張 軍,吳一凡,張茂娜,江 悅,江 忍,張 弘*

(1湖北省鄂州市中心醫(yī)院病理科,鄂州 436000;2三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院形態(tài)學(xué)教研室;*通訊作者,E-mail:zmn0306@126.com)

肝癌是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,具有較強(qiáng)的增殖和遷移能力,患者通常預(yù)后較差[1]。肝癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制尚未明確,尋求調(diào)控肝癌發(fā)病的分子標(biāo)志物對(duì)抑制肝癌的惡性生物學(xué)行為具有重要的臨床意義。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long-chain non-coding RNA,lncRNA)是一類長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸的非編碼RNA,參與調(diào)控基因表達(dá),影響疾病特別是腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[2]。越來(lái)越多的lncRNA被報(bào)道在肝癌的惡性生物學(xué)行為中發(fā)揮關(guān)鍵作用,并與肝癌患者的預(yù)后有關(guān)[3,4]。CTC-459F4.3是一種新確定的lncRNA,其在肝癌中的表達(dá)及作用機(jī)制尚不明確。本研究通過(guò)檢測(cè)CTC-459F4.3在肝癌組織和細(xì)胞株中的表達(dá)并構(gòu)建攜帶CTC-459F4.3的質(zhì)粒,旨在探討過(guò)表達(dá)CTC-459F4.3對(duì)肝癌細(xì)胞增殖和遷移的影響及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本及細(xì)胞株

收集2017-04～2018-08武漢大學(xué)人民醫(yī)院鄂州醫(yī)院普外科肝癌手術(shù)切除標(biāo)本28例。所有組織標(biāo)本經(jīng)術(shù)后病理科醫(yī)生證實(shí)。所有患者均未行術(shù)前放療和化療。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),患者均簽署知情同意書(shū)。肝癌細(xì)胞株(Huh7、SMMC-7721、MHCC-97H和BEL-7404)以及人正常肝細(xì)胞(LO2)購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.2 主要試劑

DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。攜帶無(wú)意義序列的陰性對(duì)照質(zhì)粒和攜帶CTC-459F4.3的質(zhì)粒購(gòu)自廣州銳博生物科技有限公司。qPCR引物購(gòu)自上海生物工程股份有限公司。qPCR試劑盒購(gòu)于日本TaKaRa公司。LipofectamineTM3000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。Transwell小室購(gòu)自美國(guó)corning公司。GAPDH、Rb、p-Rb、CTDSPL、PCNA、MCM7、E2F1蛋白抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司(蛋白編號(hào)分別為ab8245、ab181616、ab47763、ab36839、ab92552、ab2360和ab218527)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中,肝癌細(xì)胞株(Huh7、SMMC-7721、MHCC-97H和BEL-7404)以及正常肝細(xì)胞(LO2)均采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。以對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SMMC-7721細(xì)胞為轉(zhuǎn)染對(duì)象,根據(jù)LipofectamineTM3000說(shuō)明書(shū)轉(zhuǎn)染。細(xì)胞隨機(jī)分為陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染攜帶無(wú)意義序列的陰性質(zhì)粒)和CTC-459F4.3組(轉(zhuǎn)染攜帶CTC-459F4.3的質(zhì)粒)。轉(zhuǎn)染后細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)48 h,進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 qPCR檢測(cè)組織或細(xì)胞中CTC-459F4.3和CTDSPL mRNA的表達(dá)

組織或細(xì)胞總RNA采用Trizol法提取,檢測(cè)RNA純度,并將吸光度為1.8-2.0的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。組織或細(xì)胞中CTC-459F4.3和CTDSPL mRNA的表達(dá)采用qPCR試劑盒檢測(cè),反應(yīng)條件為96 ℃ 5 min、95 ℃ 5 s、62 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s,38個(gè)循環(huán),GAPDH為內(nèi)參。以2-ΔΔCt方法計(jì)算CTC-459F4.3和CTDSPL mRNA在肝癌組織或細(xì)胞中的表達(dá)量。qPCR引物見(jiàn)表1。

