王舉波， 權(quán)瑜， 呂健， 董丹鳳

(1．西安交通大學第二附屬醫(yī)院 神經(jīng)外科， 陜西 西安 710004； 2．西安交通大學第一附屬醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科， 陜西 西安 710061)

腦膠質(zhì)瘤是發(fā)病率最高、且最具危險性的顱內(nèi)原發(fā)惡性腫瘤，盡管近年來外科技術(shù)及各種綜合治療方法不斷更新，但仍然難以改變其高居不下的致死率及致殘率[1-4]。腫瘤細胞增殖同時存在細胞死亡[5]，主要包括壞死與凋亡，后者是細胞自身增殖調(diào)控的重要方式，是由幾條經(jīng)典凋亡通路控制的程序性死亡[6]，與腫瘤的進展關(guān)系密切[7-8]，研究膠質(zhì)瘤細胞的凋亡與增殖特性具有重要的臨床價值[9]。檸檬酸脫氫酶1(isocitrate dehydrogenase1，IDH1)在膠質(zhì)瘤中有著廣泛的突變率，且突變型患者具有相對較好的預后[10-11]，但目前國內(nèi)外對突變型膠質(zhì)瘤患者良好預后的機制鮮有報道，本研通過研究異檸檬酸脫氫酶1(mutant isocitrate dehydrogenase1，mIDH1)基因過表達對替莫唑胺(temozolomide，TMZ)干預下人腦惡性膠質(zhì)瘤細胞系U87凋亡的影響，探討mIDH1影響膠質(zhì)瘤患者預后的原因，為臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

U87人腦惡性膠質(zhì)瘤細胞系由西安交通大學醫(yī)學院中心實驗室提供，Caspase-3及Caspase-9兔抗人單克隆抗體購買于Santa Cruze公司，胎牛血清購自四季青公司，脂質(zhì)體Lip2000系購自Sigma公司，Western blot試劑盒購自上海銳賽公司；研究所用的相關(guān)基本試劑及試驗耗材均購自西安交通大學實驗耗材供應中心，基本操作儀器由西安交通大學環(huán)境重點實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng) U87細胞用含有雙抗(青霉素、鏈霉素各100 000 IU/L)、10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37 ℃培養(yǎng)箱、5% CO2條件下培養(yǎng)，定時換液、傳代。

1.2.2真核表達載體構(gòu)建與目的基因細胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 采用Primer5 軟件設計IDH1 PCR擴增引物，模板為Pcmv-IDH1、參考文獻進行擴增，PCR產(chǎn)物大小為225～1 466 bp ；采用限制性內(nèi)切酶BamH I和Sac1進行雙酶切，回收酶切片段，T4 DNA 連接酶對載體與雙酶切產(chǎn)物進行重組，構(gòu)建(wild isocitrate dehydrogenase1，wIDH1)真核表達載體，利用點突變試劑盒突變技術(shù)構(gòu)建mIDH1真核表達載體。U87細胞接種培養(yǎng)融合率達60%～70%時，以脂質(zhì)體Lip2000轉(zhuǎn)染細胞，G418篩選，直至穩(wěn)定的單細胞克隆株出現(xiàn)，對單細胞克隆株傳代培養(yǎng)，凍存留種。

1.2.3mIDH1對體外U87細胞凋亡的影響 采用流式細胞術(shù)，轉(zhuǎn)染成功的U87細胞傳代培養(yǎng)24、48 h，適量0.25%的胰酶消化液消化細胞，收集細胞，室溫，800 r/min離心5 min；再次重懸細胞并計數(shù)，室溫，800 r/min離心5 min；棄去上清液，加入binding buffer 400 μL重懸細胞；加入Annexin V-RFP 5 μL，室溫避光孵育15 min；30 min內(nèi)檢測(激發(fā)光波長545 nm，發(fā)射波長>575 nm)。

