胡穎， 張晴， 葉蘭， 鄭濤

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 藥理學(xué)教研室， 貴州 貴陽(yáng) 550025； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 機(jī)能學(xué)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽(yáng) 550025； 3.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院， 貴州 貴陽(yáng) 550001)

子宮肌瘤又稱子宮平滑肌瘤，是女性生殖器中最常見(jiàn)的良性腫瘤，臨床常見(jiàn)的癥狀有子宮異常出血、壓迫癥狀、疼痛以及生育能力喪失等，嚴(yán)重威脅女性健康[1]。研究表明，子宮肌瘤的發(fā)生和發(fā)展與子宮平滑肌細(xì)胞的過(guò)度增殖關(guān)系密切[2]。本研究采用細(xì)胞生物學(xué)與中藥血清藥理學(xué)相結(jié)合的方法[3]，觀察婦科再造丸(FKW)含藥血清對(duì)體外原代培養(yǎng)的子宮肌瘤細(xì)胞增殖和凋亡的作用及對(duì)其人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因(PTEN)蛋白表達(dá)的影響，探討FKW抗子宮肌瘤的作用機(jī)理，為FKW臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1標(biāo)本收集 標(biāo)本取自2015年1月-2017年4月因子宮肌瘤而行子宮全切或肌瘤剔除術(shù)的絕經(jīng)前婦女，患者年齡35～50歲，術(shù)前3個(gè)月無(wú)類固醇激素使用史，術(shù)后經(jīng)病理學(xué)診斷為子宮肌瘤。術(shù)中無(wú)菌條件下取子宮肌瘤組織1 cm3，置于3%雙抗(青霉素、鏈霉素)的PBS 10 mL中，密閉冰浴條件下盡快送入細(xì)胞培養(yǎng)室。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)3月齡Sprague-Dawley (SD)大鼠，雌性、體質(zhì)量(200±20) g、合格證號(hào)SCXK(黔)2012-0001，由貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.3主要試劑與儀器 DMEM培養(yǎng)基(Hyclone)，胎牛血清(Hyclone)，DMSO(Sigma)，胰蛋白酶(Sigma)，MTT(Sigma)，Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(美國(guó)BD公司)；兔抗人平滑肌肌動(dòng)蛋白單克隆抗體(Abcam)，PTEN抗體、PV6000免疫組化試劑盒及DAB(氨基聯(lián)苯胺)顯色試劑盒均購(gòu)自北京中衫生物技術(shù)有限公司。酶標(biāo)儀(BIO-RAD550型)，BDS200倒置生物學(xué)顯微鏡(重慶奧特光學(xué)有限責(zé)任公司)，流式細(xì)胞儀(Guava easyCyte)，CO2恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司)，QL-901旋渦振蕩器(海門市麒麟醫(yī)用儀器廠)等。

1.1.4藥品 FKW(棕褐色丸劑)每10丸質(zhì)量2.6 g，貴陽(yáng)德昌祥藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)20151021，試驗(yàn)前用蒸餾水配制成高劑量112 g/L；中、低劑量組依次等比稀釋1倍，濃度分別為56 及28 g/L；桂枝茯苓膠囊(GuiZhi Fu Lin Jiao Nang,GZFLJN)，連云港康緣制藥股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)150106，臨用前用蒸餾水配制成混懸液30 g/L。

1.2 方法

1.2.1FKW含藥血清的制備 取健康雌性SD大鼠60只，隨機(jī)分為無(wú)藥血清組，F(xiàn)KW低、中、高劑量組，GZFLJN組，每組12只。每只大鼠灌注：無(wú)藥血清組每次灌服生理鹽水10 mL/kg；FKW高、中、低劑量組每次灌服相應(yīng)藥液10 mL/kg，分別為成人等效劑量12.9倍、6.5倍及3.2倍；GZFLJN組每次灌服相應(yīng)藥液10 mL/kg，為成人等效劑量6.4倍。各組大鼠給藥2次/d，共3 d，第3天末次給藥1 h后經(jīng)股動(dòng)脈取血，3 000 r/min離心20 min，分離血清，56 ℃恒溫30 min滅活補(bǔ)體，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌分裝，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2人子宮肌瘤細(xì)胞原代培養(yǎng)及鑒定[4]將肌瘤組織在無(wú)菌條件下用3%雙抗PBS液漂洗，在含DMEM培養(yǎng)液中剪碎為約1 mm3的組織塊，每塊間距2～3 mm擺放于培養(yǎng)瓶中，吸出培養(yǎng)液，輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶使瓶底朝上后加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，4 h后將培養(yǎng)瓶翻正培養(yǎng)，每2～3 d換液1次，約3～4周出現(xiàn)致密細(xì)胞層時(shí)取出組織塊，細(xì)胞生長(zhǎng)融合達(dá)80%時(shí)，胰酶消化傳代。選擇生長(zhǎng)良好、形態(tài)均一的第3～4代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。傳代細(xì)胞均經(jīng)α-actin(α-平滑肌肌動(dòng)蛋白)免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定證實(shí)。