表1 檢測(cè)CTC-459F4.3和CTDSPL mRNA表達(dá)的qPCR引物序列

Table 1 The qPCR primer sequences for detecting CTC-459F4.3 and CTDSPL mRNA expression

基因 序列(5′-3′) CTC-459F4.3上游:GGGCATGCTGGTAATAGTGTC下游:TGCTGAGACTGTAGTCCCATAGCCTDSPL上游:CCACCAGCTAAGTACCTTCTTCC下游:GGCCGCTTCAGCACATACAGAPDH上游:CTGTGGGAGCGAATCGAGG下游:CAGCGCAAGATGTCCATCA

1.5 MTT法檢測(cè)SMMC-7721細(xì)胞增殖

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SMMC-7721細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液,按3×103個(gè)/孔接種到96孔板,每孔250 μl,每組4個(gè)復(fù)孔。檢測(cè)時(shí),加15 μl/孔MTT溶液,培養(yǎng)4 h,棄上清,加200 μl/孔二甲基亞砜,搖床振蕩18 min,酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)(460 nm)下每孔的吸光值,每24 h檢測(cè)1次,連續(xù)5次。

1.6 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SMMC-7721細(xì)胞遷移

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SMMC-7721細(xì)胞使用無(wú)血清培養(yǎng)基制備單細(xì)胞懸液,按3×104個(gè)/孔接種到Trans-well小室的上室,每孔250 μl,下室加550 μl含10%血清的培養(yǎng)基,每組4個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)箱連續(xù)培養(yǎng)24 h。取出上室,甲醛固定30 min,0.1%結(jié)晶紫染液染色30 min,棉簽輕輕擦去上室側(cè)未穿膜的細(xì)胞。選取4個(gè)高倍視野,計(jì)數(shù)穿過(guò)上室面的細(xì)胞數(shù)并取均值統(tǒng)計(jì)分析。

1.7 免疫組化檢測(cè)肝癌組織中CTDSPL蛋白的表達(dá)

肝癌組織及癌旁組織進(jìn)行石蠟切片，脫蠟及水化后，使用過(guò)氧化氫(體積分?jǐn)?shù)0.3%)孵育15 min。使用PBS溶液浸泡15 min，使用血清工作液在室溫下孵育20 min。使用一抗CTDSPL稀釋液(1 ∶100稀釋)在4 ℃下孵育過(guò)夜。37 ℃復(fù)溫60 min，PBS溶液清洗。使用二抗室溫下孵育60 min，PBS溶液清洗。使用DAB溶液顯色5 min，使用蘇木精復(fù)染后，鹽酸乙醇分化并封片。在顯微鏡下觀察肝癌組織及癌旁組織中CTDSPL蛋白的表達(dá)。CTDSPL蛋白陽(yáng)性反應(yīng)為細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕色顆粒。

1.8 Western blot檢測(cè)細(xì)胞CTDSPL及下游蛋白的表達(dá)

裂解對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SMMC-7721細(xì)胞并提取蛋白,BCA法檢測(cè)各組蛋白樣品濃度,以40 μg上樣量計(jì)算各組上樣體積。灌制10%聚丙烯酰氨凝膠,恒壓110 V電泳分離蛋白樣品,硝酸纖維膜轉(zhuǎn)膜,使用5%脫脂奶粉封閉,分別與一抗GAPDH(1 ∶2 000)、Rb(1 ∶2 000)、p-Rb(1 ∶1 000)、CTDSPL(1 ∶1 000)、PCNA(1 ∶1 000)、MCM7(1 ∶1 000)和E2F1(1 ∶1 000)在4 ℃下孵育過(guò)夜,分別與二抗在室溫下孵育,迅速采用ECL化學(xué)發(fā)光試劑發(fā)光,凝膠成像系統(tǒng)掃描膠片。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 CTC-459F4.3在肝癌組織和癌旁組織中的表達(dá)

與癌旁組織相比,CTC-459F4.3在肝癌組織中呈低表達(dá)(P<0.01,見(jiàn)圖1)。

與癌旁組織相比,**P<0.01圖1 CTC-459F4.3在肝癌組織和癌旁組織中的表達(dá)Figure 1 Expression of CTC-459F4.3 in hepatic carcinoma tissues and adjacent tissues

