弓雪 姜敏 齊欣 劉欣芳 盧生喬 陳坤 劉亞利 張述寬 馬濤 楊耀迥

摘要：【目的】克隆玉米蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因ZmSUT4，并明確其組織表達(dá)特性及在低溫脅迫下的表達(dá)模式，為深入研究SUT4基因響應(yīng)低溫脅迫的作用機(jī)理提供理論依據(jù)?！痉椒ā恳杂衩鬃越幌迭S早四幼苗為材料，采用RT-PCR克隆其ZmSUT4基因，分析其生物學(xué)信息，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)其組織表達(dá)特異性及低溫脅迫（4 ℃）下不同組織中的表達(dá)模式。【結(jié)果】克隆獲得的ZmSUT4基因（GenBank登錄號(hào)MK541991）全長(zhǎng)為1621 bp，開(kāi)放閱讀框（ORF）長(zhǎng)度為1506 bp，編碼501個(gè)氨基酸，編碼蛋白的分子量53.36 kD，理論等電點(diǎn)（pI）8.84，具有12個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，定位于細(xì)胞膜上，既屬于易化擴(kuò)散載體（MFS）家族成員，也屬于蔗糖/H+共轉(zhuǎn)運(yùn)體（GPH）超家族成員，其中第25～447位氨基酸是MFS家族蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，第17～484位氨基酸是GPH超家族成員的蔗糖運(yùn)轉(zhuǎn)子保守結(jié)構(gòu)域GPH-sucrose。ZmSUT4蛋白的氨基酸序列與單子葉植物SUT4蛋白同源性較高，為86%～96%，聚集在同一分支上;與雙子葉植物SUT4蛋白同源性較低，為62%～65%，說(shuō)明該類蛋白在不同物種間高度保守。ZmSUT4基因在玉米的根、莖和葉中均有表達(dá)，以根中的表達(dá)量最高，其次是葉，莖中的表達(dá)量最低。低溫脅迫下，ZmSUT4基因在不同組織中表達(dá)量模式不同，根和葉中ZmSUT4基因表達(dá)量均在脅迫24 h達(dá)最大值，分別是低溫脅迫前（0 h）表達(dá)量的2.21和2.62倍，莖中的ZmSUT4基因表達(dá)量在脅迫6 h達(dá)最大值，是低溫脅迫前表達(dá)量的3.01倍?！窘Y(jié)論】ZmSUT4基因受低溫脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，推測(cè)其是調(diào)控玉米響應(yīng)低溫脅迫的關(guān)鍵基因。

關(guān)鍵詞： 玉米;蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白;ZmSUT4基因;低溫脅迫;基因表達(dá);生物信息學(xué)分析

中圖分類號(hào)： S513.035.3 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2019）06-1165-08

Abstract：【Objective】The sucrose transporter gene ZmSUT4 was cloned from maize genome， its tissue expression characteristic and expression patterns in different tissues under low temperature stress were analyzed to lay the foundation for studying the mechanism of SUT4 gene in response to low temperature stress. 【Method】Reverse transcription-PCR（RT-PCR）method was performed to clone the ZmSUT4 gene from the maize inbred line Huangzaosi. Its bioinformatics was ana-lyzed and phylogenetic tree was established. Tissue expression specificity of gene ZmSUT4 and its expression patterns in different tissues under low temperature stress（4 ℃） were analyzed by real-time fluorescence quantitative PCR（qRT-PCR）. 【Result】ZmSUT4 gene was cloned（GenBank accession number MK541991） with full length of 1621 bp and harboured a open reading frame（ORF） of 1506 bp in length that encoded 501 amino acids with a molecular weight of 53.36 kD and an theoretical isoelectric point（pI） of 8.84. The ZmSUT4 protein had 12 trans-membrane spanning domains and located in cytomembrane，belonging to the major facilitator superfamily（MFS） and the sucrose/H+ symporter（glycoside-pentoside-hexuronide，GPH）family. Among them，the 25th to the 447th amino acids belonged to the conservative domain of MFS，while the 17th to th 484th amino acids were the conservative domain of GPH-sucrose. Amino acid sequence of ZmSUT4 had high identity（86-96%） with SUTs proteins in monocotyledon plants and belonged to the same branch， while shared low similarity（62%-65%） with SUTs proteins in dicotyledonous plant，illustrating that the amino acid sequences of SUT4 fami-ly proteins in different species were highly conservative. The relative expression level of ZmSUT4 could be detected in the leaves，stems and roots during seedling stage. Among them，the expression was the highest in the roots，followed by the leaves，and the lowest in the stems. Furthermore， the expression patterns of ZmSUT4 in various tissues were different. Under 24 h cold treatment，the expression in leaves and roots reached the peak and was as 2.21 times and 2.62 times as that at 0 h，respectively. The expression level in stems reached its maximum at 6 h，which was as 3.01 times as that before cold stress（0 h）. 【Conclusion】The expression of ZmSUT4 is induced by low temperature stress. It is inferred that ZmSUT4 is a crucial gene in maize for responding to low temperature stress.

