張法煌,張 瑜,袁 芳,劉伊寧,陳 艷,伊麗達娜·斯提瓦爾地,劉 玲#,李 卉

(1新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室,烏魯木齊 830011;2新疆醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院;3新疆醫(yī)科大學(xué)中心實驗室;*通訊作者,E-mail:huihui922@126.com;#共同通訊作者,E-mail:liulingpine@sohu.com)

食管癌是全世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤之一,2015年中國因惡性腫瘤死亡的病例中,食管癌約為18.8萬例,其發(fā)病率呈明顯的地區(qū)差異,新疆是我國食管癌的高發(fā)區(qū)之一,2014年,據(jù)新疆地區(qū)消化道惡性腫瘤發(fā)病及死亡數(shù)據(jù)分析,食管癌位居城市消化道惡性腫瘤的第四位,農(nóng)村消化道惡性腫瘤發(fā)病率之首,其中尤其以哈薩克族人群的發(fā)生率和死亡率最高[1,2]。

近年來腫瘤相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),腫瘤的發(fā)生可能與抑癌基因啟動子區(qū)CpG島甲基化造成抑癌基因關(guān)閉有關(guān)[3],因此腫瘤相關(guān)基因的甲基化可能成為腫瘤早期診斷的標記物,并且對食管癌早期預(yù)防與診斷有重要的價值。

本文采用亞硫酸鹽基因測序法(bisulfite sequence,BS)對食管鱗癌組織及正常組織進行甲基化檢測。BS具有可定性和定量等優(yōu)點,也可作為許多衍生方法的基本原理,更好地解釋DNA甲基化的奧秘,是甲基化檢測的金標準[4,5]。經(jīng)測序后對鱗癌組織及正常組織的不同位點甲基化程度通過秩和檢驗進行分析,以探討RASSF1A和Survivin啟動子區(qū)CpG島異常甲基化程度與哈薩克族食管鱗癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

1 研究內(nèi)容與方法

1.1 研究對象及材料

1.1.1 研究對象 納入標準：新疆哈薩克族食管癌患者術(shù)后常規(guī)病理結(jié)果為鱗狀細胞癌；患者術(shù)前均未接受過任何放療、化療、中草藥等抗腫瘤治療。排除同時患有其他惡性腫瘤患者。

1.1.2 病例資料 食管癌組織標本來源于新疆醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院2009-2011年哈薩克族食管鱗癌患者。食管鱗癌標本29份,匹配遠端無癌組織29份。參照UICC制定的癌國際TNM法分為T1期1份,T2期6份,T3期9份,T4期13份。年齡在46-61歲之間。本研究已獲得新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準。

1.1.3 組織標本的取材及收集 ①鱗癌組織:切取髓質(zhì)型、縮窄型、潰瘍型等病變部位組織;如為早期病變,取材為2/3以上的病變組織,并經(jīng)病理學(xué)證實為鱗狀上皮組織。②遠端無癌組織:手術(shù)切緣最遠端,至少5 cm以上,大體形態(tài)學(xué)正常,并經(jīng)病理學(xué)證實標本切緣無癌組織殘留,為正常鱗狀上皮組織。

收集上述不同部位的手術(shù)標本,大部分置于標記好的凍存管中,立即置于液氮內(nèi)-80 ℃保存。留取一小部分做石蠟包埋、切片、HE染色、顯微鏡讀片,以確定組織形態(tài)學(xué)改變。顯微鏡讀片由兩位病理醫(yī)生分別獨立完成,結(jié)果核實確定后,納入為研究對象。

1.1.4 主要試劑 DNA提取試劑酚,氯仿(Invitrogen,美國),異戊醇(上海生工),乙二胺四乙酸Sigma,(美國),EZ DNA甲基化試劑盒(Zymo Research,美國),引物(上海生物工程有限公司,中國)。

1.2 方法

1.2.1 DNA甲基化處理 ①應(yīng)用DNA提取試劑盒提取組織DNA并純化定量。通過經(jīng)典的酚氯仿法提取組織DNA,DNA樣本取1 μl,用1%瓊脂糖凝膠電泳對樣本進行片段質(zhì)量檢測,利用紫外分光光度計對濃度進行檢測。②使用DNA甲基化試劑盒對樣本的DNA進行重亞硫酸鹽處理和純化,將未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶。