2.2 CTC-459F4.3在正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞株的表達(dá)

與正常肝細(xì)胞(LO2)相比,肝癌細(xì)胞株(Huh7、SMMC-7721、MHCC-97H和BEL-7404)中CTC-459F4.3均呈低表達(dá)(P<0.05),SMMC-7721細(xì)胞中CTC-459F4.3的表達(dá)最低(P<0.01,見(jiàn)圖2)。

2.3 CTC-459F4.3質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率

陰性對(duì)照組和CTC-459F4.3組SMMC-7721細(xì)胞中CTC-459F4.3相對(duì)表達(dá)量分別為1.08±0.27和11.20±1.07(t=9.15,P<0.01),質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功。

與LO2細(xì)胞相比,*P<0.05,**P<0.01圖2 CTC-459F4.3在正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞株中的表達(dá)Figure 2 Expression of CTC-459F4.3 in human normal liver cells and hepatic carcinoma cell lines

2.4 過(guò)表達(dá)CTC-459F4.3對(duì)SMMC-7721細(xì)胞增殖的影響

MTT檢測(cè)結(jié)果顯示,與陰性對(duì)照組相比,CTC-459F4.3組的SMMC-7721細(xì)胞從第3天開(kāi)始,增殖能力明顯降低(P<0.05,見(jiàn)圖3)。

與陰性對(duì)照組相比,*P<0.05,**P<0.01圖3 CTC-459F4.3對(duì)肝癌細(xì)胞SMMC-7721增殖的影響Figure 3 Effect of CTC-459F4.3 on proliferation of hepatic carcinoma cells SMMC-7721

2.5 過(guò)表達(dá)CTC-459F4.3對(duì)SMMC-7721細(xì)胞遷移的影響

陰性對(duì)照組和CTC-459F4.3組SMMC-7721細(xì)胞遷移細(xì)胞計(jì)數(shù)分別為124.10±19.16和56.06±8.82(P<0.05)。與陰性對(duì)照組相比,轉(zhuǎn)染CTC-459F4.3后的肝癌細(xì)胞遷移能力被明顯抑制(見(jiàn)圖4)。

2.6 CTDSPL蛋白在肝癌組織和癌旁組織中的表達(dá)

免疫組化法檢測(cè)肝癌組織和癌旁組織中CTDSPL蛋白的表達(dá),CTDSPL陽(yáng)性結(jié)果表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)棕黃色顆粒(見(jiàn)圖5)。肝癌組織和癌旁組織中CTDSPL蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為4.20±0.47和0.49±0.14(t=7.54,P<0.01),與癌旁組織相比,CTDSPL在肝癌組織中的表達(dá)明顯減少。

與陰性對(duì)照組相比,*P<0.05圖4 CTC-459F4.3對(duì)肝癌細(xì)胞SMMC-7721遷移的影響Figure 4 Effect of CTC-459F4.3 on migration of hepatic carcinoma cells SMMC-7721

2.7 兩組細(xì)胞中CTDSPL mRNA的表達(dá)

陰性對(duì)照組和CTC-459F4.3組SMMC-7721細(xì)胞中CTDSPL mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.08±0.25和5.53±0.56(t=7.28,P<0.01)。與陰性對(duì)照組相比,CTC-459F4.3組細(xì)胞中CTDSPL mRNA的表達(dá)明顯增加。

2.8 過(guò)表達(dá)CTC-459F4.3對(duì)CTDSPL蛋白及下游蛋白表達(dá)的影響

Western blotting結(jié)果顯示,與陰性對(duì)照組相比,轉(zhuǎn)染CTC-459F4.3后,CTDSPL蛋白表達(dá)明顯增加,Rb蛋白的磷酸化水平降低,PCNA、MCM7、E2F1蛋白的表達(dá)明顯降低(見(jiàn)圖6)。

圖5 肝癌組織和癌旁組織中CTDSPL蛋白的表達(dá)Figure 5 Expression of CTDSPL protein in hepatic carcinoma tissues and adjacent tissues