Key words： maize; sucrose transporter; ZmSUT4 gene; low temperature stress; gene expression; bioinformatics analysis

0 引言

【研究意義】玉米（Zea mays）是全球重要的糧食、經(jīng)濟(jì)和飼料作物，也是我國(guó)東北地區(qū)種植面積最大的作物。但我國(guó)東北地區(qū)平均溫度偏低，積溫不足，極端低溫天氣頻發(fā)，嚴(yán)重阻礙玉米的生長(zhǎng)，而導(dǎo)致大幅減產(chǎn)（李馨園等，2017）。蔗糖是玉米光合作用的重要產(chǎn)物，其作為能量代謝底物和信號(hào)物質(zhì)在玉米抵御低溫脅迫、穩(wěn)產(chǎn)中發(fā)揮重要作用（Kühn and Grof，2010）。研究發(fā)現(xiàn)，蔗糖在從合成部位運(yùn)輸至生長(zhǎng)器官過(guò)程中，蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Sucrose transporters，SUCs或SUTs）負(fù)責(zé)蔗糖裝載、卸載及長(zhǎng)距離運(yùn)輸，低溫脅迫下可通過(guò)調(diào)整蔗糖在源庫(kù)間分配從而減少對(duì)玉米生長(zhǎng)發(fā)育的影響，提高逆境適應(yīng)能力（Kühn and Grof，2010;Gong et al.，2015）。因此，深入研究低溫脅迫下SUTs基因表達(dá)情況對(duì)探究植物光合產(chǎn)物運(yùn)輸和分配調(diào)節(jié)機(jī)制具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】通過(guò)RT-PCR、cDNA文庫(kù)篩選、EST庫(kù)或基因組序列數(shù)據(jù)庫(kù)搜索等方法，已鑒定出100多種SUTs基因（Sun et al.，2008;Hirose et al.，2010;齊素坤等，2018），根據(jù)各基因序列同源性和蔗糖的親和力，可將其劃分為SUT1、SUT2、SUT3、SUT4和SUT5五個(gè)亞族，其中SUT1亞族是雙子葉植物所特有，SUT2和SUT4亞族是單子葉和雙子葉植物所共有，SUT3和SUT5亞族是單子葉植物所特有，說(shuō)明單子葉和雙子葉植物的SUTs發(fā)生分子變異及進(jìn)化（Sauer，2007;Kühn and Grof，2010）。不同物種含有的SUTs基因家族成員數(shù)量也不同，如擬南芥含9個(gè)成員，玉米和小麥均含6個(gè)成員（Kühn and Grof，2010;Aoki et al.，2012）。SUTs基因家族成員在不同生長(zhǎng)階段及不同部位表達(dá)行使多種生物學(xué)功能，同時(shí)參與許多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑（Gupta and Kaur，2005;Kühn and Grof，2010）。此外，SUTs在高鹽、干旱和低溫等非生物脅迫中發(fā)揮重要作用，如擬南芥AtSUC2、AtSUC4、AtSUC9、蘋(píng)果MdSUT2和水稻OsSUT2基因受非生物脅迫、ABA或低糖誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)，通過(guò)加強(qiáng)源葉中蔗糖外運(yùn)，促進(jìn)庫(kù)器官碳水化合物的積累而提高植株抗性（Ibraheem et al.，2011;Gong et al.，2015;Jia et al.，2015;Ma et al.，2016）。高鹽脅迫誘導(dǎo)旱芹AgSUT1基因的表達(dá)下調(diào)，尤其是在根中表達(dá)顯著下調(diào)，可能是植株通過(guò)減少對(duì)根中蔗糖的供應(yīng)以抑制根的生長(zhǎng)，從而抵御鹽脅迫（Noiraud et al.，2000）。在鹽和干旱脅迫下，百脈根LjSUT4和楊樹(shù)PtaSUT4基因通過(guò)調(diào)控液泡中蔗糖濃度，改變液泡局部滲透壓，影響植株水分平衡，提高植株抗性（Reinders et al.，2008;Frost et al.，2012）。干旱脅迫下，小麥葉片中TaSUT2基因表達(dá)顯著下調(diào)，TaSUT3基因表達(dá)顯著上調(diào)，但TaSUT1基因的表達(dá)量無(wú)明顯變化，說(shuō)明逆境脅迫下不同SUTs基因家族成員的響應(yīng)方式和發(fā)揮的作用各不相同（Xue et al.，2008）。此外，利用分裂泛素系統(tǒng)研究發(fā)現(xiàn)，AtSUC3與AtSUC2和AtSUC4均存在互作效應(yīng)（Reinders et al.