葉 蕓,李蘇亮,郝曉柯

(1西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院輸血科,西安 710077;2空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院檢驗(yàn)科;*通訊作者,E-mail:haoxkg@fmmu.edu.cn)

前列腺癌(prostate cancer, PCa)是男性泌尿系統(tǒng)較常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,發(fā)病率在歐美人群中居首位,死亡率僅次于肺癌[1]。隨著我國(guó)人口老齡化及飲食結(jié)構(gòu)的改變,前列腺癌的發(fā)病率逐漸增加。miRNA是一類19-24 nt左右的非編碼RNA,可與靶mRNA3′UTR結(jié)合并調(diào)控基因表達(dá),導(dǎo)致靶基因異常[2,3]。miRNA的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展存在關(guān)聯(lián)[4],有關(guān)循環(huán)miRNA和前列腺癌之間關(guān)系的研究已經(jīng)有很多報(bào)道,包括多種miRNAs如375、34a、141、let-7a等[5,6]。Bryant等[7]和Selth等[8]分別通過(guò)臨床試驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)轉(zhuǎn)移性PCa與miR-141水平相關(guān),轉(zhuǎn)移性PCa的miR-141水平高于未轉(zhuǎn)移者。然而,關(guān)于miR-141對(duì)于前列腺癌骨轉(zhuǎn)移發(fā)生發(fā)展的作用及確切調(diào)控機(jī)制等問(wèn)題尚需進(jìn)一步研究明確。本文旨在探討miR-141-3p與DLC1在調(diào)控前列腺癌骨轉(zhuǎn)移發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用,為前列腺癌骨轉(zhuǎn)移的診斷及治療提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象 ①細(xì)胞株:人前列腺癌細(xì)胞MDA PCa 2b和人前列腺上皮細(xì)胞RWPE-1購(gòu)自美國(guó)模式菌種收集中心ATCC(Manassas, VA, USA)。②實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:6周齡Balb/c裸鼠購(gòu)自空軍軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。③血清樣本:收集2013-01～2018-08于我院病理確診的前列腺癌骨轉(zhuǎn)移患者,局限性前列腺癌患者及年齡匹配的門(mén)診體檢健康男性血清樣本(清晨空腹靜脈血3 ml),每組各20例。本研究已通過(guò)西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審核(批號(hào):XYFY-0131)。

1.1.2 主要試劑與儀器 F12K細(xì)胞培養(yǎng)基(Gibco BRL Co. Ltd.,USA);青霉素100 U/ml和鏈霉素100 U/ml(HyClone,Logan,UT,USA);胎牛血清(Gibco BRL Co.Ltd.,USA);mirVana miRNA分離試劑盒(Ambion公司);M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara公司);Trizol試劑盒(Invitrogen公司);TRAP染色試劑盒(Sigma公司);ALP染色試劑盒(Solarbio公司);HE染色試劑盒及Masson染色試劑盒(北京索萊寶生物科技公司);鼠抗兔多克隆DLC1抗體、鼠抗兔多克隆Cdc42抗體、鼠抗兔多克隆p38抗體、鼠抗兔多克隆OPG抗體(Abcam公司);賽默飛世爾CO2培養(yǎng)箱(Thermo Fisher公司);美國(guó)ABI 7500 PCR儀(美國(guó)ABI公司);Siemens Inveon Micro-CT(德國(guó)Siemens公司);小動(dòng)物氣體麻醉機(jī)(美國(guó)harvard公司);RM2245石蠟切片機(jī)(德國(guó)Leica公司);Illumina HiSeqTM 2500測(cè)序儀(Illumina公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) MDA PCa 2b和RWPE-1細(xì)胞使用含有L-谷氨酰胺的F12K細(xì)胞培養(yǎng)基,10%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基中,置于37 ℃ 5%CO2環(huán)境的培養(yǎng)箱中。

