戴 星,楊康平,尹戰(zhàn)海,馬 巍,楊益民,張黨鋒,周曉玲,張匡華,姚 璐

(1西安交通大學第一附屬醫(yī)院骨科,西安 710061;2西安交通大學醫(yī)學部基礎醫(yī)學院生理學與病理生理學系;*通訊作者,E-mail:lyao1117@xjtu.edu.cn)

1993年Kitamura等[1]從人嗜鉻細胞瘤細胞中分離出來一種含有52個氨基酸的蛋白,這種蛋白具有強大而持久的血管舒張效應,因其在人的腎上腺髓質中分布最廣、含量最高而被命名為腎上腺髓質素(adrenomedullin,ADM)。隨著進一步深入的研究,人們發(fā)現(xiàn)ADM有強烈的促進血管生成[2]和促進腫瘤生長作用[3],多種腫瘤組織中ADM的mRNA過度表達,進一步的研究更證明了ADM可以劑量依賴性地刺激培養(yǎng)的鼠血管平滑肌細胞的增生[4]。但之前關于ADM與腫瘤關系的研究多集中于消化系統(tǒng)腫瘤和部分腺癌(前列腺癌和乳腺癌等),鮮有關于骨腫瘤與ADM作用關系的研究。骨肉瘤作為骨腫瘤領域最常見的腫瘤類型,目前臨床上多采用手術治療、化療和放療等綜合療法,但骨肉瘤患者的生存率卻沒有得到本質的提高[5]。本研究通過免疫組化、RT-PCR和放射免疫等方法,檢測ADM在骨肉瘤組織和正常組織之間的差異化表達,為骨肉瘤靶向治療提供新的作用靶點,阻斷或延緩骨肉瘤的生長和遠處轉移,這對于提高臨床治療效果,延長患者生命具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 組織標本來源

骨肉瘤組織標本來自于西安交通大學第一附屬醫(yī)院2015-01～2018-12收治的20例骨肉瘤確診患者,其中男性13例,女性7例,年齡16-63歲,平均年齡28歲。所入選的骨肉瘤患者均為初發(fā)病例,并且病人在采集標本前從未行先期的放化療治療。所有骨肉瘤組織都采集于原發(fā)病灶,經病理診斷確診且病歷資料完整,并排除轉移性或合并其他運動系統(tǒng)腫瘤者。詳細記錄入選者的個人信息、診斷、疾病的分期及有無轉移、腫瘤的特征等相關資料。手術中所取的瘤旁組織為遠離瘤細胞的最遠侵犯界限5 cm之外,且術后常規(guī)經病理驗證無腫瘤細胞浸潤。對照組人群來自于因外傷導致骨折而入院行內固定術的中青年患者,其中男性7例,女性3例,年齡22-45歲,平均年齡31.4歲,平素體健且經入院檢查排除身體其他疾病。

血液標本分為3組采集:腫瘤術前組、腫瘤術后組和健康人組。其中腫瘤患者術前血液標本在入院時采集;腫瘤患者術后血液標本在手術后2周時采集。腫瘤患者排除標準:①對于入院前已經進行抗腫瘤的藥物治療;②因腫瘤復發(fā)而再次住院的骨肉瘤患者。健康組血液來自于經健康體檢排除明顯器質性疾病的人群。骨肉瘤組和健康對照組的年齡、性別均無明顯差異,所有患者及參與本實驗人員均告知相關事項并簽訂知情同意書,本研究經我院倫理委員會批準備案。

1.2 主要試劑

1.3 免疫組化法檢測ADM在人骨肉瘤組織中的表達

將獲得的腫瘤組織塊制備石蠟塊,以4 μm的厚度連續(xù)切片,所有的切片分為3組,分別用于HE染色、ADM和陰性對照免疫組化研究,以PBS液代替一抗作為空白對照組。按照組織來源的不同部位,實驗分3個組進行:腫瘤組,瘤旁組織組和正常組織組,相同部位的切片重復2次。