，2002;Schulze et al.，2003），非生物脅迫下擬南芥野生型植株中AtSUC2和AtSUC4基因表達(dá)量較未處理組野生型顯著上調(diào)，在AtSUC3突變體中AtSUC2和AtSUC4基因表達(dá)量增幅較野生型顯著降低，說(shuō)明AtSUC3基因可能通過(guò)調(diào)節(jié)AtSUC2和AtSUC4基因表達(dá)，參與植物逆境響應(yīng)（Gong et al.，2015）。目前，關(guān)于玉米SUTs基因表達(dá)特性的研究報(bào)道較少。馬小龍等（2009）研究發(fā)現(xiàn)，玉米ZmERD6基因受ABA、干旱、鹽和低溫誘導(dǎo)，其編碼蛋白含有易化擴(kuò)散載體（MFS）結(jié)構(gòu)域，屬于MFS家族的蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)子（Sugar transporter）亞族，但與ZmSUT1～ZmSUT6蛋白序列的同源性非常低?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】至今，鮮見(jiàn)有關(guān)玉米ZmSUT4基因克隆及低溫脅迫下表達(dá)特性分析的研究報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以玉米自交系黃早四幼苗為材料，采用RT-PCR克隆其ZmSUT4基因，分析其生物學(xué)信息，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)其組織特異性及低溫脅迫下不同組織中的表達(dá)模式，為探究ZmSUT4基因響應(yīng)低溫協(xié)迫的作用機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試材料為玉米自交系黃早四，由遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米研究所提供，種植于遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院盆栽場(chǎng)。主要試劑：植物總RNA提取試劑盒和cDNA第一鏈合成試劑盒（Quantscript RT Kit）均購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司;Promega GoTaq qPCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司;KAPA Hifi高保真DNA聚合酶購(gòu)自美國(guó)KAPA Biosystems公司;大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司;pMD20-T克隆載體購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。主要儀器設(shè)備：人工氣候箱（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司）、ChemiDoc XRS+凝膠成像系統(tǒng)（BIO-RAD，美國(guó)）和qTOWER 2.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Jena，德國(guó)）等。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 低溫脅迫處理及樣品采集 將玉米自交系黃早四種子播種在營(yíng)養(yǎng)土∶蛭石=3∶1（m/m）的混合土中，每盆種1粒種子。參照Z(yǔ)hao等（2009）的方法，待幼苗長(zhǎng)至三葉一心時(shí)，將生長(zhǎng)整齊健壯的幼苗移至4 ℃人工氣候箱，低溫處理0、1、3、6、12和24 h。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)重復(fù)3次，每次處理1株。處理結(jié)束后，將玉米幼苗從土中取出，小心沖洗根部后擦干，迅速剪取植株根、莖和葉，用錫箔紙包好，液氮速凍后 -80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2. 2 總RNA提取及cDNA第一鏈合成 利用植物總RNA提取試劑盒提取黃早四幼苗的總RNA，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性。以提取的總RNA為模板，采用cDNA第一鏈合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA第一鏈。

