袁玲玲 錢如貴 丁麗娜 李心鋒

摘要：目的 建立HPLC法測(cè)定保元湯顆粒中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量。方法 根據(jù)《中國(guó)藥典》規(guī)定的方法，并加以優(yōu)化，以Agilent Eclipse plus（5μm，4.6 mm × 250 mm）為色譜柱，以乙腈（A）-0.2%甲酸溶液（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫（0～20min，15%～40%A;20～25min，40%A），流速1.0 mL/min，柱溫25℃，檢測(cè)波長(zhǎng)260nm。結(jié)果 經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，毛蕊異黃酮葡萄糖苷在25.23～504.5ng（R2=0.9995）范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，該檢測(cè)方法專屬性較好，陰性無干擾，精密度RSD為0.26%，重復(fù)性RSD為3.98%，中間精密度RSD為3.12%，加樣回收率為93.63%（RSD為3.98%），溶液穩(wěn)定性在8h以內(nèi)可保持穩(wěn)定（RSD為1.47%），該方法耐用性較好。經(jīng)測(cè)定，甘草中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量為0.0045～0.0161%，保元湯顆粒（含有輔料，6 g/袋）中為87.98～97.46μg·g-1。結(jié)論 本研究所建立的方法簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，適用于保元湯顆粒中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的測(cè)定，為建立保元湯質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。此外，本研究首次對(duì)甘草中毛蕊異黃酮葡萄糖苷進(jìn)行了鑒別及含量測(cè)定，為甘草及其制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)深入研究奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：保元湯顆粒;毛蕊異黃酮葡萄糖苷;甘草;HPLC法

中圖分類號(hào)：R285.5?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A?? 文章編號(hào)：1007-2349（2019）08-0069-07

【Abstract】Objective： To establish a HPLC method for the determination of calycosin isoflavone glucoside in Baoyuantang granules. Methods： According to the method specified in the Chinese Pharmacopoeia， Agilent Eclipse plus （5μm， 4.6 mm×250 mm） was taken as chromatographic column and acetonitrile （A）-0.2% formic acid solution （B） as mobile phase， with gradient elution （0～20min， 15%～40%A; 20～25min， 40%A）， flow rate 1.0 mL/min， column temperature 25℃， and detection wavelength 260 nm. Results： The method showed that calycosin isoflavone glucoside had a good linear relationship in the range of 25.23 to 504.5ng （R2=0.9995）. The detection method had good specificity and no interference. The precision RSD was 0.26% and the reproducible RSD was 3.98%， and the intermediate precision RSD is 3.12%. The sample recovery rate was 93.63% （RSD is 3.98%）， and the solution stability could be kept stable within 8h （RSD is 1.47%）. The method had better durability. The content of calycosin isoflavone glucoside in the licorice was determined to be 0.0045-0.0161%， and that in the Baoyuantang granules （containing excipients， 6 g/bag） was 87.98～97.46μg·g-1. Conclusion： The method established in this study is simple， accurate and reliable and suitable for the determination of calycosin isoflavone glucoside in the Baoyuantang granules， and provides a basis for establishing the quality standard of Baoyuantang. In addition， the study was the first to identify and determine the content of calycosin isoflavone glucosides in licorice and lay a foundation for further research on the quality standards of licorice and its preparations.

【Key words】Baoyuantang granules， calycosin flavonoid glucoside， licorice， HPLC method

保元湯為治療元?dú)馓撊醯墓糯?jīng)典方劑，最早見于明代魏直的《博愛心鑒》，將其作為治療小兒痘瘡的基礎(chǔ)方，由人參、黃芪、肉桂、甘草四味藥物組成，全方可大補(bǔ)元?dú)猓妊a(bǔ)后天脾肺之氣，健脾保肺溫腎，能治一切元?dú)馓撊踔C，故名“保元”[1]。明代孫志宏所著《簡(jiǎn)明醫(yī)彀》中記載保元湯“由人參一錢，黃芪二錢，甘草五分，肉桂二分組成，右加生姜一片，水煎服。治元?dú)馓撊?，精神倦怠，肌肉柔慢，飲食少進(jìn)，面青白，睡臥寧靜，及有雜證，皆屬虛弱，宜服?！彼幚硌芯堪l(fā)現(xiàn)，該方具有調(diào)節(jié)免疫、促進(jìn)心血管功能、促進(jìn)造血、調(diào)節(jié)凝血及纖溶平衡、抗氧化、抗應(yīng)激等多種藥理作用，與其補(bǔ)氣溫陽的功能相吻合。臨床上廣泛用于氣虛、免疫失調(diào)引起的多種疾病[2，3]。