1.2.4TMZ對mIDH1過表達膠質(zhì)瘤細胞凋亡的影響 采用流式細胞術(shù)，轉(zhuǎn)染成功的U87細胞傳代培養(yǎng)，加入0.25%胰酶消化、計數(shù)細胞，種入6孔培養(yǎng)板；按照0、50及100 mg/L的TMZ濃度計算需要補加入的培養(yǎng)基和TMZ溶液量，將二者混合后緩慢加入培養(yǎng)孔中，設置3個復孔，培養(yǎng)24 h；胰酶消化，收集細胞，加入binding buffer 400 μL，重懸細胞；加入Annexin V-RFP 5 μL，避光孵育15 min，30 min內(nèi)檢測(激發(fā)光波長采用545 nm，發(fā)射波長>575 nm)。

1.2.5TMZ對mIDH1過表達細胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響 采用Western blot法，轉(zhuǎn)染成功的U87細胞細胞胰酶消化，離心收集，用50 mg/L的TMZ培養(yǎng)液重懸細胞并傳代；培養(yǎng)24 h時，置于冰上，RIPA裂解液裂解15～30 min。收集細胞，超聲粉碎，4 ℃ 12 000 r/min離心15 min；吸取上清液，蛋白定量分裝保存。SDS蛋白質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠電泳及轉(zhuǎn)膜，取待測蛋白樣品40 μg上樣，進行半干式法轉(zhuǎn)膜，TBST漂洗PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h；加入封閉液稀釋配制的一抗，4 ℃孵育過夜；分別加入以牛奶封閉的HRP標記的二抗(1 ∶5 000)，室溫孵育2 h；TBST溶液洗膜、顯色，顯影定影；凝膠成像系統(tǒng)掃描記錄目的蛋白的表達強弱，用光密度表示，目的蛋白與β-actin比值來表示相對表達水平，全自動凝膠成像系統(tǒng)對結(jié)果拍照并分析。

1.2.6TMZ對裸鼠移植瘤凋亡相關(guān)蛋白表達的影響 采用免疫組織化學法，皮下注射法構(gòu)建裸鼠移植瘤模型，計算裸鼠體表面積(S)，S= 體型系數(shù)(0.06)×2/3體質(zhì)量，根據(jù)裸鼠的體表面積及TMZ用藥參考確定TMZ給藥劑量，將TMZ用DMEM配成混懸液，按裸鼠體表面積每日灌胃給藥，連續(xù)5 d，實驗終末處死裸鼠，留取移植瘤標本，石蠟包埋，做5 μm石蠟組織切片、烘干、二甲苯及梯度酒精脫蠟， 3% H2O2浸泡，加入檸檬酸緩沖液暴露抗原結(jié)合位點，加一抗(利用PBS代替一抗作空白對照)，4 ℃過夜，加入二抗，37 ℃孵育30 min，滴上適量的SABC，37 ℃孵育30 min，滴加顯色劑，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察瘤細胞內(nèi)見棕黃色或者棕褐色顆粒為陽性細胞。按陽性細胞面積計分：不表達記0分、<10%記1分、10%～50%記2分、51%～80%記3分、>80%記4分，按著色強度計分：不表達記0分、弱表達記1分、中度表達記2分、強表達記3分；兩者積分乘積為0表示陰性、>1為陽性、1～3表示弱陽性、4～7表示陽性、8～12為強陽性。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 mIDH1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染U87細胞系構(gòu)建

如圖1所示，mIDH1基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染U87細胞后，經(jīng)G418單克隆篩選，最終篩選出穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞單克隆株，因目的基因與熒光報告基因有共同的啟動子，故而目的基因得到穩(wěn)定表達，熒光顯微鏡下可見穩(wěn)定表達的EGFP熒光報告基因。

圖1 U87穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)EGFP表達(40×)Fig.1 Expression of EGFP in U87 stable cell line

2.2 U87細胞凋亡率

如圖2，將mIDH1、wIDH1及對照組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染U78細胞常規(guī)培養(yǎng)進行細胞凋亡檢測，結(jié)果顯示，與對照組比較，mIDH1組細胞凋亡率無顯著改變，經(jīng)培養(yǎng)24 及48 h時3組細胞的細胞凋亡率均接近于1%，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；因未檢測到mIDH1/wIDH1對體外培養(yǎng)細胞的凋亡有明顯影響，故未再對體內(nèi)凋亡蛋白進行檢測。

