黃欣昊， 柳千帆， 宋春灼， 朱海濤

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)院， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué)附院 肝膽外科， 貴州 貴陽 550004； 3.貴州醫(yī)科大學(xué)附院 臨床研究中心， 貴州 貴陽 550004)

胰腺癌是中國發(fā)病率居前10位、癌癥致死位列第7的惡性腫瘤，全世界每年預(yù)計有227 000人死于胰腺癌[1-2]。雖然近年來胰腺癌的診療取得了一定的進(jìn)展，但晚期患者的5年生存率仍然只有3%[3]。目前手術(shù)切除治療是唯一可以治愈胰腺癌的技術(shù)手段，但僅限于病灶未擴(kuò)散到胰腺之外的患者，且有80%～85%的晚期患者無法應(yīng)用手術(shù)治療[2,4]。大多數(shù)化學(xué)制劑對于胰腺癌的效果也十分有限[5]，吉西他濱(gemcitabine，GEM)是目前胰腺癌化學(xué)治療的一線首選藥物，但并不能明顯提高患者的生存時間，單獨(dú)使用時患者還易出現(xiàn)對藥物的抵抗，至今抵抗機(jī)制尚不明確[6-9]。因此，聯(lián)合使用其他的藥物治療胰腺癌是目前推薦的解決方案，表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)抑制劑厄洛替尼(erlotinib，ERL)聯(lián)合GEM是臨床上常用的分子靶向藥物的聯(lián)用方案[2,7]，與單用GEM相比，聯(lián)合ERL的治療方案可以延長患者的生存時間，但其效果以及作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究[10-11]，本研究分別通過單獨(dú)使用GEM、ERL，或兩種藥物聯(lián)合用藥，觀察藥物對胰腺癌細(xì)胞的毒性作用以及細(xì)胞克隆形成情況，探尋對胰腺癌治療的新方案。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞株、藥物及試劑 人胰腺癌細(xì)胞PANC-1細(xì)胞由中國科學(xué)院干細(xì)胞庫提供，GEM、ERL購自美國Selleck Chemicals公司，DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國GIBCO公司，胎牛血清購自以色列Biological Industries公司，0.25%胰酶溶液(含0.02%EDTA)購自美國GIBCO公司，PBS 購自美國Hyclone公司， DMSO購自美國Hyclone公司，CCK-8細(xì)胞毒性試劑盒購自上海東仁生物技術(shù)公司。

1.1.2主要儀器 Navios三激光10色流式細(xì)胞分析儀購自美國BECKMAN公司，Optima XPN-80超高速離心機(jī)購自美國BECKMAN公司，371型細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國thermo公司，AB2-4S1型生物安全柜購自新加坡藝思高科技公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及藥物配制 所有物品均滅菌處理，在紫外線照射消毒30 min后的生物安全柜中進(jìn)行細(xì)胞操作。人胰腺癌PANC-1細(xì)胞置于37 ℃的5% CO2恒溫潮濕環(huán)境中培養(yǎng)、分化，每2～3 d用無菌PBS磷酸緩沖液清洗，換新鮮完全培養(yǎng)基，PANC-1細(xì)胞處于細(xì)胞對數(shù)生長期，長滿至80%時進(jìn)行細(xì)胞傳代，以保證實驗所用的細(xì)胞均為對數(shù)生長期的PANC-1細(xì)胞。將GEM、ERL低速離心3 min后，GEM用無菌的PBS磷酸化緩沖液稀釋，ERL用DMSO稀釋，稀釋后的藥液避光保存在-20 ℃冰箱中。

1.2.2細(xì)胞分組 取對數(shù)生長期的PANC-1細(xì)胞。進(jìn)行如下干預(yù)： GEM各濃度組(0、10、20、50、100及250 nmol/L)、ERL各濃度組(0、10、20、50、100及200 nmol/L)；GEM+ERL各濃度組(GEM ∶ERL濃度比分別為1 ∶1、1 ∶5、1 ∶10、1 ∶20及1 ∶50)。在細(xì)胞平板克隆實驗中設(shè)立：對照組(無藥物處理)、GEM干預(yù)組[GEM的半數(shù)抑制濃度(IC50)]、ERL干預(yù)組(ERL的IC50)、聯(lián)合組(兩種藥物合用的濃度根據(jù)實驗確定)。分別用相應(yīng)濃度的含藥培養(yǎng)基培養(yǎng)PANC-1細(xì)胞24 h。