1.2.3子宮肌瘤細(xì)胞增殖活力檢測(cè) 采用MTT比色分析法，將3～4代子宮肌瘤細(xì)胞消化成細(xì)胞懸液，調(diào)整濃度至6×109/L，每孔100 μL接種于96孔板(第一個(gè)孔留作空白)，于37 ℃、5% CO2中培養(yǎng)24 h，棄培養(yǎng)基后分別加入FKW低、中、高劑量組及GZFLJN組20%含藥血清處理細(xì)胞，以加入20%無(wú)藥血清組作為細(xì)胞對(duì)照，空白孔加入DMEM培養(yǎng)液作為空白對(duì)照，各設(shè)5個(gè)復(fù)孔，置正常條件下培養(yǎng)24、48及72 h，每孔加入5 g/L的MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄培養(yǎng)液，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150 μL，震蕩混勻15 min，酶標(biāo)儀在490 nm處測(cè)定吸光度(OD)值。并計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率(%)=(1-用藥組OD值/細(xì)胞對(duì)照組OD值)×100%。

1.2.4子宮肌瘤細(xì)胞凋亡檢測(cè) 采用Annexin V-FITC/PI雙染色法流式細(xì)胞術(shù)，將第3～4次傳代培養(yǎng)的子宮肌瘤細(xì)胞接種于5個(gè)6 cm培養(yǎng)皿(>1×105/皿)，隨機(jī)分為細(xì)胞對(duì)照組、FKW低、中、高劑量組及GZFJN組，置37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，依實(shí)驗(yàn)分組分別加入相應(yīng)的20%無(wú)藥血清及含藥血清培養(yǎng)液，根據(jù)MTT結(jié)果采用經(jīng)過(guò)各種藥物干預(yù)72 h的子宮肌瘤細(xì)胞，加入適量0.25%胰酶消化收集細(xì)胞，制備濃度為1×108/L的細(xì)胞懸液，取1 mL細(xì)胞懸液，離心后去上清液，Annexin V buffer液100 μL重懸，在細(xì)胞懸液中分別加入Annexin V-FITC 5 μL避光孵育20 min再加碘化丙啶(PI)染色液5 μL，室溫下避光孵育15 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)；實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5PTEN表達(dá) 采用免疫細(xì)胞化學(xué)法，在6孔板中放上18 mm×20 mm的蓋玻片，肌瘤細(xì)胞以1×107/L密度接種，每孔100 μL，按1.2.4項(xiàng)下分組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后，加入相應(yīng)的20%無(wú)藥血清及含藥血清培養(yǎng)液作用72 h，吸棄培養(yǎng)液，PBS沖洗3 min×2次，4%多聚甲醛固定30 min，PBS沖洗5 min×3次，山羊血清封閉液孵育10 min，甩去多余液體，滴加一抗，4 ℃過(guò)夜，滴加二抗，二氨基聯(lián)苯氨顯色液(DAB)顯色，脫水，封片。結(jié)果判斷：DAB染色后陽(yáng)性細(xì)胞細(xì)胞漿或細(xì)胞膜上出現(xiàn)棕黃色顆粒，采用圖像分析軟件計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞的平均光密度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 人子宮肌瘤細(xì)胞原代培養(yǎng)及鑒定

培養(yǎng)第10天開(kāi)始，組織塊邊緣有細(xì)胞游出，后隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸分裂，最終融合成片。胞體細(xì)長(zhǎng)，為不規(guī)則三角形或梭形，細(xì)胞生長(zhǎng)呈放射狀或旋渦狀。α-actin單克隆抗體免疫細(xì)胞化學(xué)染色證實(shí)培養(yǎng)的子宮肌瘤細(xì)胞在傳代過(guò)程中始終保持平滑肌特性，肌瘤細(xì)胞純度高，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)接近100%，可用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究。

