王貴佐,韓 冬*,張 薇,張葉欽,王少純,張永紅

(1陜西省人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科,西安 710068;2西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸與危重醫(yī)學(xué)科;*通訊作者,E-mail:sesory@yeah.net)

急性肺損傷(acute lung injury,ALI)/急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是指由心源性以外的各種肺內(nèi)、外致病因素導(dǎo)致的急性、進(jìn)行性呼吸衰竭,其主要病理特征為肺泡上皮細(xì)胞及毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷,通透性增高,富含蛋白質(zhì)的液體大量滲出,造成彌漫性肺泡及肺間質(zhì)水腫,進(jìn)而透明膜形成,甚至出現(xiàn)肺間質(zhì)纖維化[1]。目前研究發(fā)現(xiàn)ALI/ARDS的發(fā)病機(jī)制包括炎癥反應(yīng)/抗炎反應(yīng)、氧化反應(yīng)/抗氧化反應(yīng)的失衡,其發(fā)病率及病死率極高,尚無(wú)有效的治療藥物[2]。因此,開(kāi)發(fā)新的治療藥物對(duì)于ALI/ARDS的治療具有重要的臨床實(shí)踐意義。

腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,AMPK可促進(jìn)ATP的產(chǎn)生,抑制分解,是廣泛參與人體糖、蛋白質(zhì)和脂肪代謝的重要蛋白激酶。AMPK常見(jiàn)的激動(dòng)劑有二甲雙胍及AICAR等[3],研究發(fā)現(xiàn),激活腺苷酸活化蛋白激酶可對(duì)急性肺損傷動(dòng)物模型發(fā)揮保護(hù)作用[4],其作用機(jī)制尚待研究。對(duì)糖尿病小鼠模型研究發(fā)現(xiàn),激活A(yù)MPK可以上調(diào)PGC1α的表達(dá),增強(qiáng)抗氧化能力,減輕糖尿病腎病損害[5]。然而激活A(yù)MPK對(duì)急性肺損傷的保護(hù)作用是否通過(guò)上調(diào)PGC1α尚不明確。

在本研究中,通過(guò)LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷模型,評(píng)估二甲雙胍激活A(yù)MPK信號(hào)通路對(duì)急性肺損傷發(fā)揮保護(hù)作用及可能的機(jī)制,為急性肺損傷治療提供新的思路與方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要試劑

6-8周齡雄性SPF級(jí)BALB/c小鼠(動(dòng)物生產(chǎn)許可證SYXK(陜)2016-006),體質(zhì)量20-25 g,由陜西省人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心提供。二甲雙胍(格華止,國(guó)藥準(zhǔn)字H20023371),由上海施貴寶制藥有限公司提供。脂多糖[Lipopolysaccharide(LPS),Escherichia coli 055:B5]購(gòu)于Sigma-Aldrich。兔抗鼠AMPK、p-AMPK一抗購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling Technology公司,兔抗鼠PGC1α抗體來(lái)源于美國(guó)Novus Biological,HRP偶聯(lián)的羊抗兔抗體由美國(guó)Sigma-Aldrich提供,髓過(guò)氧化物酶(MPO)檢測(cè)試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所。RIPA裂解液由武漢博士德生物工程有限公司提供。

1.2 模型制作和實(shí)驗(yàn)分組

6-8周齡雄性BALB/c小鼠15只隨機(jī)分為:對(duì)照組,氣管內(nèi)滴注無(wú)菌PBS 60 μl,作用24 h;LPS模型組(LPS),氣管插管,氣道內(nèi)滴注1 mg/ml LPS 60 μl,作用24 h;二甲雙胍組(Met+LPS),在氣管插管氣道滴注LPS前30 min,腹腔注射二甲雙胍(250 mg/kg),再氣管內(nèi)滴注1 mg/ml LPS 60 μl,作用24 h。小鼠均在陜西省人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng),氣道給藥24 h后處死小鼠。

1.3 支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)及肺組織樣本采集

造模后24 h,腹腔注射10%水合氯醛0.8 ml/100 g處死小鼠,用4 ℃預(yù)冷無(wú)菌PBS 0.7 ml支氣管肺泡灌洗,重復(fù)灌洗3次,支氣管肺泡灌洗液的回收率達(dá)80%。BALF在4 ℃,1 000g,離心10 min。分別收集上清和沉淀,BALF上清液在-80 ℃保存?zhèn)溆?。?xì)胞沉淀用無(wú)菌PBS重新重懸,利用細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。取細(xì)胞沉淀涂片,瑞氏染色,計(jì)數(shù)中性粒細(xì)胞。分離右肺組織并在-80 ℃保存。

1.4 肺組織病理學(xué)檢查

取出分離后的左肺組織利用10%中性緩沖甲醛液固定,石蠟包埋,切片(5 μm),蘇木精-伊紅(HE)染色,觀察肺組織病理學(xué)變化。

1.5 髓過(guò)氧化物酶(MPO)活性檢測(cè)