1.2.2 miR-141-3p與DLC1之間靶向關(guān)系預(yù)測(cè) 應(yīng)用miRGator 3.0軟件及TargetScan Human 7.1,對(duì)miR-141-3p與DLC1之間靶向關(guān)系進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.2.3 樣本中總RNA的提取及real-time PCR Trizol法提取細(xì)胞中RNA,檢測(cè)RNA純度。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara)操作說(shuō)明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,將所得的cDNA加入75 μl ddH2O稀釋用作real-time PCR模板,real-time PCR的程序設(shè)置:94 ℃進(jìn)行預(yù)變性2 min,94 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,72 ℃ 10 min,共40個(gè)循環(huán)。在ABI 7500(Applied Biosystems)PCR儀上進(jìn)行操作,使用2-ΔΔCt法計(jì)算miRNA相對(duì)表達(dá)量,qRT-PCR引物購(gòu)自上海生工生物科技有限公司,引物序列見(jiàn)表1。

表1 RT-PCR引物序列

Table 1 Primer sequences used for real-time PCR

基因序列 DLC1F:TGGACAACGACCGAACCACADLC1R:CCATCTCAGTCGGTGCCTGTGAPDHF:GGGTGTGAACCATGAGAAGTGAPDHR:GACTGTGGTCATGAGTCCTmiR-141-3pRT:GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTC GCACTGGATACGACCCATCTTTmiR-141-3pF:ATGGTTCGTGCGTAACACTGTCTGGTAAAU6 HoMsRnF:GCTTCGGCAGCACATATACTAAAATU6 HoMsRnR:CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT通用HoMsRnR:GCAGGGTCCGAGGTATTC

1.2.4 構(gòu)建cDNA文庫(kù) 凝膠電泳進(jìn)行miRNA分離純化,然后逆轉(zhuǎn)錄進(jìn)行cDNA的合成,分別在3′端與5′端進(jìn)行接頭連接,最后PCR擴(kuò)增,獲取miRNA的測(cè)序文庫(kù)。根據(jù)Illumina Hi SeqTM 2500測(cè)序儀的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行操作,將cDNA文庫(kù)上機(jī)測(cè)試。該部分實(shí)驗(yàn)是由廣州銳博生物公司檢測(cè)完成。

1.2.5 生物信息學(xué)分析 通過(guò)對(duì)樣本進(jìn)行測(cè)序所得50 nt原始序列集(raw reads)初步過(guò)濾,獲得干凈序列(clean reads),統(tǒng)計(jì)計(jì)算序列長(zhǎng)度的分布和樣本的共有序列。將clean reads進(jìn)行分類和注釋,得到樣品中各種sRNA(小分子RNA)的成分和表達(dá)信息。去除miRNA外的非編碼RNA的序列后,和miRBase 21.0數(shù)據(jù)庫(kù)已知人類的miRNA序列進(jìn)行了比較。當(dāng)所有的小RNA片段均被注釋后,用校正公式進(jìn)行miRNA表達(dá)值的計(jì)算。使用散點(diǎn)圖和log2Ratio進(jìn)行比較共表達(dá)miRNA的表達(dá)量。| log2(Fold Change)|=log2(樣品2 RPM值/樣品1 RPM值)絕對(duì)值。利用edger分析對(duì)每個(gè)組中miRNA差異的顯著性進(jìn)行分析并計(jì)算P值,以此為基礎(chǔ)計(jì)算-log10P值并篩選差異表達(dá)的miRNA。

1.2.6 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 采用PCR的方法,按照DLC1(human) 3′UTR的序列信息來(lái)設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物,293T基因組DNA作為模板擴(kuò)增其DLC1 3′ UTR的序列并克隆至pmiR-RB-REPORTTM雙熒光素酶的報(bào)告載體之中,載體報(bào)告熒光是hRluc,校正熒光是hluc。以野生型載體為基礎(chǔ),利用PCR的方法設(shè)計(jì)突變引物構(gòu)建突變載體,將靶序列CAGTGTTA突變成為GTCACAAT(mut1),CAGTGTT突變成為GTCACAA(mut2)。37 ℃ 5% CO2的常規(guī)條件下培養(yǎng)293T細(xì)胞,將293T細(xì)胞1.5×104/孔的濃度接種至96孔板,每孔的體積為100 μl,37 ℃培養(yǎng)24 h。按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染步驟將野生型及突變型報(bào)告質(zhì)粒分別與mimics(內(nèi)源性成熟miRNA功能活性增強(qiáng)劑)及mimics NC(陰性對(duì)照)共轉(zhuǎn),轉(zhuǎn)染結(jié)束后,使用熒光照度計(jì)進(jìn)行熒光值的測(cè)定。