2.2 FKW含藥血清對(duì)子宮肌瘤細(xì)胞增殖的影響

結(jié)果顯示(見(jiàn)表1和圖1)，F(xiàn)KW含藥血清各劑量組干預(yù)24、48及72 h，各給藥組OD值均較細(xì)胞對(duì)照組明顯下降(P<0.05，或<0.01)，在同一時(shí)間點(diǎn)，隨著FKW濃度的增加，其增殖抑制作用逐漸增強(qiáng)，細(xì)胞增殖抑制率逐步升高(P<0.05，或<0.01)；同一藥液濃度下，各組作用72 h的抑制效應(yīng)較作用24、48 h顯著增強(qiáng)(P<0.05，或<0.01)，顯示呈劑量和時(shí)間依賴性。因此，在后續(xù)研究中選取72 h為研究的有效作用時(shí)間點(diǎn)。

圖1 藥物對(duì)子宮肌瘤細(xì)胞的抑制率Fig.1 Drug inhibition rate of uterine leiomyoma cells

表1 FKW含藥血清對(duì)子宮肌瘤細(xì)胞增殖的影響(n=5)Tab.1 Effects of FKW medicated serum on proliferation of human uterine leiomyoma cells

注：與細(xì)胞對(duì)照組比較,(1)P<0.05，(2)P<0.01；與FKW低劑量組比較,(3)P<0.01,(4)P<0.05；與FKW中劑量組比較,(5)P<0.05，(6)P<0.01；與24h處理組比較,(7)P<0.01,(8)P<0.05；與48h處理組比較,(9)P<0.05。

2.3 FKW含藥血清對(duì)子宮肌瘤細(xì)胞凋亡率的影響

流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示，細(xì)胞對(duì)照組未見(jiàn)明顯細(xì)胞凋亡，F(xiàn)KW含藥血清各劑量組細(xì)胞凋亡率均顯著高于細(xì)胞對(duì)照組(P<0.01)，且子宮肌瘤細(xì)胞凋亡率隨著濃度的增高逐步增高，呈遞增趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖2。

注：(1)與細(xì)胞對(duì)照組比較, P<0.01；(2)與FKW低劑量組比較,P<0.01；(3)與FKW中劑量組比較， P<0.01。圖2 FKW對(duì)子宮肌瘤細(xì)胞凋亡率的影響Fig.2 Effect of FKW medicated serum on apoptosis rate of uterine leiomyoma cells

2.4 FKW含藥血清對(duì)子宮肌瘤細(xì)胞PTEN表達(dá)的影響

免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示，PTEN蛋白陽(yáng)性染色定位于平滑肌細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色。FKW低、中、高劑量含藥血清分別作用于子宮肌瘤細(xì)胞72 h時(shí)，均顯著提高了PTEN蛋白的表達(dá)(P<0.01)，其中FKW高劑量組上調(diào)PTEN表達(dá)作用最為顯著，與FKW低、中劑量組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表2、圖3。

表2 FKW含藥血清對(duì)子宮肌瘤細(xì)胞PTEN表達(dá)的影響(光密度,Tab.2 Effect of FKW medicated serum on the expression of PTEN protein of uterine leiomyoma cells

注：(1)與細(xì)胞對(duì)照組比較,P<0.01；(2)與FKW低劑量組比較,P<0.01；(3)與FKW中劑量組比較，P<0.01。

圖3 各組子宮肌瘤細(xì)胞PTEN表達(dá)(免疫細(xì)胞化學(xué)染色，×100)Fig.3 Expression of PTEN protein detected by immunocytochemical staining

3 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為子宮肌瘤屬“積聚”、 “癥瘕”等范疇，其病機(jī)以血瘀為主，瘀血是癥瘕形成的重要因素和關(guān)鍵環(huán)節(jié)。FKW由當(dāng)歸、白芍、三七、丹參、益母草等42味中藥組成，丹參破血去瘀，行氣止痛；當(dāng)歸、三七補(bǔ)血、活血、止痛，白芍滋養(yǎng)陰血；全方合用能起消瘤散結(jié)、活血去瘀、理氣消滯、清熱解毒之功。FKW的臨床反饋提示其對(duì)子宮肌瘤有一定療效[5]，本課題組的前期研究亦表明，F(xiàn)KW對(duì)于雌、孕激素誘發(fā)的大鼠子宮平滑肌瘤樣增生有顯著的抑制作用[6]。

