張瑩， 金愛(ài)， 王旭東

(貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 生理學(xué)教研室， 貴州 貴陽(yáng) 550004)

三陰乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC)在各種乳腺癌亞型中具有較大的浸潤(rùn)性，經(jīng)常發(fā)生局部復(fù)發(fā)和器官轉(zhuǎn)移，是全世界女性最常見(jiàn)的惡性疾病之一[1]。17β-雌二醇素(17β-Estradiolum，E2)主要由卵巢分泌產(chǎn)生，是促進(jìn)女性第二性征發(fā)育和性器官成熟的重要激素，能夠促進(jìn)TNBC細(xì)胞的活性、增殖及轉(zhuǎn)移[2-3]。鈣激活中性蛋白酶(calcium-activated neutral protease，CANP或Calpain)是Ca2+依賴(lài)性的半胱氨酸蛋白酶水解家族，被某些特異性蛋白水解后可調(diào)節(jié)多種酶和蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能，并且在細(xì)胞增殖、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面發(fā)揮著重要作用[4-6]。目前已有研究顯示，E2可通過(guò)CANP介導(dǎo)多種癌細(xì)胞的周期蛋白水解、增殖及遷移，也可通過(guò)絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號(hào)通路介導(dǎo)CANP2影響TNBC的遷移及黏附[7]。Hippo信號(hào)通路首先在果蠅中發(fā)現(xiàn)，是由G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled estrogen receptor，GPER)和磷脂酰肌醇激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)調(diào)節(jié)[8]；Yes相關(guān)蛋白(yes-associated protein,YAP)是Hippo信號(hào)傳導(dǎo)途徑的主要下游因子，參與器官生長(zhǎng)、組織修復(fù)，在多種惡性腫瘤中被廣泛激活，YAP過(guò)表達(dá)可以刺激腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移，因此Hippo-YAP信號(hào)通路已被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的重要因素[9-10]。另有研究顯示，干擾YAP基因的表達(dá)能有效抑制乳腺細(xì)胞的增殖并促進(jìn)凋亡[11]，但CANP與YAP的相關(guān)性研究尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究通過(guò)細(xì)胞分子生物學(xué)手段，探討E2對(duì)TNBC細(xì)胞增殖和凋亡的生物學(xué)行為及CANP-YAP信號(hào)通路的介導(dǎo)作用，力圖為探尋TNBC的臨床有效治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

1.1.1材料 人源乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231及MDA-MB-468分別購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院昆明細(xì)胞庫(kù)及中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2試劑 E2、鈣蛋白酶抑制劑(calpeptin，Cal)、鈣蛋白酶抑制劑Ⅲ(calpain Inhibitor Ⅲ，CI Ⅲ)、噻唑藍(lán)(methylthiazolydiphenyl-tetrazolium bromide ，MTT)和二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，YAP抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司，蛋白內(nèi)參(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體購(gòu)自中國(guó)巴傲德生物科技有限公司，羊抗小鼠IgG-HRP和羊抗兔IgG-HRP購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，全細(xì)胞裂解液(radio-immunoprecipitation asay，RIPA)、蛋白酶抑制劑(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)及BCA蛋白定量試劑盒(bicinchoninic acid，BCA)購(gòu)自中國(guó)碧云天生物技術(shù)有限公司，廣譜磷酸酶抑制劑混合物和廣譜蛋白酶抑制劑混合物購(gòu)自中國(guó)博士德生物公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) MDA-MB-231及MDA-MB-468細(xì)胞均采用含有10%血清和1%青霉素-鏈霉素的L-15培養(yǎng)基，在25 cm2不透氣培養(yǎng)瓶于5% CO2的37 ℃恒溫?zé)o菌細(xì)胞培養(yǎng)箱中隔絕培養(yǎng)48 h。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分為4組，DMSO組加1‰ DMSO處理細(xì)胞，E2組用10 nmol/L E2處理細(xì)胞，E2聯(lián)合Cal組在用10 μmol/L Cal預(yù)處理細(xì)胞2 h后、再加入10 nmol/L E2處理細(xì)胞，E2聯(lián)合CI Ⅲ組在用10 μmol/L CI Ⅲ預(yù)處理細(xì)胞2 h后、再加入10 nmol/L E2處理細(xì)胞。

1.2.3MTT實(shí)驗(yàn) 取所有細(xì)胞以每孔8 000個(gè)細(xì)胞密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待48 h后，每孔加入MTT溶液20 μL，放回細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育3 h，棄上清，每孔再加DMSO 150 μL，室溫下適當(dāng)搖晃孵育20 min至甲臜完全溶解，采用酶標(biāo)儀測(cè)定每個(gè)孔490 nm處的吸光度值。所有過(guò)程均避光操作。