1.3.1 實驗步驟 將切片轉入二甲苯溶液中浸泡脫蠟,濃度梯度酒精溶液浸泡去除二甲苯。切片行抗原修復后,滴加封閉液滅活內源性過氧化物酶。滴加一抗(1 ∶100稀釋的ADM)工作液反應約1 h,然后轉移到4 ℃冰箱內過夜。滴加50 μl生物素標記的二抗(1%BSA-PBS稀釋),37 ℃孵育30 min,PBS沖洗3次。滴加50 μl辣根酶標記鏈霉卵白素(PBS稀釋),37 ℃孵育30 min,PBS沖洗4次。加入DAB試劑盒中A、B和C液各1滴,室溫下顯色,純水洗滌后終止反應。再次酒精梯度脫水,每級5 min,二甲苯透明,樹膠封片。

1.3.2 免疫組化結果的判定 ADM陽性染色的主要表現(xiàn)是腫瘤細胞的細胞質中出現(xiàn)黃褐色或棕色的顆粒。采用圖像分析系統(tǒng)軟件Qwin(V2.3,Leica,Inc),對每張切片在200倍鏡下選擇5個視野的陽性細胞,分析其相對數量和染色強度?？煞譃樗募?Ⅰ級,陰性,無陽性細胞或僅可見極少量陽性細胞;Ⅱ級,弱陽性,可見少量陽性細胞,數量少于10%;Ⅲ級,陽性,視野下可見較多陽性細胞,但數量不超過50%;Ⅳ級,強陽性,陽性細胞數量超過50%。

1.4 RT-PCR檢測骨肉瘤組織中ADM mRNA

1.4.1 組織總RNA的提取 將新鮮組織標本以液氮速凍后磨碎,每100 mg組織加入1 ml Trizol試劑,將組織勻漿。按照1 ∶0.2的比例向Trizol中加氯仿,用力震蕩后靜置5 min。12 000 r/min離心15 min后將上層水相轉入新的1.5 ml EP管中,加入異丙醇0.5 ml,混勻后放于-20 ℃中1 h后4 ℃ 12 000 r/min離心10 min。傾去上清,加1 ml DEPC,振蕩洗滌后低溫離心機7 500 r/min離心5 min。傾去上清,留取沉淀,將提取的RNA保存于-70 ℃冰箱中。

表1 RT-PCR引物序列

Table 1 Primer sequences for RT-PCR

基因上游引物 下游引物 擴增片段ADM5′-TGCCCAGACCCTTATTCGG-3′5′-AGTTGTTCATGCTCTGGCGG-3′115 bpGAPDH5′-CAAATTCCATGGCACCGTC-3′5′-CCCATCTGATTTTGGAGGGA-3′101 bp

反轉錄反應條件如下:37 ℃ 15 min(反轉錄反應),85 ℃ 5 s,合成的cDNA于-20 ℃保存。RT的反應產物為總RNA相對應的cDNA,以合成好的cDNA為模板,PCR反應擴增ADM基因。依次加入下列試劑,建立如下的反應體系:2×Master Mix 12.5 μl,ADM cDNA 2 μl,上游引物(50 mmol/L)0.5 μl,下游引物(50 mmol/L)0.5 μl,最后加入ddH2O 9.5 μl至總體積為25 μl。94 ℃預變性3 min后,94 ℃變性30 s,退火30 s,72 ℃延伸45 s,共35個循環(huán),最后72 ℃延伸5 min。

1.4.3 瓊脂糖凝膠電泳 2%瓊脂糖凝膠50 ml充分混勻后室溫冷卻,加入10 mg/ml EB 4 μl,倒入準備好的膠槽內,向槽內加入1×TAE電泳緩沖液,再加入DNA marker 5 μl,依次加入樣本5-10 μl至凝膠的加樣孔中。接通電源,調節(jié)電壓為10-12 V,電泳30-35 min,待指示劑遷移至足夠距離后,關閉電源取出凝膠,置于凝膠成像系統(tǒng)中觀察電泳結果。以DNA marker為對照,判斷出現(xiàn)相應大小的目的條帶是否為所需條帶。采用凝膠圖像分析系統(tǒng),照相并對電泳條帶進行密度掃描后分析,以各組產物的光密度值(OD)與GAPDH的OD值相比計算目的基因的相對表達量。