1.2.3GEM或ERL單獨(dú)應(yīng)用對PANC-1細(xì)胞毒性實驗 取對數(shù)生長期的PANC-1細(xì)胞，用0.25%含EDTA胰酶消化，離心后輕輕吹打成單細(xì)胞懸液，并進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。以每孔5 000個細(xì)胞接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，放入37 ℃的5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；待細(xì)胞長至80%，換無血清培養(yǎng)，分別將含有GEM(0、10、20、50、100及250 nmol/L)、或ERL(0、10、20、50、100及200 nmol/L)的培養(yǎng)基加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h，避光加入10%的CCK-8液，避光37 ℃孵育2 h，用化學(xué)酶標(biāo)儀在波長為450 nm的波長下檢測、記錄吸光度值(Optical density，OD)，并計算藥物對細(xì)胞的抑制率[抑制率=(對照組OD-實驗組OD)/(對照組OD-實驗組OD)×100%]，通過GraphPad Prism 7.0軟件繪制兩種藥物各自對細(xì)胞的抑制率曲線，并計算各自的IC50。

1.2.4GEM及ERL聯(lián)合應(yīng)用對PANC-1細(xì)胞毒性試驗 為了探究藥物組合，本研究通過設(shè)置多種不同濃度的GEM與ERL組合比例，并采用CCK-8細(xì)胞毒性法檢測GEM與ERL聯(lián)合應(yīng)用時對PANC-1細(xì)胞的抑制情況。在先前描述的條件下接種細(xì)胞，但此處用于評估的藥物干預(yù)劑量是基于每種單獨(dú)藥物的IC50制定的。在每個平板中兩種藥物的組合保證大于2種，并重復(fù)至少2次。采用Chou-Talalay聯(lián)合指數(shù)(combination index，CI)法計算CI[CI=(A藥單用濃度/A藥聯(lián)用濃度)+(B藥單用濃度/B藥聯(lián)用濃度)]分析兩種藥物合用時藥物相互作用的性質(zhì)，Chou-Talalay法規(guī)定CI<1藥物組合有協(xié)同作用，CI=1藥物組合有加成作用，CI>1藥物組合有拮抗作用；同時根據(jù)Chou-Talalay的等效原則，僅選擇GEM與ERL合用抑制率50%的組合與2種單藥的IC50進(jìn)行研究分析[12-13]。

1.2.5細(xì)胞克隆實驗 將PANC-1細(xì)胞設(shè)置為無干預(yù)組(對照組)、GEM組、ERL組、GEM聯(lián)合ERL組(聯(lián)合組)分別進(jìn)行干預(yù)。對照組無任何藥物處理，GEM組或ERL組藥物干預(yù)濃度分別為各自的IC50，聯(lián)合組中GEM及ERL的藥物濃度取決于藥物聯(lián)合分析實驗。將細(xì)胞對數(shù)生長期PANC-1細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，取6 000個細(xì)胞均勻接種于6孔板中，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁穩(wěn)定生長后，根據(jù)不同處理組各自的相應(yīng)藥物濃度繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)12 d后用4%多聚甲醇固定30 min，再加入0.25%結(jié)晶紫染液室溫靜染45 min。用相機(jī)拍照保留結(jié)果，通過Image J軟件處理圖像并計算細(xì)胞克隆數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 GEM或ERL對PANC-1細(xì)胞的毒性

用GraphPad Prism 7.0軟件繪制兩種藥物分別對細(xì)胞的抑制率曲線，并計算得出GEM對PANC-1細(xì)胞的IC50=80 nmol/L，ERL對PANC-1細(xì)胞的IC50=12 nmol/L。見圖1。

圖1 GEM或ERL對PANC-1細(xì)胞的抑制率Fig.1 Inhibition rate curves of GEM or ERL to PANC-1 cells

2.2 GEM和ERL聯(lián)合應(yīng)用對PANC-1細(xì)胞的毒性

將GEM與ERL進(jìn)行多種不同比例的濃度組合用于PANC-1細(xì)胞，結(jié)果顯示，ERL ∶GEM的濃度比為5 ∶1時，對PANC-1細(xì)胞的抑制率接近50%，高于濃度比1 ∶1和10 ∶1，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。因此選擇GEM與ERL5 ∶1組合用于后續(xù)實驗。根據(jù)Chou-Talalay法分析結(jié)果可以得知，在PANC-1細(xì)胞中，GEM與ERL合用CI=0.4，藥物合用有協(xié)同作用。

