愈合。然而作用機制通常與其保水能力有關，如基于透明質酸制劑。人工淚液極少具有抗炎功能。除海藻糖外，只有乙酰透明質酸除保水外，還具有一定的抗炎效果。目前干眼治療的挑戰(zhàn)是通過包含更有效的活性成分或載體劑來改善淚膜，優(yōu)化眼部保濕并防止眼表上皮損傷。由于海藻糖的抗脫水性質，該分子被視作干眼潛在治療藥物，然而海藻糖對于干燥環(huán)境中眼表上皮細胞影響的更廣泛表征尚未得到很好的研究。手術摘除淚腺是建立淚液分泌不足型干眼動物模型常用方法，且大鼠遺傳成分和環(huán)境易被控制，筆者以此為依據用海藻糖滴眼液作用于摘除眶內眶外淚腺大鼠干眼模型，采用免疫組織化學方法推測結膜上皮細胞凋亡蛋白表達與眼表干眼組織損傷的關系，探討海藻糖治療干眼癥的作用機制，為該病治療提供理論依據。

本研究結果顯示：造模術后各時間點實驗組和對照組淚液分泌量較正常組明顯減少，差異均有統(tǒng)計學意義。用藥28 d后，海藻糖實驗組較生理鹽水對照組淚液分泌量增加，兩組相比差異有統(tǒng)計學意義，其余時間點兩組比較差異均無統(tǒng)計學意義，提示海藻糖溶液對大鼠淚液缺乏型干眼可提供一定的潤滑和眼表水合作用。研究[11]表明：通過手術將犬、貓、兔及鼠的主淚腺摘除后并不能立即引起明顯的眼表干眼癥狀和體征，這可能與淚腺不能干凈摘除和淚液的代償性產生有關，并且完全去除腺體的難度較大，結果變異也較大。這也是為何術后第1，2，3周對照組和實驗組淚液分泌量差異無統(tǒng)計學意義的原因。術后第5周，正常組大鼠角膜在裂隙燈下光滑、有光澤，熒光素染色陰性，實驗組熒光色染色評分一定程度增加，角膜呈彌漫性點狀染色，對照組評分顯著增加，角膜大范圍出現(xiàn)彌漫性粗點狀染色，局部呈片狀染色。造模術后1周，對照組和實驗組染色評分明顯高于正常組；給藥7 d，即術后2周后，除對照組和實驗組評分差異無統(tǒng)計學意義外，術后第3周和第5周，兩組評分差異均有統(tǒng)計學意義，且實驗組評分小于對照組，熒光素鈉染色可確定角膜上皮是否完整，提示海藻糖有助于減少角膜表層上皮的脫落，保護角膜上皮滲透屏障。

周楊等[22]對摘除主淚腺干眼動物模型的眼表組織進行研究發(fā)現(xiàn)：角結膜上皮及瞼板腺腺泡細胞中凋亡基因Bcl-2和Bax蛋白表達高于正常組。淚腺細胞和角結膜細胞凋亡與干眼發(fā)生有重要關系。細胞凋亡是一種基本生物學現(xiàn)象，受基因調控，分為內外源性途徑，內源性途徑主要通過p53，Bcl-2家族凋亡信號啟動。Bcl-2家族成員Bax，Bcl-2在調亡中起重要的調節(jié)作用。研究[23]證實：Bcl-2基因產物具有明顯抑制細胞凋亡的作用，而Bax蛋白可促進細胞凋亡。Bcl-2可以與Bax結合形成Bcl-2/Bax異二聚體，阻止Bax插入線粒體外膜，保護細胞免受凋亡損害。Bcl-2和Bax在組織細胞中常協(xié)同表達，Bcl-2/Bax比值增大時促進細胞存活，反之則死亡。

本研究中，正常組結膜上皮細胞Bax蛋白表達的細胞數較對照組和實驗組少，可見大量Bcl-2蛋白陽性表達，且多于實驗組和對照組，陽性細胞質含棕黃色顆粒，說明經用藥后的干眼模型鼠眼表存在細胞凋亡，本研究為干眼眼表上皮疾病發(fā)病機制與細胞凋亡之間的相關性提供了一定的理論依據。對照組可見大量Bax蛋白陽性表達，實驗組中Bax蛋白陽性表達相對于對照組少，兩者差異有統(tǒng)計學意義；實驗組結膜上皮細胞中可見大量Bcl-2蛋白表達，細胞質呈棕黃色，對照組中Bcl-2蛋白陽性表達相對實驗組減少，差異有統(tǒng)計學意義。淚膜不穩(wěn)定是干眼核心機制之一，結膜上皮細胞分泌的黏蛋白是淚膜重要成分，在干眼中發(fā)揮重要作用。海藻糖組Bax蛋白表達相對生理鹽水組明顯減少，Bcl-2蛋白表達相對生理鹽水組增加，比值增大表明海藻糖可抑制或減少Bax基因表達，保護或促進Bcl-2表達，本研究提示海藻糖溶液在抑制結膜上皮凋亡中相對生理鹽水有優(yōu)勢，保護了結膜上皮細胞的生物活性，維持了淚液中黏蛋白的穩(wěn)定。盡管造成海藻糖抗細胞凋亡的作用機制仍未明確，但可以確定的是，一定量的海藻糖可以保護蛋白質和細胞膜免于因干燥引起的失活或變性。

綜上所述，海藻糖滴眼液對結膜上皮細胞有一定保護作用，可以拮抗結膜上皮細胞在干燥環(huán)境中的凋亡，減少角膜表層上皮脫落，從而增強角結膜上皮屏障功能，改善由于干燥引起的眼表上皮的損傷。本研究結果支持海藻糖溶液可用于眼表上皮疾病的潛在臨床應用，為治療眼表疾病如干眼癥提供治療選擇。對海藻糖安全性研究結果及其作用機制的不斷深入，為開發(fā)藥用海藻糖滴眼液制劑奠定了良好基礎。