1.5 放射免疫法檢測血漿中ADM含量

1.5.1 血漿樣本處理 血液標本共采集50例,其中腫瘤術前組20例,腫瘤術后組20例,健康人組10例。血液標本采用如下的方法處理:采集靜脈血2 ml,拔下針頭后,沿管壁慢慢注入含10% EDTA 30 μl的試管中,上下顛倒兩次,混勻。室溫放置約1 h后,3 000 r/min離心10 min,分離血漿后待測。如不立即測量,可將樣本密封后,置于2-8 ℃(保存不應超過12 h)或-20 ℃(保存不超過2個月)儲存?zhèn)錅y。冰凍樣品測定前,使樣本置于室溫或常溫水中復融,測定前將樣品充分搖勻。

1.5.2 測定步驟 按人腎上腺髓質素放射免疫分析試劑盒說明操作,將盒內各凍干品成分加樣配制為溶液,搖勻,4-8 ℃溫育18-24 h。最后加入驢抗兔免疫分離劑,充分搖勻后室溫放置15 min,3 500 r/min離心15 min,棄上清,使用γ射線計數儀測各沉淀管中抗原-抗體標記復合物的放射性計數。

1.5.3 數據處理 聯(lián)機電腦軟件可處理出結果,其計算原理如下。

百分結合率計算:設S0管計數為B0,各標準管或樣品管計數為B,非特異管計數為NSB,則百分結合率計算公式為:B/B0=(B-NSB)/(B0-NSB)×100%。

logit計算:各標準點或樣品管的logit值計算公式為:logit=ln(B/B0)/(1-B/B0)。

普通坐標圖上以標準濃度取log值為橫坐標,對應的logit值為縱坐標;或以標準濃度為橫坐標,對應的B/B0為縱坐標在logit-log坐標圖上制出標準曲線。根據待測樣品的B/B0可以從坐標圖上查出樣品的濃度值。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 病例資料的整理

病人的真實資料隱去,以病例號代替,病人性別、年齡、骨肉瘤的外科學分期、有無遠處轉移及放射免疫法測定的血漿ADM含量見表2。腫瘤大小根據MRI影像和病理標本大小,以病灶的最長徑計算(單位:cm),骨肉瘤的外科學分期基于Enneking提出的肌肉骨骼系統(tǒng)的G-T-M分級系統(tǒng)[6](G:病理分度,T:骨肉瘤與解剖學間室的關系,M:有無遠處轉移),其中Ⅰ期代表低度惡性,Ⅱ期代表高度惡性,Ⅲ期代表有區(qū)域性和轉移性腫瘤組織,再根據解剖間室分為間室內A和間室外B。20例骨肉瘤患者,男性13例,女性7例。按外科學分期,ⅡA級7例(其中男性4例,女性3例),ⅡB級6例(其中男性4例,女性2例),ⅢA級4例(其中男性3例,女性1例),ⅢB級3例(其中男性2例,女性1例)。

表2 骨肉瘤患者病例資料及術前、術后ADM值變化

Table 2 Information of patients with osteosarcoma and changes of ADM before and after operation

病例號性別年齡(歲)分期遠處轉移腫瘤直徑(cm)ADM(pg/ml)術前術后1男54ⅢB多發(fā)9.948.619.82男20ⅡA無 7.235.812.53男28ⅡA無 5.633.714.34女24ⅡB無 5.942.215.45男31ⅡB無 8.441.516.66男24ⅢA肺 10.544.319.47女32ⅡA無 6.233.414.88男19ⅡB無 7.337.618.99女26ⅡB無 6.636.816.110男34ⅡB無 6.939.518.211男23ⅡA無 5.734.815.912女63ⅢA肺 9.146.318.713男17ⅢB多發(fā)9.747.319.814男22ⅢA肺 10.247.918.315男25ⅡB無 8.744.216.516女23ⅡA無 6.334.315.817男16ⅢA肺 9.242.316.418女21ⅢB多發(fā)9.549.318.119男31ⅡA無 8.041.716.520女27ⅡA無 5.842.315.4