人參和黃芪作為該方的君臣藥，各活性成分均起到重要的藥理作用[4]，其中，毛蕊異黃酮葡萄糖苷是黃芪中具有代表性的黃酮類成分之一，具有抗病毒、抗菌、降脂、抗氧自由基、抗缺血、抗骨質(zhì)疏松、促血管新生等作用[5，6]，該成分可作為保元湯顆粒的質(zhì)量控制指標(biāo)。研究中發(fā)現(xiàn)，黃芪和甘草均含有毛蕊異黃酮苷葡萄糖苷，其中甘草中含量較低，通過本研究建立保元湯顆粒中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量測(cè)定方法，并對(duì)其進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證研究，為保元湯顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 試驗(yàn)材料 保元湯顆粒（昆明邦宇制藥有限公司，自制，6 g/袋）;毛蕊異黃酮葡萄糖苷（中國(guó)食品藥品檢定研究院，111920-201606）;甲醇（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，20181102）;三氯甲烷（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，20180223）;甲酸（天津風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司，20100722）;乙腈（Fisher Chemical，177798），硅膠GF254薄層板（青島海洋化工廠分廠，20130708）。

1.2 試驗(yàn)儀器 ME204電子分析天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）;BT125D電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）;Aglient 1260高效液相色譜儀（Agilent Technologies Inc.，G1311C 1260 Quat pump四元泵，G1329B自動(dòng)進(jìn)樣器，G1316A 1260TCC柱溫箱，G1314F 1260VWD紫外檢測(cè)器）;SK250LH7超聲波清洗儀（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）;HH-S26數(shù)顯雙列六孔恒溫水浴鍋（金壇市大地自動(dòng)化儀器廠）。

2 方法與結(jié)果

2.1 保元湯顆粒制備 根據(jù)《簡(jiǎn)明醫(yī)彀》記載和明代衡制單位，換算為現(xiàn)代質(zhì)量單位的處方見表1。

取以上五味藥材，人參、肉桂破碎為細(xì)塊或粗粉，生姜切成薄片，黃芪、甘草取飲片，加20倍純化水分3次提取，每次煮沸30 min，合并提取液，過濾，濃縮，干燥，提取得率為21.42～24.82%，加入適量輔料，制成顆粒。包裝規(guī)格：6 g/袋;用法用量：每天2次，每次1袋。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液制備 稱取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品約10 mg，精密稱定，置于10 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得濃度為1 mg·mL-1 的對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取儲(chǔ)備液5 mL，置于100 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，得50 μg·mL-1對(duì)照品溶液，置2～8℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 黃芪藥材供試品溶液制備 取黃芪藥材粉末1.0 g，置圓底燒瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，加熱回流4h，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾25 mL，回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状既芙?，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得[7]。

2.2.3 甘草藥材供試品溶液制備 稱取甘草藥材粉末5.0 g，置圓底燒瓶中，精密加入甲醇70 mL，稱定重量，加熱回流4h，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾35 mL，回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状既芙?，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.2.4 保元湯黃芪、甘草雙陰性供試品溶液制備 按處方量稱取人參、肉桂、生姜各適量，依照2.2.2 供試品溶液的處理方法處理。