子宮肌瘤的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，與子宮平滑肌細(xì)胞過(guò)度增殖密切相關(guān)。本研究通過(guò)體外培養(yǎng)人子宮肌瘤細(xì)胞，建立子宮肌瘤細(xì)胞原代培養(yǎng)并傳代，且保持良好的細(xì)胞形態(tài)和生化特點(diǎn)。在培養(yǎng)的子宮肌瘤細(xì)胞中應(yīng)用FKW含藥血清后發(fā)現(xiàn)：FKW含藥血清以劑量-時(shí)間依賴性方式抑制子宮肌瘤細(xì)胞增殖，以FKW高劑量組作用72 h時(shí)抑制增殖作用最為顯著；FKW含藥血清干預(yù)72 h后，各給藥組細(xì)胞凋亡率顯著高于細(xì)胞對(duì)照組(P<0.01)，且隨藥物濃度增加呈遞增趨勢(shì)。上述研究表明FKW含藥血清可抑制子宮肌瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)子宮肌瘤細(xì)胞凋亡，加速細(xì)胞凋亡過(guò)程，進(jìn)而控制肌瘤的生長(zhǎng)。

PTEN是一種具有磷酸酶活性的抑癌基因[7]，其產(chǎn)物PTEN蛋白具有脂質(zhì)磷酸酶活性和蛋白磷酸酶活性，可通過(guò)拮抗酪氨酸激酶等磷酸化酶的活性而抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展[8-9]。磷酯酰肌醇-3-激酶(phosphatidyrlinositol-3-kinase，PI3K)/Akt信號(hào)通路是由PI3K家族與其下游的直接靶蛋白絲/蘇氨酸蛋白激酶Akt或蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)組成，是重要的凋亡抑制通路，在調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、存活和遷移等方面發(fā)揮作用[10]。PI3K/Akt信號(hào)通路的激活，可能通過(guò)調(diào)節(jié)其下游凋亡基因如bcl-2家族的活性、激活其下游分子Mtor、抑制糖原合成酶3的活性等機(jī)制而導(dǎo)致細(xì)胞存活及增殖，并保護(hù)細(xì)胞逃避凋亡[11-12]。PTEN的主要作用是對(duì)該通路產(chǎn)生負(fù)調(diào)控，實(shí)驗(yàn)證實(shí)，PTEN主要是通過(guò)其脂質(zhì)磷酸酶活性作用于PI3K的下游靶分子三磷酸磷酯酰肌醇 (phosphatidylinosital triphosphate,PIP3)，從PIP3的3’去除磷酸將其轉(zhuǎn)變成二磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositalbiphosphate,PIP2)，使Akt無(wú)法活化從而阻斷PI3K/Akt信號(hào)通路的抗凋亡作用[13]。多種腫瘤中都可檢測(cè)到PTEN的表達(dá)減少或缺失。有學(xué)者通過(guò)免疫組化的方法發(fā)現(xiàn)PTEN在正常子宮肌層中高表達(dá)，在子宮肌瘤組織中表達(dá)強(qiáng)度顯著降低[14]，故認(rèn)為PTEN在正常子宮肌層中通過(guò)阻斷PI3K/Akt通路促進(jìn)細(xì)胞正常凋亡，抑制細(xì)胞增殖；而在子宮肌瘤組織中由于表達(dá)降低而失去了對(duì)此通路的抑制，無(wú)法發(fā)揮其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的負(fù)性調(diào)節(jié)作用，因此促進(jìn)了子宮肌瘤的發(fā)生發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)，與細(xì)胞對(duì)照組比較，F(xiàn)KW含藥血清各劑量組均能不同程度提高子宮肌瘤細(xì)胞PTEN表達(dá)(P<0.01)。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)FKW含藥血清抑制增殖和促進(jìn)凋亡的作用可能是通過(guò)上調(diào)PTEN的表達(dá)，進(jìn)而抑制PI3K/Akt信號(hào)通路的過(guò)度活化而實(shí)現(xiàn)的，其具體的作用機(jī)制需進(jìn)一步深入研究。