2.2 血漿ADM含量

20例骨肉瘤患者術前血漿ADM含量(41.19±5.235 9)pg/ml，10例健康人血漿ADM含量為(12.46±1.148 1)pg/ml，具體見表3,兩組間差異有統(tǒng)計學意義(t=17.006 3,P<0.05);同時20例骨肉瘤患者術前血漿ADM含量與術后血漿ADM含量[(16.87±1.972 5)pg/ml]相比明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(t=19.438 8,P<0.05),提示隨著腫瘤的切除ADM的表達量也隨之降低。本實驗同時發(fā)現(xiàn)Ⅱ期骨肉瘤組血漿ADM水平[(38.29±3.782 3)pg/ml]與Ⅲ期骨

肉瘤組[(46.57±2.494 5)pg/ml]相比較,兩組間差異有統(tǒng)計學意義(t=5.183 2,P<0.05),說明存在遠處轉移的骨肉瘤患者血漿ADM表達水平高于那些沒有遠處轉移的患者,提示ADM水平的高低與骨肉瘤的遠處轉移密切相關。

表3 健康人群血漿ADM含量

Table 3 Plasma ADM levels in healthy controls

編號性別年齡(歲)血漿ADM(pg/ml)1男2612.32女3311.63男2910.94男2712.85女2412.36男2211.87男2814.98男4512.69女4111.710男3913.7

2.3 ADM在骨肉瘤組織和瘤旁組織中的表達

免疫組化結果顯示骨肉瘤組織中瘤細胞有明顯的ADM標記,呈強陽性表達,主要定位于瘤細胞的外膜和細胞質中,出現(xiàn)粗大的棕黃色顆粒,遍布整個視野(見圖1A);從腫瘤組織到瘤體邊緣的過渡中,ADM蛋白的表達逐漸減弱;瘤旁組織ADM的陽性表達比骨肉瘤組織明顯減弱,僅局部組織呈現(xiàn)輕微的淡染(見圖1B)。

不同組織間的ADM表達強度見表4。

表4 不同組織中ADM的表達強度

Table 4 ADM expression intensity in different tissues

分類 強陽性陽性弱陽性陰性陽性率(%)骨肉瘤 1162195癌旁組織0251335正常組織011820

圖1 ADM在不同組織中的表達Figure 1 ADM expression in different tissues

2.4 骨肉瘤組織中ADM mRNA的表達

人骨肉瘤組織呈ADM mRNA陽性表達,可見擴增片段長度115 bp(ADM)和101 bp(GAPDH)兩條特異性條帶。上述實驗重復兩次,均為陽性表達,結果一致(見圖2A)。其中在20例標本中,骨肉瘤組織中均檢出ADM mRNA陽性表達;瘤旁組織中ADM mRNA陽性表達12例,8例微量表達;正常組織中ADM mRNA均呈微量表達。各組ADM mRNA半定量結果見圖2B,其中標本1號是正常組織,ADM mRNA半定量值為0.21;標本2-3號是瘤旁組織,ADM mRNA半定量值分別為0.55和0.62;標本4-6號是骨肉瘤組織,ADM mRNA半定量值分別為1.71,1.86和1.78。骨肉瘤組織中的ADM mRNA表達量明顯高于瘤旁組織,兩組間差異有統(tǒng)計學意義(t=43.122 2,P<0.05)。

圖2 不同組織中ADM mRNA的表達Figure 2 ADM mRNA expression in different tissues

3 討論

腎上腺髓質素(ADM)是一種人體自身產生的血管活性物質,由52個氨基酸組成,屬于降鈣素基因相關肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)家族成員[7]。ADM作為一種活性肽,具有強大而持續(xù)的降血壓作用;它可以促進小鼠成纖維細胞的增殖并表現(xiàn)為劑量依賴性;它還作用于降鈣素受體樣受體(calcitonin receptor-like receptor,CRLR)與特異性受體活性調節(jié)蛋白(receptor activity modifying protein,RAMP),產生環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP),活化蛋白激酶A(protein kinase A,PKA),提高心肌細胞內鈣,增加心肌收縮力。