2.2.5 保元湯顆粒供試品溶液 取保元湯顆粒1袋，研細(xì)，稱取約2.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加甲醇30 mL，超聲處理（功率180W，頻率53kHz）30 min，濾過，濾渣同法再處理一次，合并濾液，蒸至近干，殘?jiān)蛹状歼m量溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 色譜條件優(yōu)化 按2.2.5制備供試品溶液，參考文獻(xiàn)[8]及中國(guó)藥典黃芪藥材項(xiàng)下毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量測(cè)定方法進(jìn)行，出峰時(shí)間在5.9 min，附近峰比較密集，容易受溶劑干擾影響，后將流動(dòng)相比例加以調(diào)整，出峰時(shí)間延后至8.9 min，分離度和理論塔板數(shù)均得到改善，改善后的毛蕊異黃酮葡萄糖苷成分與其他成分分離度良好，分離度大于1.5，符合藥典要求。流動(dòng)相比例調(diào)整情況及結(jié)果詳見表2，調(diào)整前后HPLC圖譜見圖1。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，得到優(yōu)化的色譜條件，色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse plus C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相：乙腈（A）-0.2%甲酸水溶液（B），梯度洗脫，0～20 min，15%～40%A;20～25min，40%A，流速：1.0 mL·min-1，柱溫：25℃，檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm，進(jìn)樣量：10μL。保留時(shí)間為20min，理論塔板數(shù)以毛蕊異黃酮葡萄糖苷計(jì)不低于3000。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 專屬性考察

2.4.1.1 HPLC檢測(cè) 分別吸取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品溶液、黃芪藥材供試品溶液、甘草藥材供試品溶液、保元湯黃芪甘草雙陰性供試品溶液、保元湯顆粒供試品溶液10 μL，依2.3方法檢測(cè)。結(jié)果表明，保元湯顆粒、黃芪、甘草tR8.9 min均有吸收峰，通過改變流動(dòng)相比例和流速，該峰依然重合，而保元湯黃芪、甘草雙陰性供試品溶液無干擾，說明黃芪、甘草中均含有毛蕊異黃酮葡萄糖苷，保元湯顆粒中含有的毛蕊異黃酮葡萄糖苷來源于黃芪和甘草，以毛蕊異黃酮葡萄糖苷作為保元湯顆粒質(zhì)量控制成分具有較好專屬性。專屬性實(shí)驗(yàn)HPLC圖譜見圖2。

2.4.1.2 TLC鑒別 吸取各供試品溶液及毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品溶液（濃度為0.3 mg·mL-1）各10 μL，分別點(diǎn)樣于同一硅膠GF254 薄層板上，用三氯甲烷-甲醇-水（13∶ 7∶ 2）的下層溶液為展開劑，展開后，晾干，置紫外光燈254 nm下觀察[9]。保元湯顆粒、黃芪、甘草供試品溶液與對(duì)照品溶液在相應(yīng)位置上顯示相同顏色的斑點(diǎn)，但保元湯黃芪、甘草雙陰性供試品溶液無相應(yīng)斑點(diǎn)，與HPLC檢測(cè)結(jié)果一致，由此確定，同為豆科植物的黃芪和甘草兩種藥材均含有毛蕊異黃酮葡萄糖苷。TLC圖譜見圖3。

2.4.2 線性及范圍考察 分別精密吸取混合對(duì)照品溶液適量，依次稀釋成2.5、5.0、10、20、30、40、50 μg·mL-1的對(duì)照品溶液，分別精密吸取10μL注入液相色譜儀，按2.3色譜條件進(jìn)行分析，測(cè)定峰面積，以峰面積積分值作為縱坐標(biāo)（Y），毛蕊異黃酮葡萄糖苷進(jìn)樣量作為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程Y=2496.2X+12.915，R2=0.9995，表明毛蕊異黃酮葡萄糖苷在25.23～504.5 ng范圍內(nèi)，進(jìn)樣量（ng）與峰面積（mAU）呈良好線性關(guān)系。線性關(guān)系數(shù)據(jù)見表3，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖4。

2.4.3 精密度考察 精密吸取40 μg·mL-1的對(duì)照品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。經(jīng)計(jì)算，毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰面積的RSD為0.26%，符合RSD≤2.0%的要求，表明該方法精密度良好。相關(guān)數(shù)據(jù)見表4。

2.4.4 重復(fù)性考察 取保元湯顆粒，按2.2.5項(xiàng)下平行制備6份供試品溶液，依法測(cè)定，結(jié)果6份供試品溶液含量依次為：93.861、95.871、93.213、93.865、93.787、85.363 μg·g-1，平均含量為92.660 μg·g-1，RSD為3.98%，符合待測(cè)成分含量為0.01%時(shí)重復(fù)性RSD≤4.0%的要求，表明方法重復(fù)性良好。相關(guān)數(shù)據(jù)見表5。