1. 2. 3 引物設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)NCBI上已發(fā)表的玉米SUT4基因cDNA序列（GenBank登錄號(hào)AY603492），利用Primer 5.0設(shè)計(jì)特異引物（表1）。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1. 2. 4 PCR擴(kuò)增 以cDNA全長(zhǎng)序列為模板，PCR擴(kuò)增ZmSUT4基因。PCR反應(yīng)體系50.00 μL：5.00 μL 10×Buffer，2.5 mmol/L dNTP 1.00 μL，10 μmol/L上、下游引物（ZmSUT4-F和ZmSUT4-R）各1.00 μL，cDNA模板1.00 μg，5 U/μL DNA聚合酶0.5 μL，滅菌超純水補(bǔ)足至50.00 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 100 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，切膠回收目的條帶，將其與pMD20-T載體連接過(guò)夜后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，菌落PCR鑒定后將陽(yáng)性克隆菌液送至上海立菲生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1. 2. 5 生物信息學(xué)分析 通過(guò)NCBI的BLAST進(jìn)行ZmSUT4基因核苷酸序列比對(duì)，并利用ORF finder預(yù)測(cè)分析ZmSUT4基因的開(kāi)放閱讀框（ORF）;采用ProtParam和ProtScale預(yù)測(cè)編碼蛋白的分子量、理論等電點(diǎn)（pI）、親/疏水性等生化性質(zhì);利用Smart和NCBI的CDD預(yù)測(cè)編碼蛋白的保守結(jié)構(gòu)域;利用TMHMM Server v2.0預(yù)測(cè)蛋白的跨膜結(jié)構(gòu);利用LocTree3預(yù)測(cè)蛋白的亞細(xì)胞定位;采用SOPMA Secondary Structure Prediction Method預(yù)測(cè)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu);應(yīng)用BioEdit的ClustalW與不同物種的SUT4亞族成員進(jìn)行序列比對(duì)及同源性分析，利用MEGA 6.0.5構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。

1. 2. 6 qRT-PCR檢測(cè) 以cDNA第一鏈為模板，利用GoTaq qPCR試劑盒在qTOWER 2.2實(shí)時(shí)定量PCR儀上對(duì)低溫脅迫下玉米苗期ZmSUT4基因的表達(dá)模式進(jìn)行檢測(cè)。反應(yīng)體系25.00 μL：SYBR Mix 12.50 μL，10 μmol/L上、下游引物（qZmSUT4-F和qZmSUT4-R）各0.50 μL，cDNA模板1.00 μg，滅菌超純水補(bǔ)足至25.00 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。以ZmSUT4基因在0 h的表達(dá)量為標(biāo)準(zhǔn)參量，以GADPH為內(nèi)參基因（引物GADPH-F和GADPH-R見(jiàn)表1），無(wú)菌超純水為陰性對(duì)照。反應(yīng)結(jié)束后，采用2-ΔΔCt法統(tǒng)計(jì)不同處理樣品中ZmSUT4基因的相對(duì)表達(dá)量，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1. 3 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2007對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及制圖。

2 結(jié)果與分析

2. 1 ZmSUT4基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

如圖1所示，目的條帶約1600 bp，與預(yù)期結(jié)果相符。測(cè)序結(jié)果（圖2）顯示，該片段長(zhǎng)度為1621 bp，ORF長(zhǎng)度為1506 bp，編碼501個(gè)氨基酸，經(jīng)BLAST比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，其與玉米SUT4基因（GenBank登錄號(hào)AY603492）相似性高達(dá)99%，表明成功克隆獲得ZmSUT4基因。該基因已在GenBank基因數(shù)據(jù)庫(kù)注冊(cè)，登錄號(hào)為MK541991。