表1 不同濃度比例GEM與ERL聯(lián)合應(yīng)用對PANC-1細(xì)胞的抑制率Tab.1 The inhibition rate of PANC-1 cells by a combination of various ratios of GEM and ERL

注：(1)與GEM和ERL濃度比為5 ∶1時比較，P<0.05。

2.3 細(xì)胞克隆

與對照組比較，GEM組、ERL組、GEM和ERL聯(lián)合組的PANC-1細(xì)胞克隆數(shù)均顯著下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01,或P<0.000 1)；GEM和ERL聯(lián)合組PANC-1細(xì)胞克隆數(shù)顯著低于GEM組和ERL組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

注：(1)與聯(lián)合組比較，P<0.05；與對照組比較，(2)P<0.01，(3)P<0.000 1。圖2 GEM、ERL單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用對PANC-1細(xì)胞的細(xì)胞平板克隆的影響Fig.2 Cellular plate cloning results of drugs intervention in PANC-1 cells

3 討論

部分胰腺癌患者在確診時病情已經(jīng)發(fā)展到了終末期，錯失了手術(shù)機(jī)會，即使是有手術(shù)治療機(jī)會，患者也面臨著術(shù)后的高復(fù)發(fā)率[14-15]。已有研究表明，術(shù)后檢測切緣分級為0級的患者，2年后胰腺癌的復(fù)發(fā)率依然可以高達(dá)80%[4]。盡管近年來，化療方案在胃腸道等消化系統(tǒng)腫瘤的治療上取得了較大進(jìn)展，但胰腺癌仍然對大部分化療方案不敏感，甚至出現(xiàn)耐藥的情況[5]。尋找新的胰腺癌藥物治療方案，了解胰腺癌可能的分子機(jī)制是目前研究的重中之重。GEM是目前胰腺癌化療的首選藥物，它是脫氧胞苷的水溶性類似物，可以通過抑制DNA雙鏈的合成、修復(fù)來抑制細(xì)胞的分裂與增殖，從而抑制腫瘤的生長，但治療效果有限，即使采用了周密的全身性支持治療，患者在治療晚期依然會對GEM出現(xiàn)的耐藥情況[15-18]。因此，目前改善GEM治療效果的主要策略是將GEM與靶向或細(xì)胞毒性藥物聯(lián)合使用[6,11]。ERL是首個經(jīng)美國食品藥品監(jiān)督管理局(food and drug administration，F(xiàn)DA)批準(zhǔn)的、可與GEM聯(lián)用后促進(jìn)患者生存期出現(xiàn)優(yōu)勢的藥物，是一種具有選擇性的靶向可逆性抑制EGFR受體的小分子酪氨酸激酶抑制劑[6,11]。研究表明，大部分胰腺癌中EGFR的表達(dá)都有明顯上調(diào)[19-21]，且ERL的抗腫瘤性與抑制EGFR的表達(dá)有著密切聯(lián)系[18]。本課題組前期研究表明，GEM聯(lián)合ERL治療裸鼠轉(zhuǎn)移性胰腺癌時，可有效地抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展[22]。本次研究結(jié)果顯示，通過Chou-Talalay法進(jìn)行藥物聯(lián)合分析GEM聯(lián)合ERL有協(xié)同效應(yīng)。Carolina等[23]的研究結(jié)果與本研究結(jié)果類似。細(xì)胞克隆形成實驗表明，GEM聯(lián)合ERL可以抑制胰腺癌的發(fā)生發(fā)展，且優(yōu)于GEM和ERL的單獨(dú)使用效應(yīng)，該結(jié)果與本課題組前期裸鼠的實驗研究結(jié)果趨勢相同[22]。

綜上所述，GEM和ERL聯(lián)合使用具有協(xié)同作用，降低了兩種藥物的使用劑量，同時加強(qiáng)了抑制胰腺癌細(xì)胞增殖的效果，從而為胰腺癌治療中GEM與ERL聯(lián)合治療提供了初步的科學(xué)依據(jù)，也為胰腺癌治療的研究提供了較有價值的潛在方向。