2.4.5 中間精密度考察 不同人在不同時(shí)間進(jìn)行操作，取保元湯顆粒，按2.2.5項(xiàng)下平行制備6份供試品溶液，依法測(cè)定，結(jié)果6份供試品溶液含量依次為：89.829、89.499、93.170、92.749、91.761、95.022 μg·g-1，平均含量為92.005 μg·g-1，RSD為2.28%，與2.4.4中測(cè)定結(jié)果92.660 μg·g-1比較，平均含量為92.33 μg·g-1，RSD為3.12%，符合RSD≤4.0%的要求，表明方法中間精密度較好。相關(guān)數(shù)據(jù)見表5。

2.4.6 準(zhǔn)確度（加樣回收）考察 稱取保元湯顆粒粉末9份，每份約1.0 g，精密稱定，分成3組，分別按已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)的50%、100%、150% 3個(gè)水平加入毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品溶液（50.45 μg·mL-1）1、2、3 mL，按“2.2.5”項(xiàng)下方法制備，依法測(cè)定，計(jì)算回收率。毛蕊異黃酮葡萄糖苷的平均回收率為93.63%，符合待測(cè)成分含量為0.01%時(shí)回收率范圍達(dá)到85～110%的要求，回收率的RSD為3.98%，符合RSD≤4.0%的要求。保元湯顆粒中的原有量按2.4.5中計(jì)算的結(jié)果92.3μg·g-1計(jì)算而得，相關(guān)數(shù)據(jù)見表6。

2.4.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 吸取同一供試品溶液（室溫放置）各10μL，分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，比較峰面積變化，結(jié)果表明，毛蕊異黃酮葡萄糖苷供試品溶液在8h以內(nèi)均能保持穩(wěn)定，各時(shí)間點(diǎn)峰面積比較，RSD為1.47%，在24 h內(nèi)溶液穩(wěn)定性稍差，各時(shí)間點(diǎn)峰面積比較，RSD為2.06%。相關(guān)數(shù)據(jù)見表7。

2.4.8 耐用性試驗(yàn) 在各色譜條件下，稱取同一批次保元湯顆粒（批號(hào)20181220），按2.2.5項(xiàng)下制備供試品溶液，依改變色譜條件相關(guān)參數(shù)及色譜柱，詳細(xì)參數(shù)變化及結(jié)果見表8，改變各條件測(cè)定結(jié)果與原條件比較，理論塔板數(shù)與分離度均能達(dá)到要求，與原條件比較相對(duì)平均偏差依次為1.84%、0.34%、0.63%、1.59%，均達(dá)到RAD≤2.0%的要求，另外各條件下結(jié)果比較RSD為1.60%，說明該方法耐用性較好。

2.5 毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量測(cè)定

2.5.1 甘草中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量測(cè)定 由2.4.1中專屬性考察結(jié)果可知，甘草與黃芪均含有毛蕊異黃酮葡萄糖苷。取市售4個(gè)不同生產(chǎn)商/供應(yīng)商的甘草（飲片），測(cè)定其含量。稱取各批次甘草粉末5.0 g，按2.2.3方法處理樣品，結(jié)果見表9。各甘草藥材中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量差異大，其中1#為制備保元湯顆粒所用批次甘草，含量為0.0080%，四個(gè)樣品中內(nèi)蒙古所產(chǎn)的甘草含量最高，達(dá)到0.0161%。

2.5.2 黃芪含量測(cè)定 取制備保元湯顆粒所用批次的黃芪藥材，按2.2.2制備供試品溶液，依法檢測(cè)，計(jì)算含量為0.0687%。

2.5.2 保元湯顆粒含量測(cè)定 稱取保元湯顆粒，按2.2.5項(xiàng)下制備供試品溶液，依法測(cè)定，按外標(biāo)法計(jì)算樣品中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量，結(jié)果見表10。三個(gè)批次保元湯顆粒含量在87.98～97.46 μg·g-1范圍內(nèi)。