1.2.7 轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn) miR-141-3p mimics,陰性對(duì)照寡核苷酸(miR-NC),miR-141-3p inhibitor,陰性對(duì)照寡核苷酸(anti-miR-NC)購(gòu)自Ribo Bio公司(中國(guó)廣州)。按照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染步驟進(jìn)行,轉(zhuǎn)染效率通過(guò)熒光顯微鏡計(jì)算熒光素標(biāo)記細(xì)胞的百分比。

1.2.8 前列腺癌骨轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型構(gòu)建 6周齡雄性Balb/c裸鼠分為兩組,分別尾靜脈注射轉(zhuǎn)染miR-141-3p mimics的前列腺癌骨轉(zhuǎn)移細(xì)胞MDA PCa 2b和未轉(zhuǎn)染MDA PCa 2b,每周3次,每次100 μg/只;注射3周后,兩組動(dòng)物分別在右側(cè)股骨和脛骨骨內(nèi)注射2.0×106轉(zhuǎn)染miR-141-3p mimics的MDA PCa 2b細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染的MDA PCa 2b細(xì)胞,利用micro-CT觀察動(dòng)物成瘤情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 18.0軟件(SPSS Inc.,Chicago, IL, USA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)分析非參數(shù)數(shù)據(jù);采用單因素方差分析(ANOVA)和Tukey檢驗(yàn)對(duì)參數(shù)數(shù)據(jù)進(jìn)行組間比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-141-3p在血清中的差異表達(dá)

RT-PCR檢測(cè)前列腺癌骨轉(zhuǎn)移患者、局限性前列腺癌患者、健康人血清中miR-141-3p的表達(dá)水平,結(jié)果顯示,前列腺癌骨轉(zhuǎn)移患者血清miR-141-3p的表達(dá)水平顯著升高(見(jiàn)圖1)。

與健康對(duì)照比較，*P<0.05，**P<0.01;與局限性前列腺癌比較，##P<0.01圖1 前列腺癌骨轉(zhuǎn)移患者、局限性前列腺癌患者、健康人血清miR-141-3p的表達(dá)水平Figure 1 Serum levels of miR-141-3p in prostate cancer patients with bone metastasis, patients with localized prostate cancer and normal controls

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)液miRNAs差異表達(dá)分析

前列腺癌骨轉(zhuǎn)移細(xì)胞株MDA PCA 2b與前列腺正常上皮細(xì)胞RWPE-1差異表達(dá)的50個(gè)miRNA聚類分析能完全區(qū)分兩株細(xì)胞(見(jiàn)圖2)。前列腺癌骨轉(zhuǎn)移細(xì)胞株MDA PCA 2b表達(dá)上調(diào)的前3名分別是miR-375,miR-200c-3p和miR-141-3p;表達(dá)下調(diào)前3名分別是miR-100-5p,miR-584-5p和miR-125b-1-3p(見(jiàn)圖3)。

2.3 miR-141-3p靶基因預(yù)測(cè)

采用miRGator V3.0數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)miR-141-3p的靶基因及作用位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析,結(jié)果顯示DLC1為miR-141-3p可能作用的靶分子(見(jiàn)圖4)。

藍(lán)色從淺到深變化意味表達(dá)量越低;紅色從淺到深變化意味表達(dá)量越高圖2 miRNA表達(dá)差異的熱圖Figure 2 Heatmap of miRNA differential expression

圖3 miRNA表達(dá)差異的火山圖Figure 3 Volcano plot of miRNA differential expression

圖4 miR-141-3pp的靶基因及作用位點(diǎn)預(yù)測(cè)Figure 4 Prediction of the miR-141-3p target gene