圖2 3組U87細胞培養(yǎng)24 h及48 h的細胞凋亡率Fig.2 Apoptotic rate of the three cell line cultured for 24 hand 48 h

2.3 TMZ干預后U87細胞凋亡率

流式細胞檢測結(jié)果顯示， TMZ干預濃度為50 mg/L時，mIDH1過表達組U87細胞即表現(xiàn)出較高的凋亡率，且隨TMZ濃度的升高，細胞凋亡比例升高，與其它兩組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，wIDH1組細胞凋亡率顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 不同濃度TMZ 作用下三組細胞的凋亡率(%)Tab.1 The effect of different concentrations of TMZ on cellular apoptosis

注：(1)與對照組比較，P<0.05;(2)與 mIDH1組比較，P<0.05

2.4 TMZ干預后U87細胞Bcl-2、Bax、Caspase-3及Caspase-9蛋白表達

轉(zhuǎn)染mIDH1、wIDH1及空載體的膠質(zhì)瘤U87細胞經(jīng)TMZ干預后，Western blot結(jié)果顯示，與對照組比較，mIDH1組腦膠質(zhì)瘤U87細胞的Bcl-2蛋白表達水平降低， Bax、Caspase-3及Caspase-9蛋白表達水平升高，wIDH1組腦膠質(zhì)瘤U87細胞Bax、Caspase-3及Caspase-9蛋白表達水平降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，Bcl-2則差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖3、表2。

圖3 TMZ干預后U87細胞凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3及Caspase-9表達(Western blot)Fig.3 The effect of TMZ on the expression levels of apoptosis-associated proteins

組別細胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2BaxCaspase-3Caspase-9對照組0.89±0.190.43±0.170.55±0.160.52±0.14mIDH1組0.33±0.14(1)0.88±0.21(1)0.83±0.24(1)0.69±0.14(1)wIDH1組0.92±0.21 (2)0.27±0.14(1) (2)0.26±0.15(1) (2)0.25±0.16(1) (2)

注：(1)與對照組比較，P<0.05；(2)與 mIDH1組比較，P<0.05。

2.5 TMZ干預后裸鼠移植瘤Bcl-2、Bax、Caspase-3及Caspase-9蛋白表達

免疫組織化學結(jié)果顯示， mIDH1組移植瘤中Bcl-2蛋白表達水平顯著低于對照組和wIDH1組，Caspase-9蛋白表達水平顯著高于對照組和wIDH1組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；wIDH1組Bax、Caspase-3蛋白表達水平顯著低于對照組和mIDH1組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖4、表3。

圖4 TMZ干預后移植瘤Bcl-2、Bax及Caspase-3表達(免疫組織化學法，×400)Fig.4 The effect of mutIDH1 expression on TMZ-mediated apoptosis-associated protein expression

組別細胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2BaxCaspase-3Caspase-9對照組10.2±1.38.9±1.210.3±1.410.2±1.3mIDH1組3.5±0.6(1)9.8±1.210.7±1.63.5±0.6(1)wIDH1組10.5±1.4(2)2.8±0.4(1)(2)2.1±0.4(1)(2)10.5±1.4(2)

注：(1)與對照組比較，P<0.05;(2)與 mIDH1組比較，P<0.05。

3 討論

腫瘤的形成是細胞增殖過度與細胞凋亡減少的累積效應[12]，抗凋亡作用不僅在腫瘤的形成中起重要作用，而且與腫瘤的放化療敏感性有著密切的關(guān)系[13]。細胞的凋亡調(diào)控是在凋亡與抗凋亡因素的共同作用下完成的，是一個多因素參與的復雜過程，調(diào)控基因分為凋亡基因和抗凋亡基因，前者如野生型p53、Bax、FAS/Apo-1、Bcl-xs等，后者如Bcl-2、Bcl-xl等。新生腫瘤的產(chǎn)生，往往伴隨抗凋亡基因表達上調(diào)及凋亡基因表達的下調(diào)。Bcl-2是目前研究最深入的凋亡調(diào)控基因，屬于抗凋亡基因[14]，其功能蛋白定位于線粒體外膜、核膜和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，具有膜通透活性適配子雙重功能[15]。