3 結(jié)論與討論

中醫(yī)的“虛癥”，指人體正氣不足，臟腑功能減弱或衰退所表現(xiàn)的證候，包括免疫力低下、易生病、久病不愈等，中醫(yī)以扶正固本作為治病的基本法則。而正氣的盛衰是一個(gè)動(dòng)態(tài)的傳變過程，不僅與各臟腑及氣、血、精、液的狀態(tài)密切相關(guān)，也與環(huán)境的變化有著緊密的聯(lián)系[10]。保元湯顆粒用于治療元?dú)馓撊酢⒕窬氲?、肌肉柔慢等虛癥，通過調(diào)節(jié)五臟六腑氣血的陰陽平衡來改善患者的免疫功能，提高患者的免疫力水平[11，12]。作為保元湯方中的臣藥，黃芪用以補(bǔ)氣，藥用歷史悠久，黃芪的化學(xué)成分主要有黃酮類、皂苷類等成分，其中毛蕊異黃酮葡萄糖苷是黃芪中主要成分之一，也是藥典中收錄黃芪的質(zhì)量控制指標(biāo)之一，不僅具有抗氧化活性、抗炎、免疫抑制的作用，還可以抑制病毒復(fù)制，改善心臟功能，調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫、體液免疫功能[13，14，15]。這些藥理作用都與改善機(jī)體臟腑功能、改善虛證有關(guān)，該質(zhì)量控制指標(biāo)的建立具有實(shí)際意義。

氣血津液互根互用，共同發(fā)揮保護(hù)機(jī)體驅(qū)邪抗病的作用。若脾胃健運(yùn)，氣血津液充盈，正氣充足，免疫功能多正常，則不易被病原微生物等邪氣侵襲;若脾虛氣血津液虧虛，正氣不足，免疫功能多缺陷或低下，則難以抵抗邪氣侵襲而患病[16]。

作為方中的使藥，甘草含有多種活性成分，其中，甘草酸、甘草苷為藥典中規(guī)定的甘草質(zhì)量控制指標(biāo)，已有大量文獻(xiàn)報(bào)道了甘草中甘草酸、甘草苷的含量測(cè)定方法，但是，沒有關(guān)于甘草中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量測(cè)定的文獻(xiàn)報(bào)道。本研究首次對(duì)甘草中毛蕊異黃酮葡萄糖苷進(jìn)行了鑒別及含量測(cè)定，這也為甘草藥材及含甘草中藥復(fù)方制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定提供了參考依據(jù)。甘草、黃芪同為豆科植物，均含有毛蕊異黃酮葡萄糖苷，其它豆科類植物藥材中是否含有該成分，有待深入研究。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，毛蕊異黃酮葡萄糖苷在藥材黃芪中含量為0.0687%、甘草為0.0080%，3批保元湯顆粒含量為87.98～97.46 μg·g-1。保元湯顆粒（含有輔料）每袋6 g，每袋相當(dāng)于含有黃芪3 g，甘草0.75 g，若毛蕊異黃酮葡萄糖苷成分轉(zhuǎn)移率為100%，保元湯顆粒應(yīng)含毛蕊異黃酮葡萄糖苷353.5 μg·g-1，但實(shí)際轉(zhuǎn)移率僅為24.89～27.57%。本次實(shí)驗(yàn)中，按照古籍文獻(xiàn)記載的傳統(tǒng)水煎煮方法制備保元湯顆粒，由于毛蕊異黃酮葡萄糖苷易受熱脫去葡萄糖轉(zhuǎn)變?yōu)槊锂慄S酮[17，18]，成分轉(zhuǎn)移率會(huì)受到較大影響，但作為具有生物活性且專屬于黃芪和甘草的成分之一，仍然可作為含量控制指標(biāo)。經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，本研究建立保元湯中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量測(cè)定方法，專屬性較好，陰性無干擾，分離度能達(dá)到要求，重復(fù)性、中間精密度、耐用性等均符合要求，方法簡(jiǎn)便，可操作性強(qiáng)，可用于保元湯顆粒的質(zhì)量控制。

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（收稿日期：2019-04-16）