2.4 miR-141-3p靶基因驗(yàn)證

靶基因驗(yàn)證結(jié)果顯示，hsa-miR-141-3p mimic顯著下調(diào)DLC1野生型報(bào)告熒光,利用突變載體mut1將預(yù)測(cè)靶位點(diǎn)突變后其突變載體的報(bào)告熒光值升高;而利用突變載體mut2將預(yù)測(cè)靶位點(diǎn)突變后其突變載體的報(bào)告熒光值仍舊明顯下調(diào),結(jié)果顯示hsa-miR-141-3p很可能通過(guò)突變載體mut1所突變的位點(diǎn)來(lái)調(diào)控靶基因的表達(dá)(見(jiàn)圖5)。為了進(jìn)一步證實(shí)miR-141-3p對(duì)DLC1的靶向負(fù)調(diào)控作用,我們用miR-141-3p mimics和inhibitor轉(zhuǎn)染成骨細(xì)胞,結(jié)果顯示隨著miR-141-3p水平的升高,DLC1在蛋白水平及mRNA水平表達(dá)顯著下降(P<0.01,見(jiàn)圖6)。

2.5 前列腺癌骨轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型構(gòu)建

2個(gè)月后,轉(zhuǎn)染組的右腿股骨和脛骨處出現(xiàn)明顯骨轉(zhuǎn)移瘤,未轉(zhuǎn)染組未見(jiàn)明顯轉(zhuǎn)移瘤(見(jiàn)圖7)。

2.6 兩組裸鼠骨組織的病理染色結(jié)果

對(duì)兩組裸鼠的骨組織進(jìn)行病理染色分析,HE染色發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染組骨轉(zhuǎn)移瘤病理表現(xiàn)為絕大部分成骨性改變成骨細(xì)胞增殖,腫瘤間質(zhì)組織減少,骨小梁結(jié)構(gòu)破壞,腫瘤細(xì)胞排列緊密,極性消失,核漿比例失調(diào),病理性核分裂相多見(jiàn);未轉(zhuǎn)染組骨小梁結(jié)構(gòu)完整,可見(jiàn)較為明顯的骨髓腔結(jié)構(gòu),未見(jiàn)腫瘤細(xì)胞。ALP染色發(fā)現(xiàn)本實(shí)驗(yàn)中轉(zhuǎn)染組可見(jiàn)大量ALP染色呈棕色的成骨細(xì)胞增殖;未轉(zhuǎn)染組ALP染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量較少,且陽(yáng)性程度較弱。Masson染色顯示轉(zhuǎn)染組骨組織成熟程度明顯增強(qiáng)。TRAP染色結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染組破骨細(xì)胞分布較另外兩組明顯減少(見(jiàn)圖8)。免疫組化染色顯示轉(zhuǎn)染組骨組織中DLC1陰性表達(dá),Cdc42、p38及OPG呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá);未轉(zhuǎn)染組骨組織中DLC1呈陽(yáng)性表達(dá)(見(jiàn)圖9)。

與DLC1-Mut1+NC比較,**P<0.01圖5 miR-141-3p靶基因驗(yàn)證Figure 5 Identification of the miR-141-3p target gene

與mimics比較，**P<0.01圖6 miR-141-3p表達(dá)與DLC1的相關(guān)性Figure 6 The correlation between miR-141-3p expression and DLC1

A.轉(zhuǎn)染組可見(jiàn)大量云霧狀骨密度增高性陰影,呈成骨性改變;B.未轉(zhuǎn)染組未見(jiàn)明顯骨密度增高性陰影圖7 動(dòng)物模型構(gòu)建Figure 7 Mouse xenograft model establishment

圖8 兩組裸鼠骨組織的病理染色結(jié)果Figure 8 The pathological staining of bone tissues in two groups

免疫組化染色結(jié)果以細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕褐色或棕褐色顆粒為陽(yáng)性結(jié)果圖9 兩組裸鼠的骨組織免疫組化染色結(jié)果Figure 9 The results of immunohistochemical staining of bone tissues in two groups

3 討論

前列腺癌在全世界范圍內(nèi)已成為備受關(guān)注的公共健康問(wèn)題。據(jù)統(tǒng)計(jì),全球新發(fā)前列腺癌患者占新發(fā)癌癥患者總數(shù)的11.7%。miR-141屬于miR-200家族,位于人類的12號(hào)染色體(12p13.31),而腫瘤組織中經(jīng)常出現(xiàn)該區(qū)域的點(diǎn)突變、易位及染色體缺失。miRNA-141的前體可以在細(xì)胞漿中經(jīng)過(guò)剪切和加工產(chǎn)生miR-141-3p和miR-141-5p兩個(gè)成熟產(chǎn)物[9]。