研究報道，上調(diào)抗凋亡因子的表達，可在一定程度上抑制過氧化物和自由基增加所誘導的細胞凋亡[16]。目前認為，Bcl-2/Bax比值決定細胞是否凋亡。在最近一項關(guān)于侵襲性垂體瘤的研究中發(fā)現(xiàn)Bcl-2下調(diào)與細胞凋亡增加有關(guān)，且Bcl-2、Bax的表達水平與Caspase-3、Caspase-9 的表達水平有關(guān)，在膠質(zhì)瘤細胞系的相關(guān)研究中也有類似發(fā)現(xiàn)[17]。Caspase家族成員的激活是細胞凋亡過程中的重要事件[18]。Caspase-3是其中的一個關(guān)鍵酶，對許多蛋白的降解都起到了重要的參與作用，Caspase-9主要發(fā)生于凋亡起始期，由藥物化療激活，進而激活下游Caspase-3，導致凋亡。Bcl-2與Bax基因是凋亡調(diào)控的兩個重要基因，Bcl-2的激活抑制細胞色素C的釋放，從而抑制Caspase激活而抑制凋亡[19]。在細胞外凋亡途徑中，死亡配體與受體，激活死亡信號，活化Caspase-8，細胞色素C釋放或者通過直接作用于Caspase-3及其它下游Caspase活化凋亡途徑。在細胞內(nèi)途徑中，細胞內(nèi)的一切異常改變都可作為死亡通知信號，誘發(fā)細胞死亡，這些改變可導致線粒體釋放細胞色素C與Caspase-9結(jié)合形成凋亡復合體而進一步被激活，其下游的Caspase-3等被激活而導致細胞凋亡。TMZ在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為活性產(chǎn)物，導致DNA甲基化加成物的錯配修復，發(fā)揮細胞毒作用，啟動內(nèi)源性凋亡途徑[20]。

本研究發(fā)現(xiàn)，TMZ作用于體外膠質(zhì)瘤細胞后，mIDH1組U87細胞Bcl-2表達下調(diào)，Bax、Caspase-3、Caspase-9表達均有不同程度的上調(diào)，其凋亡率較wIDH1組及對照組高，mIDH1通過改變凋亡相關(guān)蛋白的表達水平對TMZ的抗腫瘤效應起到了協(xié)同疊加作用，從而提高了化療敏感性，這與調(diào)控Bcl-2水平增強化療敏感性的文獻報道相符[14]。而wIDH1組U87細胞Bcl-2表達有所上調(diào)，Bax、Caspase-3、Caspase-9表達均有不同程度的下調(diào)，與mIDH1組表現(xiàn)相反，在一定程度上表現(xiàn)出化療抵抗性。同樣，TMZ干預移植瘤模型后，mIDH1組移植瘤樣本中Bcl-2的表達下調(diào)，Bax表達上調(diào)，Caspase-3及Caspase-9表達上調(diào)，在干預中表現(xiàn)出協(xié)同作用。wIDH1組則表現(xiàn)出一定的拮抗作用，究其原因可能是wIDH1通過正常的三羧酸循環(huán)維持良好的能量代謝水平及還原底物，避免細胞氧化損傷導致的凋亡[20]。而mIDH1通過異常代謝途徑，不能為提供正常的細胞供能及抗氧化還原底物，以對抗過度的氧化應激，細胞微環(huán)境的改變導致內(nèi)源途徑激活，加之能量代謝不足，經(jīng)典的MAPK和Akt途徑中的Bad磷酸化不足，使Bad去磷酸化而活化，活化下游的Bax基因，促使細胞色素C的釋放，最終誘發(fā)細胞凋亡。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)mIDH1通過上調(diào)TMZ作用后U87細胞及裸鼠移植瘤組織的Caspase-3、Caspase-9、Bax表達、下調(diào)Bcl-2表達促進膠質(zhì)瘤細胞凋亡，增強治療敏感性，協(xié)同TMZ抗腫瘤，增加化療敏感性，改善膠質(zhì)瘤患者預后。