1.2.4細(xì)胞平板克隆形成試驗(yàn) 收集生長(zhǎng)狀態(tài)良好的兩種細(xì)胞，按每孔200個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中。按照實(shí)驗(yàn)分組1.2.2加藥處理，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3周，培養(yǎng)板中有明顯細(xì)胞集落時(shí)停止培養(yǎng)；4%多聚甲醛固定20 min，0.1%結(jié)晶紫水染色10 min，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)洗去非細(xì)胞染色，自然晾干后10倍物鏡下拍照計(jì)數(shù)，并計(jì)算克隆形成率[克隆形成率(%)=克隆數(shù)/200×100% ]。

1.2.5細(xì)胞凋亡試驗(yàn) 用無(wú)乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)的0.25%胰酶消化收集1.2.2項(xiàng)下加藥處理的細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌3次，按照凱基Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒說(shuō)明操作，加入重懸分散細(xì)胞500 μL，加入Annexin V-FITC 5 μL充分混勻低溫靜置5 min，再加入碘化丙啶5 μL 震蕩混勻、避光孵育5～15 min，1 h內(nèi)在倒置熒光顯微鏡下隨機(jī)取4個(gè)視野拍照記錄，并用Image J軟件檢測(cè)熒光強(qiáng)度。

1.2.6蛋白印跡(Western blot)檢測(cè) 所有細(xì)胞培養(yǎng)到細(xì)胞生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期時(shí)，加入新鮮配置的全細(xì)胞裂解液(RIPA ∶PMSF ∶磷酸酶抑制劑 ∶多種蛋白酶抑制劑=100 ∶1 ∶1 ∶1)充分裂解細(xì)胞，置于冰上水平振搖20 min；用刮刀收取總蛋白后采用BCA法測(cè)定蛋白濃度，以30 μg蛋白上樣，10%聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)至溴酚藍(lán)條帶到玻板下緣1 cm處，在300 mA恒定電流下將分離蛋白轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜，5%伊利脫脂奶粉室溫封閉2 h，按實(shí)驗(yàn)要求稀釋抗體大腫瘤抑制基因(large tumor suppressor gene 1，LATS1)(1 ∶5 000)、YAP(1 ∶1 000)、GAPDH(1 ∶10 000)，4 ℃搖晃孵育過(guò)夜；磷酸鹽緩沖液(tris-buffered saline tween，TBST)每10 min洗膜3次，加入相應(yīng)二抗(1 ∶4 000)室溫振搖孵育2 h，TBST洗膜3次，10 mi n/次；將化學(xué)發(fā)光試劑均勻滴加到PVDF膜上，Syngene Imaging系統(tǒng)進(jìn)行成像，條帶灰度處理分析目的蛋白表達(dá)量[目的蛋白表達(dá)量=目的條帶的光密度(optical density，OD)/內(nèi)參OD×100%]，實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 E2對(duì)MDA-MB-231及468細(xì)胞增殖和凋亡的影響

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，E2組MDA-MB-231及468細(xì)胞的增殖率均顯著高于DMSO組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,或P<0.01)，見(jiàn)圖1A；細(xì)胞平板克隆形成試驗(yàn)結(jié)果顯示，E2組MDA-MB-231及468細(xì)胞的菌落形成率均顯著高于DMSO組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖1B、1C；細(xì)胞凋亡試驗(yàn)結(jié)果顯示，E2組MDA-MB-231及468細(xì)胞熒光凋亡強(qiáng)度顯著低于DMSO組(P<0.05)，見(jiàn)圖1D。

注：A為MTT實(shí)驗(yàn)，B為平板克隆實(shí)驗(yàn)，C為平板克隆實(shí)驗(yàn)的直條圖，D為熒光凋亡實(shí)驗(yàn)； 與DMSO組比較，(1)P<0.01，(2)P<0.05。圖1 E2對(duì)MDA-MB-231及468細(xì)胞增殖率和凋亡的影響Fig.1 Effect of E2 on proliferation and apoptosis of MDA-MB-23 and 468 cells

2.2 E2對(duì)MDA-MB-231及468細(xì)胞的YAP蛋白表達(dá)的影響

蛋白印跡檢測(cè)結(jié)果顯示，E2組MDA-MB-231、468細(xì)胞中YAP蛋白表達(dá)顯著高于DMSO組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖2。提示E2能上調(diào)MDA-MB-231和468細(xì)胞YAP表達(dá)。

注：(1)與DMSO組比較，P<0.05。 圖2 E2對(duì)MDA-MB-231及468細(xì)胞的YAP蛋白表達(dá)影響Fig.2 Effects of E2 on YAP protein expression in MDA-MB-231 and 468 cells

2.3 CANP抑制劑對(duì)E2誘導(dǎo)MDA-MB-231及468細(xì)胞增殖和增強(qiáng)抗凋亡能力的影響

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，E2聯(lián)合Cal組和E2聯(lián)合CI Ⅲ組MDA-MB-231、468細(xì)胞的增殖率均顯著低于E2組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，或P<0.01)，見(jiàn)圖3A；細(xì)胞平板克隆形成試驗(yàn)結(jié)果顯示，E2聯(lián)合Cal組和E2聯(lián)合CI Ⅲ組MDA-MB-231、468細(xì)胞的菌落形成率均顯著低于E2組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖3B、3C；細(xì)胞凋亡試驗(yàn)結(jié)果顯示，E2聯(lián)合Cal組和E2聯(lián)合CI Ⅲ組MDA-MB-231、468細(xì)胞的熒光凋亡強(qiáng)度顯著高于E2組，見(jiàn)圖3D。