1.2.2 PCR擴增 利用Primer6.0軟件進行引物設(shè)計。設(shè)計4個片段的引物,該引物對甲基化目的序列實現(xiàn)擴增。基因的CpG島通過在線軟件Meth Primer確定。PCR反應(yīng)中RASSF1A基因和survivin基因引物見表1。反應(yīng)體系均為20 μl:1x HotStarTaq緩沖液,2.0 mmol/L Mg2+,0.2 mmol/L dNTP,0.2 μmol/L引物,1 U DNA聚合酶和1 μl DNA模板。反應(yīng)條件見表2。

表1 PCR引物序列、片段大小

Table 1 Primer sequence and fragment size of PCR

基因 位點 引物序列(5′-3′) PCR產(chǎn)物大小(bp)RASSF1A1 MF:GGGGAGTTTGAGTTTATTGAGTT2971 MR:CTACCCCTTAACTACCCCTTCCRASSF1A2 MF:CCCAAGCCCACTGAGGAT2422 MR:ACCACTGCCTGGGAATGGGAGAACCsurvivin1 MF:TGCCTTCAACTTACAAAC2991 MR:ATACCCTTCACCCAGATTsurvivin2 MF:TGGTTTTTGAGAAAGGGTTGT3782 MR:CCTACCTAAACCTCTCAAAATATTAAA

MF:甲基化正向引物;MR:甲基化反向引物

表2 PCR反應(yīng)條件

Table 2 Conditions for PCR reaction

基因 位點預(yù)變性11個循環(huán)變性退火延伸總延伸RASSF1A195 ℃ 15 min94 ℃ 20 s58 ℃ 40 s72 ℃ 1 min72 ℃ 2 min295 ℃ 15 min94 ℃ 20 s57 ℃ 30 s72 ℃ 1 min72 ℃ 2 minsurvivin195 ℃ 15 min94 ℃ 20 s60 ℃ 40 s72 ℃ 1 min72 ℃ 2 min295 ℃ 15 min94 ℃ 20 s55 ℃ 30 s72 ℃ 1 min72 ℃ 2 min

1.2.3 PCR產(chǎn)物純化 取1 U蝦堿酶(SAP)和6 U外切酶Ⅰ(EXO Ⅰ)加入到8 μl PCR產(chǎn)物中,37 ℃孵育60 min后70 ℃孵育10 min,消化PCR擴增體系中多余的dNTPs和引物,以便后續(xù)的測序。

1.2.4 測序反應(yīng) 反應(yīng)體系:2 μl BigDye3.1 mix,2 μl測序引物(0.4 μmol/L),2 μl PCR純化產(chǎn)物。反應(yīng)參數(shù):96 ℃預(yù)變性1 min;96 ℃變性10 s,28個循環(huán);57 ℃退火5 s;60 ℃延伸4 min。

1.2.5 測序 測序產(chǎn)物上ABI3130XL測序儀進行測序。

1.3 統(tǒng)計分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件。29對樣本甲基化結(jié)果用0,1,2,3,4分別代表每個CpG的甲基化程度;0為不甲基化,1為<33%,2為33%-67%,3為>67%-<99%,4為99%-100%。采用秩和檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RASSF1A基因測序結(jié)果及比較

在29對標本中,比較了RASSF1A基因啟動子區(qū)2個位點,在29個樣本測序圖中隨機截圖標注(見圖1),差異無統(tǒng)計學(xué)意義(見表3)。

藍色箭頭所指代表CpG序列甲基化,紅色箭頭所指代表CpG序列未甲基化圖1 RASSF1A部分樣本甲基化及未甲基化位點截圖Figure 1 Screenshots of methylated and unmethylated sites in part of RASSF1A samples

2.2 survivin基因測序結(jié)果及比較

在29對標本中,比較了survivin基因啟動子區(qū)2個位點,在29個樣本測序圖中隨機截圖標注(見圖2),有1個位點癌組織甲基化程度高于正常組織,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(見表4)。

表3 RASSF1A基因29對樣本2個位點甲基化程度比較(例)

Table 3 Comparison of methylation degree of RASSF1A in 29 matched samples at two sites(cases)