進一步的深入研究發(fā)現(xiàn)ADM還具有強烈的促進血管生成和促進腫瘤生長作用。Haddad等[8]總結既往研究結果,提出ADM可能是多數人類惡性腫瘤的自分泌生長因子,在他們的研究中很多組織(乳腺、前列腺、腸道、腦和肺等)來源的腫瘤細胞系幾乎都能分泌ADM。Zhang等[9]檢測了卵巢惡性腫瘤患者和正常人群血漿中的ADM值,結果顯示患者血漿中ADM明顯升高。Li等[10]研究證明,卵巢上皮癌中的ADM表達與腫瘤的分期和預后相關,腫瘤的分期越晚則ADM的表達越強,手術治療后血漿內ADM含量明顯下降,但如果很快又升高常常提示預后不佳。Bozkurt等[11]進一步證明如果在組織中檢測出ADM陽性表達越高,與之對應的術后病理檢查的組織學分級中分化越低。同時進行微血管密度的檢測,采用CD34作為標記物,發(fā)現(xiàn)微血管密度數值的變化總是伴隨著ADM的表達而變化。Dong等[12]的研究證明ADM具有血管生成素的作用,可刺激小雞尿囊絨膜新血管的生成,這與堿性成纖維細胞生長因子作用相似。這些提示ADM與腫瘤的生長密切相關,尤其是ADM在腫瘤側枝循環(huán)和微血管建立中的重要作用,可能在某種程度上促進了惡性腫瘤細胞的快速生長,并導致腫瘤最終遠處轉移的機制之一。

上述關于ADM與腫瘤的相關研究多集中在上皮細胞來源的腫瘤或者腺癌(乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌等),但對于像骨肉瘤這樣來源間葉組織的實體性腫瘤,目前國內外較少關注ADM在人骨肉瘤組織的表達情況,對于ADM與骨腫瘤發(fā)生、發(fā)展之間的關系,更是尚不明確。本文通過對臨床骨肉瘤標本的免疫組化染色發(fā)現(xiàn),ADM在人骨肉瘤組織呈強陽性表達;從腫瘤組織到瘤體邊緣的過渡中,ADM蛋白的表達逐漸減弱;瘤旁組織ADM的陽性表達比骨肉瘤組織明顯減弱,僅局部組織呈現(xiàn)輕微的淡染。RT-PCR檢測ADM mRNA的表達,得到了與免疫組化相似的結果,即ADM在腫瘤組織和其他組織中存在差異化表達。我們進一步檢測了ADM在血漿的中含量,正常人的血漿也有ADM表達,但骨肉瘤患者血漿ADM含量遠高于正常人群,且表現(xiàn)為分期晚且存在遠處轉移的患者血漿ADM表達水平遠高于那些沒有遠處轉移的患者。這些實驗結果都提示ADM在人骨肉瘤組織呈陽性表達,從ADM的變化趨勢上可以推斷ADM與骨肉瘤的生長密切相關,ADM表達水平的高低可能與骨肉瘤的惡性程度和臨床預后密切相關,這與之前ADM在其他腺癌上的觀察結果相近[13]。

骨肉瘤的生長和進展都依賴于血管生成的過程,骨肉瘤從單個的瘤細胞生長到一定體積,僅僅依靠周圍組織液的滲透來完成營養(yǎng)物質和代謝廢物的交換遠遠不夠,并且骨肉瘤生長迅速常常導致瘤體內部處于缺氧狀態(tài),因而必須建立起新的血液供應以滿足骨肉瘤生長的需要[14]。ADM作為一個潛在的腫瘤血管生長因子[15],可以刺激骨肉瘤新生微血管的增生,緩解骨肉瘤內部的缺氧狀態(tài),ADM在骨肉瘤進一步演進過程中的作用值得我們更多的關注,通過討論ADM在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展中的作用,以期為骨肉瘤的診斷與治療等提供一個新的分子生物學指標,而建立以ADM為核心的治療方案很有可能成為治療骨肉瘤的新途徑。