MPO活性是中性粒細(xì)胞功能標(biāo)志和啟動(dòng)標(biāo)志，肺組織內(nèi)中性粒細(xì)胞大量聚集可導(dǎo)致MPO活性明顯升高。稱取一定重量的肺組織，加入5倍體積4 ℃預(yù)冷的生理鹽水，利用超聲法制作組織勻漿，利用南京建成生物工程研究所提供的MPO檢測(cè)試劑盒在460 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行比色測(cè)定，從而得出MPO的活力，其活力高低反映炎癥的嚴(yán)重程度。

1.6 免疫印跡法檢測(cè)PGC1α、AMPK及p-AMPK

精密稱取各組小鼠肺組織,根據(jù)RIPA裂解液使用說(shuō)明書制備肺組織勻漿,肺組織與RIPA裂解液的比例為1 mg ∶7.5 μl,用玻璃勻漿器上下、旋轉(zhuǎn)充分碾磨。在冰上裂解1 h后,14 000g離心20 min,取上清,利用Western blot檢測(cè)各組小鼠肺組織PGC1α(1 ∶800)表達(dá)、AMPK(1 ∶500)及p-AMPK(1 ∶500)變化,PGC1α表達(dá)應(yīng)用GAPDH(1 ∶5 000)作為內(nèi)參校正。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 二甲雙胍對(duì)肺組織病理改變的影響

LPS模型組內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞被嚴(yán)重破壞,肺水腫、肺出血及以中性粒細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞在肺組織內(nèi)大量浸潤(rùn),肺部正常的組織形態(tài)結(jié)構(gòu)消失;二甲雙胍治療組顯著抑制LPS誘發(fā)的肺組織上述改變;對(duì)照組未見(jiàn)小鼠肺組織內(nèi)明顯的炎癥反應(yīng)(見(jiàn)圖1)。

A.對(duì)照組 B.LPS組 C.Met+LPS組圖1 二甲雙胍對(duì)LPS誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷病理改變的影響 (HE染色,×200)Figure 1 Effect of metformin on pathological changes of LPS-induced acute lung injury in mice (HE staining,×200)

2.2 二甲雙胍對(duì)小鼠肺組織浸潤(rùn)炎癥細(xì)胞數(shù)的影響

與對(duì)照組相比,氣道內(nèi)滴注LPS后24 h,BALF 中的炎癥細(xì)胞總數(shù)顯著升高(P<0.01),與之相對(duì)應(yīng)的是肺組織內(nèi)中性粒細(xì)胞數(shù)同樣顯著升高(P<0.01),而應(yīng)用二甲雙胍預(yù)處理后,以中性粒細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞總數(shù)在肺組織內(nèi)的浸潤(rùn)顯著減輕(見(jiàn)圖2)。

與對(duì)照組比較,*P<0.01;與LPS模型組比較,#P<0.01圖2 二甲雙胍對(duì)小鼠支氣管肺泡灌洗液內(nèi)浸潤(rùn)炎癥細(xì)胞數(shù)的影響 (n=4)Figure 2 Effect of metformin on inflammatory cell numbers in BALF of mice (n=4)

2.3 二甲雙胍對(duì)MPO活性的影響

與對(duì)照組相比,LPS模型組肺組織內(nèi)代表中性粒細(xì)胞聚集數(shù)目的MPO活性顯著升高(P<0.01,見(jiàn)圖3),給予二甲雙胍預(yù)處理后,MPO活性顯著下降。提示AMPK激動(dòng)劑二甲雙胍預(yù)處理可顯著減輕LPS誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷炎癥反應(yīng)程度。

2.4 二甲雙胍對(duì)肺組織內(nèi)PGC1α表達(dá)的影響

進(jìn)一步探討AMPK激動(dòng)劑二甲雙胍對(duì)過(guò)氧化物酶體增殖活化受體γ共激活因子-1α(peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator 1α,PGC1α)表達(dá)的影響。Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較,LPS模型組小鼠肺組織內(nèi)PGC1α的表達(dá)明顯減少,應(yīng)用二甲雙胍提前干預(yù)處理后,肺組織內(nèi)PGC1α表達(dá)較前顯增加(見(jiàn)圖4)。提示二甲雙胍可誘導(dǎo)PGC1α的表達(dá)。

與對(duì)照組比較,*P<0.01;與LPS模型組比較,#P<0.01圖3 二甲雙胍對(duì)肺組織內(nèi)MPO活性的影響 (n=4)Figure 3 Effect of metformin on MPO activity in lung tissues (n=4)

2.5 二甲雙胍對(duì)急性肺損傷小鼠肺組織AMPK磷酸化水平的影響

AMPK是二甲雙胍的主要分子靶點(diǎn)。因此本研究中探討二甲雙胍在LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷模型中,對(duì)AMPK磷酸化水平的影響。Western blot結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,LPS模型組小鼠肺組織內(nèi)P-AMPK的水平明顯下降,應(yīng)用二甲雙胍提前干預(yù)處理后,肺組織內(nèi)P-AMPK水平較前顯著增加(見(jiàn)圖5)。提示二甲雙胍可顯著增加肺組織內(nèi)p-AMPK水平。