位點甲基化程度癌組織癌旁組織ZP位點102327-1.1550.248141221位點202522-0.6320.527126221

藍色箭頭所指代表CpG序列甲基化,紅色箭頭所指代表CpG序列未甲基化圖2 survivin部分樣本甲基化及未甲基化位點截圖Figure 2 Screenshots of methylated and unmethylated sites in part of survivin samples

表4 survivin基因29對樣本2個位點甲基化程度比較(例)

Table 4 Comparison of methylation degree of survivin in 29 matched samples at two sites(cases)

位點甲基化程度癌組織癌旁組織ZP位點102923-2.0000.046206位點202625-1.0000.317201

3 討論

DNA甲基化是表觀遺傳修飾的主要方式之一,甲基化修飾主要發(fā)生于基因啟動子附近的CpG島,可通過激活或沉默腫瘤原癌基因或腫瘤抑制基因的表達從而影響其發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后[6,7]。近些年,對基因啟動子區(qū)CpG島甲基化的研究成為表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域的熱點之一,在食管癌中,頻繁發(fā)生啟動子區(qū)甲基化的基因具有作為分子標志物的潛力,可能成為潛在的分子靶點[8]。

Ras相關(guān)家族(Ras association domain family gene-1A,RASSF1A)是位于人類染色體3p21.3上的抑癌基因,與食管癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[9]。研究發(fā)現(xiàn),RASSF1A基因啟動子甲基化和肺癌、乳腺癌、膀胱癌等惡性腫瘤易感性存在緊密聯(lián)系,并與預(yù)后相關(guān),有望成為臨床的早期生物標志物[10]。孟凡勇等[11]研究表明,RASSF1A基因啟動子甲基化可能參與了胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程,有可能作為胃癌分級、預(yù)后評估的新指標。在食管癌相關(guān)研究中,RASSF1A基因甲基化陽性檢測率顯著高于癌旁組織,且明顯高于腫瘤標志物的陽性檢測率,因此在食管癌中,RASSF1A基因啟動子區(qū)甲基化的變化具有預(yù)警價值[12]。本實驗中,在29對標本比較食管鱗癌組織與癌旁遠端正常組織RASSF1A基因啟動子區(qū)2個CpG島位點甲基化程度,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),可能與樣本量及地域差異性相關(guān)。

Survivin是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein,IAP)家族的新成員,參與調(diào)控細胞重要的生理病理過程,具有抑制細胞凋亡、促進細胞增殖和腫瘤間質(zhì)血管形成等作用[13]。survivin基因含有一個大的CpG島,從啟動子區(qū)一直延伸到第一外顯子區(qū)域,提示其甲基化修飾可能參與survivin基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。在食管鱗狀細胞癌組織中,有研究證實survivin的表達與否與其CpG島的甲基化狀態(tài)無關(guān),提示該區(qū)域的甲基化修飾未參與調(diào)控survivin基因的轉(zhuǎn)錄[7]。我們的前期結(jié)果表明[14-17],在哈薩克族食管鱗癌癌組織中,survivin mRNA水平表達的增高對其發(fā)生、發(fā)展過程中起到了一定的作用;survivin基因在36對癌組織及正常組織中,癌組織表達占69%,明顯高于正常組織,癌組織和正常組織啟動子區(qū)多為部分甲基化狀態(tài),提示哈薩克族食管鱗癌中survivin基因啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài)可能是其高表達原因之一,并且已成功構(gòu)建survivin基因啟動子區(qū)CpG島真核表達載體,以探討其甲基化在哈薩克族食管癌中的作用。本實驗中,在29對標本中比較食管鱗癌組織與正常組織survivin基因啟動子區(qū)2個CpG島位點甲基化程度,有1個位點癌組織甲基化程度高于正常組織,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.046)。

綜上所述,哈薩克族食管鱗癌患者癌組織中RASSF1A和survivin啟動子區(qū)甲基化程度與正常組織比較,RASSF1A甲基化程度未見明顯差異,Survivin甲基化程度高于正常組織,提示哈薩克族食管鱗癌的發(fā)生與RASSF1A基因啟動子區(qū)甲基化程度可能不直接相關(guān),而survivin基因啟動子區(qū)異常甲基化可能與其發(fā)生有關(guān),兩者在哈薩克族食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展中作用與其在其他民族中的作用可能有所不同,具體機制仍需擴大樣品量和方法進一步研究。