注：A為MTT實(shí)驗(yàn)，B為平板克隆實(shí)驗(yàn)，C為平板克隆實(shí)驗(yàn)的直條圖，D為熒光凋亡實(shí)驗(yàn)； 與E2組比較,(1)P <0.05，(2)P <0.01。圖3 CANP抑制劑對(duì)E2誘導(dǎo)MDA-MB-231及468細(xì)胞增殖和增強(qiáng)抗凋亡能力的影響Fig.3 Effects of CANP inhibitors on proliferation and anti-apoptotic ability of MDA-MB-231 and 468 cells induced by E2

CANP抑制劑對(duì)E2誘導(dǎo)MDA-MB-231及468細(xì)胞的YAP表達(dá)影響

Western blot結(jié)果顯示，E2聯(lián)合Cal組和E2聯(lián)合CI Ⅲ組中MDA-MB-231、468細(xì)胞YAP蛋白表達(dá)均顯著高于E2組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,或P<0.01)，見(jiàn)圖4。

注：與E2組比較，(1)P <0.05,(2)P <0.01。圖4 CANP抑制劑對(duì)E2誘導(dǎo)MDA-MB-231及468細(xì)胞YAP表達(dá)的影響(Western blot)Fig.4 Effects of CANP inhibitors on E2-induced YAP expression in MDA-MB-231 and 468 cells

3 討論

乳腺癌是世界范圍內(nèi)影響女性生命健康的最常見(jiàn)疾病，也是女性癌癥患者死亡的主要原因，發(fā)病率呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)[12]。目前該疾病已成為全球性問(wèn)題，預(yù)計(jì)在未來(lái)幾年內(nèi)發(fā)病率和死亡率會(huì)逐年增加，并有向年輕化發(fā)展的趨勢(shì)[13]。因此探討TNBC發(fā)病機(jī)制、尋找治療方法是目前全球?qū)W者都關(guān)注的問(wèn)題。有證據(jù)表明，E2是導(dǎo)致乳腺癌惡性生長(zhǎng)的重要原因，大多數(shù)人類(lèi)乳腺癌初期均為雌激素依賴(lài)性[14]。雌激素受體(estrogen receptor，ER)核心蛋白在正常情況下受到嚴(yán)格調(diào)控，病理?xiàng)l件下表達(dá)缺失[15]。ER核因子或ER核外信號(hào)調(diào)節(jié)失控可促進(jìn)ER陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[16]。有文獻(xiàn)報(bào)道，雌激素可通過(guò)GPER促進(jìn)與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)的Homeobox(HOX)轉(zhuǎn)錄本反義基因上調(diào)和誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞遷移[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，在MDA-MB-231、468細(xì)胞中，E2刺激可明顯使上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)相關(guān)蛋白表達(dá)上調(diào)，并促進(jìn)細(xì)胞活性增殖、遷移、侵襲。鈣蛋白酶1和鈣蛋白酶2在細(xì)胞中普遍表達(dá)，是細(xì)胞內(nèi)非溶酶體細(xì)胞質(zhì)需要鈣激活的半胱氨酸內(nèi)肽酶[18]。CANP的內(nèi)源特異性抑制劑是鈣蛋白酶抑制蛋白，具有惡性和良性組織中酶表達(dá)之間的差異[19]。Salehin等[18]研究表明，CANP信號(hào)通路參與介導(dǎo)包括HER2(+)或人乳腺腺癌細(xì)胞SKBR3和MDA-MB-231凋亡；也有報(bào)道稱(chēng)，在MAPK信號(hào)的作用下CANP2具有影響細(xì)胞黏附與遷移的能力[20]。以上研究表明，在癌癥中CANP與腫瘤的許多惡性行為學(xué)相關(guān)。YAP是人類(lèi)惡性腫瘤中普遍激活的高度相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，最近的研究表明，YAP對(duì)于癌癥的發(fā)生或大多數(shù)實(shí)體瘤的生長(zhǎng)是必需的，可活化誘導(dǎo)癌癥干細(xì)胞屬性、增殖、藥物抗性和轉(zhuǎn)移[21]。本研究結(jié)果表明，Cal和CI Ⅲ能明顯抑制E2對(duì)模型細(xì)胞增殖、抵抗細(xì)胞凋亡和細(xì)胞內(nèi)YAP蛋白表達(dá)的影響，提示E2對(duì)TNBC細(xì)胞的惡性增殖及YAP蛋白表達(dá)的影響可能與CANP信號(hào)通路相關(guān)。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，E2具有誘導(dǎo)模型細(xì)胞增殖、抵抗細(xì)胞凋亡的能力，Cal和CI Ⅲ可以阻斷E2誘導(dǎo)的上述生物學(xué)效應(yīng)，提示E2可通過(guò)CANP-YAP信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。