圖6 Western blotting檢測(cè)CTC-459F4.3對(duì)CTDSPL及下游蛋白表達(dá)的影響Figure 6 The effect of CTC-459F4.3 on the CTDSPL protein and downstream target protein expression by Western blotting

3 討論

肝癌的治療主要是手術(shù)治療,然而大多數(shù)肝癌確診即為晚期,針對(duì)晚期肝癌尚無(wú)有效的治療方法[5]。探索肝癌發(fā)生、發(fā)展中的分子調(diào)控機(jī)制,對(duì)肝癌靶向藥物研發(fā)具有重要臨床意義。近年的研究表明,長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long-chain non-coding RNA,lncRNA)在表觀遺傳學(xué)、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后及表觀遺傳學(xué)調(diào)控基因的表達(dá),已成為腫瘤發(fā)生、發(fā)展分子作用機(jī)制研究的重點(diǎn)[6]。肝癌細(xì)胞的增殖和遷移行為受細(xì)胞內(nèi)基因組學(xué)的調(diào)控,lncRNA發(fā)揮著重要調(diào)控作用[7]。SNHG6、GHET1、RGMB-AS1、ANRIL、XIST、TSLNC8等[8-13]lncRNA被發(fā)現(xiàn)參與肝癌的發(fā)生、發(fā)展,且與肝癌的臨床分期、分級(jí)及預(yù)后相關(guān),lncRNA在肝癌發(fā)病過(guò)程中的重要作用受到越來(lái)越多的關(guān)注。CTC-459F4.3是一種新發(fā)現(xiàn)的lncRNA,其在腫瘤特別是肝癌中的作用尚不清楚。

本研究結(jié)果顯示,CTC-459F4.3在肝癌組織和細(xì)胞株中呈低表達(dá),CTC-459F4.3可能參與抑制肝癌的發(fā)生、發(fā)展。MTT法和Transwell遷移實(shí)驗(yàn)表明,過(guò)表達(dá)CTC-459F4.3可抑制肝癌細(xì)胞的增殖和遷移。CTDSPL全稱羧基末端區(qū)域小磷酸化酶樣蛋白,定位于染色體3p21.3區(qū)域[14]。CTDSPL作為一種抑癌基因,在葡萄膜黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌等多種腫瘤中表達(dá)明顯降低[15]。本研究通過(guò)免疫組化實(shí)驗(yàn)顯示,肝癌組織中CTDSPL蛋白的表達(dá)顯著降低。過(guò)表達(dá)CTC-459F4.3的SMMC-7721細(xì)胞中CTDSPL表達(dá)明顯增加,表明CTC-459F4.3可促進(jìn)CTDSPL蛋白的表達(dá)。視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤基因(Rb基因)的下游基因PCNA、MCM7對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖過(guò)程至關(guān)重要,E2F1蛋白可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[16-18]。CTDSPL可抑制Rb蛋白的磷酸化,而Rb的去磷酸化具有下調(diào)PCNA、MCM7、E2F1蛋白表達(dá)的作用,發(fā)揮抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的作用[14-18]。本研究結(jié)果表明,CTC-459F4.3促進(jìn)CTDSPL表達(dá)上調(diào)后,Rb蛋白的磷酸化水平降低,PCNA、MCM7、E2F1蛋白的表達(dá)明顯降低,表明肝癌SMMC-7721細(xì)胞的增殖和遷移能力可能降低。lncRNA CTC-459F4.3調(diào)控CTDSPL基因表達(dá)的具體分子機(jī)制尚不清楚,這是本課題組下一步研究的重點(diǎn)。

綜上所述,lncRNA CTC-459F4.3在肝癌組織和細(xì)胞株中呈低表達(dá),過(guò)表達(dá)CTC-459F4.3可通過(guò)上調(diào)CTDSPL基因的表達(dá)并促進(jìn)Rb蛋白的去磷酸化,抑制肝癌細(xì)胞的增殖和遷移,CTC-459F4.3有望成為肝癌的治療靶點(diǎn)和分子診斷標(biāo)志物。