Volinia等[10]在前列腺癌的研究中分析了56例腫瘤組織和7例非腫瘤組織,結(jié)果表明在前列腺癌中有39個(gè)miRNA上調(diào),6個(gè)miRNA下調(diào)。Mitchell等[11]分析了50個(gè)人的血清標(biāo)本,發(fā)現(xiàn)miR-141,miR-125b,miR-143和miR-296在轉(zhuǎn)移性前列腺癌組的血清中高表達(dá),其中miR-141的差異最為顯著,其表達(dá)上調(diào)46倍。大量研究證實(shí)miRNA在前列腺癌發(fā)生及發(fā)展中表達(dá)失調(diào),且前列腺癌患者與正常人群之間存在差異表達(dá)[12,13]。另有研究發(fā)現(xiàn)異常表達(dá)的exosomal miR-141-3p與前列腺癌骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生有關(guān)[14,15]。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)前列腺癌miR-141-3p的表達(dá)水平顯著升高且與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究識(shí)別了前列腺癌骨轉(zhuǎn)移細(xì)胞株MDA PCA 2b與前列腺正常上皮細(xì)胞RWPE-1差異表達(dá)的50個(gè)miRNA聚類分析能完全區(qū)分兩株細(xì)胞。前列腺癌骨轉(zhuǎn)移細(xì)胞株MDA PCA 2b的exosomes表達(dá)上調(diào)的前3名分別是miR-375,miR-200c-3p和miR-141-3p;表達(dá)下調(diào)前3名分別是miR-100-5p,miR-584-5p和miR-125b-1-3p。

本研究中,靶基因驗(yàn)證結(jié)果顯示hsa-miR-141-3p mimic顯著下調(diào)DLC1野生型報(bào)告熒光,且很可能是通過(guò)mut1所突變的位點(diǎn)來(lái)調(diào)控靶基因的表達(dá)。miR-141-3p mimics/inhibitor轉(zhuǎn)染成骨細(xì)胞,結(jié)果顯示隨著miR-141-3p水平的升高,DLC1在蛋白水平及mRNA水平表達(dá)顯著下降,進(jìn)一步證實(shí)miR-141-3p對(duì)DLC1的靶向負(fù)調(diào)控作用。

前列腺癌骨轉(zhuǎn)移主要表現(xiàn)為成骨性骨轉(zhuǎn)移,其影像學(xué)表現(xiàn)呈棉團(tuán)狀、牙質(zhì)樣、磨玻璃狀的密度增高影。前列腺癌細(xì)胞與成骨/破骨細(xì)胞之間相互作用,打破正常的成骨/破骨細(xì)胞動(dòng)態(tài)平衡最終發(fā)生成骨性骨轉(zhuǎn)移[16]。p38MAPK作為細(xì)胞內(nèi)的一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是細(xì)胞外信號(hào)引起核內(nèi)反應(yīng)的重要通道,可被多種刺激因子激活,通過(guò)影響基因的轉(zhuǎn)錄和調(diào)控改變細(xì)胞的生物學(xué)行為[17]。研究發(fā)現(xiàn)p38MAPK在成骨細(xì)胞的增殖、分化、凋亡過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用[18]。成骨分化相關(guān)基因OPG變化在調(diào)節(jié)成骨/破骨細(xì)胞之間的平衡中起到重要的作用[19]。

本研究利用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明miR-141-3p顯著促進(jìn)前列腺癌骨轉(zhuǎn)移,通過(guò)micro-CT、病理染色進(jìn)一步證實(shí)miR-141-3p靶向抑制DLC1的表達(dá)進(jìn)而激活Cdc42和P38 MAPK的磷酸化,從而使P38 MAPK信號(hào)通路激活,促進(jìn)成骨活性基因表達(dá),升高OPG表達(dá),為前列腺癌成骨性骨轉(zhuǎn)移微環(huán)境的形成奠定了基礎(chǔ)。充分證實(shí)miR-141-3p在前列腺癌骨定向侵襲、骨轉(zhuǎn)移灶形成等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。