許偉先，何志偉，喻超，田舍，陳世裕，潘耀振，孫誠誼**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué)附院 肝膽外科，貴州 貴陽 550004；3.貴州醫(yī)科大學(xué) 肝膽胰脾重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽 550004；4.貴州省肝膽胰脾疾病研究所，貴州 貴陽 550004)

胰腺癌(pancreatic caner,PC)是一種惡性程度極高、早期不易診斷、預(yù)后極差的消化系統(tǒng)腫瘤[1]，由于PC早期發(fā)病癥狀隱匿、進(jìn)展迅速，大多數(shù)PC患者在明確診斷前就已經(jīng)發(fā)生了遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，喪失了根治性手術(shù)治療的機(jī)會；即使接受手術(shù)治療，患者5年生存率仍遠(yuǎn)低于其他惡性腫瘤。導(dǎo)致PC預(yù)后極差的主要原因是PC的早期侵襲及轉(zhuǎn)移能力較強(qiáng)[2],且其發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制仍未明確[3]。最近研究表明，miRNA在多種腫瘤中存在不同程度的異常表達(dá)，并在腫瘤的發(fā)生進(jìn)展中起到了尤為重要的作用[4]。microRNA(miRNA)是一種非編碼小RNA分子，由19～25個核苷酸組成，通過與靶基因結(jié)合可抑制相關(guān)蛋白質(zhì)的翻譯或促使其降解；miRNA還與其靶基因形成復(fù)雜的生物信息調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，參與細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞運(yùn)動及代謝等多種生物學(xué)功能[5-7]。miR125b在多種腫瘤中低表達(dá)、且發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能，然而其在PC中的研究目前尚未清楚[8-11]。本研究通過在PC細(xì)胞中過表達(dá)miR-125b，初步探究miR-125b在PC細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移中扮演的角色及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及主要試劑

人PC細(xì)胞株 PANC-1細(xì)胞及胰腺正常導(dǎo)管上皮細(xì)胞株均由華中科技大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院膽胰外科實(shí)驗(yàn)室饋贈，高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國賽默飛世爾公司，miR-125b過表達(dá)載體(miR-125b mimic)及空白載體(miR-125b NC)購自廣州銳博生物科技有限公司，PCR相關(guān)試劑購自上海生工生物有限公司，Matrigel基質(zhì)膠購自美國 BD公司，E- cadherin及Vimentin抗體購自美國 CST公司，Transwell小室及六孔板購自美國 Corning公司，細(xì)胞骨架探針購自美國 Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將細(xì)胞在培養(yǎng)箱10%胎牛血清的培養(yǎng)基、37 ℃、5% CO2恒溫中培養(yǎng)，視細(xì)胞的生長情況更換新鮮培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)或繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2轉(zhuǎn)染 將生長良好的PANC-1細(xì)胞進(jìn)行胰酶消化后并制成5×108/L的細(xì)胞懸液，分別接種于兩個6 cm培養(yǎng)皿，待細(xì)胞長滿至70%(處于對數(shù)生長期)時，分別將 miR-125 b mimic和miR-125b NC轉(zhuǎn)染入相應(yīng)的培養(yǎng)皿培養(yǎng)4～6 h，再更換培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，提取細(xì)胞 RNA，采用實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 將生長良好的 PANC-1細(xì)胞種植于六孔板，待細(xì)胞長滿至60%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染，待細(xì)胞長滿時、垂直劃線，并分別在倒置顯微鏡下觀察0、24、48及72 h時細(xì)胞生長狀況。研究設(shè)立陰性對照組(NC組，即轉(zhuǎn)染miR-125b NC的PANC-1細(xì)胞)及空白對照組(BC組，即胰腺正常導(dǎo)管上皮細(xì)胞)。

1.2.4Transwell小室侵襲及遷徙實(shí)驗(yàn) 提前30 min將 Matrigel基質(zhì)膠與培養(yǎng)基(不含胎牛血清)按1∶8稀釋，于小室上室鋪膠，置于37 ℃培養(yǎng)箱，選取生長良好的PANC-1細(xì)胞制備細(xì)胞懸液，采用不含胎牛血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，計數(shù)并調(diào)整密度為2×108/L，每個小室中加入細(xì)胞懸液200 μL，加入含10%胎牛血清培養(yǎng)基700 μL至下室，培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)24～36 h，用磷酸鹽緩沖液洗滌2次，4%的多聚甲醛固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色30 min，棉簽去除上室面細(xì)胞，晾干、拍照。Mage J軟件處理圖片數(shù)據(jù)。

1.2.5細(xì)胞骨架免疫熒光轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn) 取生長處于對數(shù)期的過表達(dá)miR-125b PANC-1及轉(zhuǎn)染空載體miR-125b PANC-1細(xì)胞重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為1.5×108/L，用共聚焦培養(yǎng)皿繼續(xù)培養(yǎng)，待其貼壁后固定、破膜、封閉，熒光染色2 h，堿性磷酸鹽緩沖液進(jìn)行洗滌，重復(fù)3次，DAPI染色5～10 min后，再次脫色并封片，置于共聚焦激光顯微鏡下觀察。

1.2.6上皮-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)蛋白表達(dá) 收集轉(zhuǎn)染72 h時的 PANC-1細(xì)胞，按照蛋白提取試劑盒說明提取蛋白，取30 μg蛋白樣品上樣，然后電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗4℃過夜、洗膜、二抗孵育2 h、再洗膜、加入ECL試劑顯影，在暗室中壓片獲得顯影后的底片，在成像系統(tǒng)中照相，用Mage J軟件計算條帶相對灰度值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 miR-125b對PANC-1細(xì)胞遷移能力的影響