與對(duì)照組比較,*P<0.01;與LPS模型組比較,#P<0.05圖4 Western blot檢測(cè)二甲雙胍對(duì)肺組織內(nèi)PGC1α表達(dá)的影響 (n=3)Figure 4 Effect of metformin on the expression of PGC1α in lung tissue by Western blot (n=3)

與對(duì)照組比較,*P<0.01;與LPS模型組比較,#P<0.01圖5 Western blot檢測(cè)二甲雙胍對(duì)肺組織內(nèi)AMPK磷酸化水平的影響 (n=3)Figure 5 Effect of metformin on phosphorylation of AMPK in lung tissue by Western blot (n=3)

3 討論

本研究提示二甲雙胍通過(guò)激活A(yù)MPK對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷發(fā)揮保護(hù)作用,同時(shí)研究顯示這種保護(hù)作用伴隨PGC1α表達(dá)的增加。這為研究激活A(yù)MPK對(duì)急性肺損傷的保護(hù)作用提供了新的可能機(jī)制,為急性肺損傷治療提供新的策略。

二甲雙胍是AMPK的有效激動(dòng)劑。目前主要用于2型糖尿病的治療,在臨床中應(yīng)用已有50余年,具有良好的安全性和性價(jià)比。臨床研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用二甲雙胍治療的糖尿病患者血清中,C反應(yīng)蛋白和炎癥因子的水平顯著下降[6,7],這提示二甲雙胍在降低血糖的同時(shí)也抑制了患者體內(nèi)異常的炎癥反應(yīng),提示AMPK激動(dòng)劑除具有降糖作用外,可能還具有抗炎的作用。研究發(fā)現(xiàn)配體激活A(yù)MPK在多種細(xì)胞類型中具有抗炎和免疫抑制作用,因此在多種疾病的治療中具有潛在價(jià)值[8-10]。研究發(fā)現(xiàn)AICAR和berberine通過(guò)激活A(yù)MPK信號(hào)通路對(duì)LPS誘導(dǎo)急性肺損傷小鼠發(fā)揮保護(hù)作用[11]。Tsaknis等[12]研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可通過(guò)降低肺泡微血管通透性從而對(duì)機(jī)械通氣誘導(dǎo)的小鼠肺損傷發(fā)揮保護(hù)作用。然而激活A(yù)MPK對(duì)上述疾病保護(hù)作用的具體機(jī)制尚待研究。本研究同樣提示二甲雙胍通過(guò)激活A(yù)MPK從而對(duì)LPS誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷發(fā)揮保護(hù)作用。這種保護(hù)作用表現(xiàn)在以中性粒細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞在肺組織內(nèi)浸潤(rùn)顯著減少,脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA含量明顯下降,這提示二甲雙胍通過(guò)激活A(yù)MPK從而對(duì)LPS誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷發(fā)揮保護(hù)作用。

本研究進(jìn)一步探索了激活A(yù)MPK對(duì)急性肺損傷發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制。過(guò)氧化物酶體增殖活化受體γ共激活因子-1α(peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator 1α,PGC1α)是生物體重要共激活轉(zhuǎn)錄因子,研究發(fā)現(xiàn)沉默PGC1α可導(dǎo)致抗氧化防御體系的酶(SOD1和SOD2等)表達(dá)下降,抗氧化應(yīng)激的能力減弱,而過(guò)表達(dá)PGC1α可上調(diào)上述抗氧化酶的表達(dá),增強(qiáng)抗氧化能力,對(duì)動(dòng)物模型發(fā)揮保護(hù)作用,提示PGC1α在抗氧化應(yīng)激方面發(fā)揮重要作用。對(duì)骨骼肌、弗里德的共濟(jì)失調(diào)(Friedreich’s ataxia)和糖尿病小鼠模型研究發(fā)現(xiàn),激活A(yù)MPK,可上調(diào)PGC1α的表達(dá),增強(qiáng)抗氧化能力,對(duì)上述動(dòng)物模型發(fā)揮保護(hù)作用[5,13-15],提示PGC1α可能是AMPK下游靶蛋白。Guan等[16]研究發(fā)現(xiàn),雷公藤紅素通過(guò)激活A(yù)MPK上調(diào)PGC1α表達(dá),減輕氧化應(yīng)激,從而對(duì)糖尿病大鼠骨骼肌起保護(hù)作用,上述研究均提示PGC1α可能成為疾病作用新的靶點(diǎn)。然而激活A(yù)MPK能否通過(guò)上調(diào)PGC1α表達(dá)從而對(duì)LPS誘導(dǎo)急性肺損傷小鼠發(fā)揮保護(hù)作用尚未可知。本研究顯示二甲雙胍通過(guò)激活A(yù)MPK對(duì)小鼠急性肺損傷發(fā)揮保護(hù)作用,這種保護(hù)作用伴隨PGC1α表達(dá)的上調(diào),提示激活A(yù)MPK對(duì)LPS誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷的保護(hù)作用可能與PGC1α上調(diào)有關(guān)。本研究為急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征提供新的治療思路。