如圖1所示，72 h時過表達(dá)miR-125 b的PANC-1細(xì)胞細(xì)胞相對遷移率為(53±8.16)%，顯著低于NC組(76.84±9.28)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 miR-125b對PANC-1細(xì)胞侵襲遷移能力的影響

如圖2顯示，在PCPANC-1細(xì)胞中，BC組及NC組發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的細(xì)胞數(shù)量顯著高于miR-125 b組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 miR-125b對PANC-1細(xì)胞骨架的影響

如圖3所示，過表達(dá)miR-25b PC PANC-1細(xì)胞中的F-肌動蛋白形態(tài)紊亂、且方向雜亂，提示其運(yùn)動能力和極性的缺失，遷移能力減弱。

注：(1)與miR-125b組比較，P<0.05。圖1 miR-125b對PANC-1細(xì)胞遷移能力的影響(細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn))Fig.1 Effect of miR-125b expression on migration of pancreatic cancer cells

注：(1)與BC組及NC組比較，P<0.05圖2 miR-125b對PANC-1細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響(Transwell實(shí)驗(yàn))Fig.2 Effects of miR-125b expression on migration and invasion of pancreatic cancer cells

圖3 過表達(dá)miR-125b對PANC-1細(xì)胞骨架的影響(細(xì)胞骨架免疫熒光實(shí)驗(yàn))Fig.3 Effect of miR-125b expression on the cytoskeleton of pancreatic cancer cells

2.4 E-cadherin及Vimentin蛋白表達(dá)

如圖4結(jié)果顯示，與NC組比較，轉(zhuǎn)染miR-125b mimic后的PANC-1細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)顯著上調(diào)，而Vimentin表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)。提示PANC-1細(xì)胞在過表達(dá)miR-125b后，細(xì)胞EMT受到抑制，這可能是細(xì)胞侵襲能力下降的機(jī)制之一。

注：(1)與NC組比較，P<0.05。圖4 miR-125b對PANC-1細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響(Western blot實(shí)驗(yàn))Fig.4 Effect of miR-125b on the expression of E-cadherin and vimentin

3 討論

PC是發(fā)病隱匿，較難早期診斷的消化道最常見的惡性腫瘤之一，很大一部分原因是其解剖位置較深及侵襲轉(zhuǎn)移能力較強(qiáng)[13]。近年來PC發(fā)生發(fā)展可能存在的相關(guān)機(jī)制已引起了本研究小組的高度關(guān)注，并已通過組織芯片技術(shù)篩選出幾組在PC中表達(dá)有顯著差異的 miRNAs，并就 miRNAs在PC的增殖、侵襲、“干性”等多方面進(jìn)行了初步研究[4]。miRNA是一種約由19～25個核苷酸組成的非編碼小RNA分子，可以通過結(jié)合靶基因mRAN的方式對基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控影響腫瘤的生長情況。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病中有著至關(guān)重要的地位。 MiR-125 b在乳腺癌[15]、胃癌[16]、肺癌[17]等腫瘤是低表達(dá)的，并有研究表明其能影響上述腫瘤的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移，表明其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展可能存在至關(guān)重要的影響。有研究表明，miR-125b在胃癌中直接靶向作用于MCL1從而抑制腫瘤的增殖與侵襲轉(zhuǎn)移[18]。本課題組也發(fā)現(xiàn)，miR-137、miR-1181、miR-29c分別與PC侵襲轉(zhuǎn)移能力，化療耐藥及干樣表型相關(guān)[19-22]。然而miR-125b在PC中究竟起到什么作用，目前仍未有明確的結(jié)論。本研究通過上調(diào)細(xì)胞中miR-125b的表達(dá)來觀察PC細(xì)胞侵襲能力的變化，同時發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-125b后，細(xì)胞EMT過程受到抑制。但miR-125b影響PC侵襲轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。

本研究首先構(gòu)建 miR-125 b mimic并轉(zhuǎn)染PC細(xì)胞系 PANC-1，上調(diào) miR-125 b在PC細(xì)胞系 PANC-1中的表達(dá)，并通過 Transwell、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)得出過表達(dá) miR-125 b后，PANC-1細(xì)胞相對于陰性對照組細(xì)胞遷移率明顯降低，空白組及對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，初步證實(shí)上調(diào)miR-125 b對PC細(xì)胞的侵襲及遷移能力有顯著抑制作用；通過激光共聚焦觀察對照組與過表達(dá)組細(xì)胞骨架發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-125 b后，運(yùn)動結(jié)構(gòu)缺如，細(xì)胞骨架形態(tài)雜亂，細(xì)胞極性消失，遷移能力減弱，細(xì)胞運(yùn)動能力下降。最后，通過 western blot檢測miR-125 b對PC細(xì)胞 EMT相關(guān)蛋白的影響，即過表達(dá)miR-125 b，E-cadherin顯著增加，而Vimentin表達(dá)減少，細(xì)胞上皮間質(zhì)化受到抑制，細(xì)胞侵襲能力可能下降。

綜上，miR-125b可能通過影響細(xì)胞EMT，進(jìn)一步抑制PC細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，從而為PC的診療提供新的靶點(diǎn)。然而PC細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力受miR-125b調(diào)控的具體通路機(jī)制仍然不明，需要進(jìn)一步探討。