2. 2 ZmSUT4蛋白的生物信息學(xué)分析結(jié)果

ZmSUT4蛋白中帶正電荷的氨基酸（精氨酸和賴氨酸）所占比例為33%，帶負(fù)電荷的氨基酸（天冬氨酸和谷氨酸）所占比例為27%，理論等電點(diǎn)（pI）為8.84，分子式為C2441H3805N635O665S21，分子量53.36 kD，含7567個(gè)原子，蛋白不穩(wěn)定系數(shù)（Instability index）36.18，為穩(wěn)定蛋白。該蛋白N端序列是蛋氨酸，半衰期30 h，脂肪系數(shù)103.61;親水性最強(qiáng)的位點(diǎn)為第167位，分值-3.000，親水性平均值-0.49，疏水性最強(qiáng)的位點(diǎn)為第225位，分值3.311，由此推測(cè)ZmSUT4為親水性蛋白（圖3）。

對(duì)ZmSUT4蛋白氨基酸序列的保守區(qū)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，該蛋白既屬于MFS家族成員，也屬于蔗糖/H+共轉(zhuǎn)運(yùn)體（GPH）超家族成員，其中第25～447位氨基酸是MFS家族蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，第17～484位氨基酸是GPH超家族成員的蔗糖運(yùn)轉(zhuǎn)子保守結(jié)構(gòu)域GPH-sucrose。蛋白跨膜拓?fù)鋵W(xué)分析結(jié)果表明，ZmSUT4蛋白存在12個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，在第1個(gè)和第2個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)間均具有保守的組氨酸（His）殘基，其是蔗糖與蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的結(jié)合區(qū)域（圖4）。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，ZmSUT4蛋白為一種膜蛋白，可能位于細(xì)胞膜上。蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，在ZmSUT4蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中，α-螺旋（α-helix，H）占46.31%，無(wú)規(guī)則卷曲（Random coil，C）占35.53%，β-轉(zhuǎn)角（β-turn，T）占3.19%，延伸鏈（Extended strand，E）占14.37%（圖5）。

2. 3 同源性比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果

為明確ZmSUT4蛋白與其他物種SUTs亞族成員的同源性和進(jìn)化關(guān)系，從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)篩選獲得11種植物SUT4亞族成員的氨基酸序列，其中，胡蘿卜DcSUT1、大麥HvSUT2和水稻OsSUT2均已證實(shí)屬于SUT4亞族成員（Sun et al.，2008;Kühn and Grof，2010），將其與ZmSUT4蛋白的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示，ZmSUT4蛋白與雙子葉植物擬南芥AtSUT4（Arabidopsis thaliana，Q9FE59）、楊樹(shù)PtaSUT4（Populus L.，ADW94617）、馬鈴薯StSUT4（Solanum tuberosum L.，AAG25923）、胡蘿卜DcSUT1（Daucus carota L.，CAA76367）、番茄LeSUT4（Lycopersicon esculentum L.，AAG09270）、百脈根LjSUT4（Lotus corniculatus L.，CAD61275）和桃PpSUT4（Prunus persica L.，ALX37955）的同源性較低，分別為62%、62%、63%、63%、64%、64%和65%，與單子葉植物大麥HvSUT2（Hordeum vulgare L.，CAB75881）、水稻OsSUT2（Oryza sativa L.，BAC67163）、高粱SbSUT4（Sorghum bicolor L.，ACX7183）和甘蔗ShSUT4（Saccharum officinarum，ADE22272）的同源性較高，分別為86%、91%、96%和96%（圖6）。由圖7可知，單子葉植物和雙子葉植物的SUT4亞族成員分別聚在兩個(gè)不同的分支上，且在同一分支間保守性較高，說(shuō)明ZmSUT4蛋白與單子葉植物SUT4蛋白的親緣關(guān)系較近。

2. 4 ZmSUT4基因在不同玉米組織中的表達(dá)情況

利用qRT-PCR對(duì)不同玉米組織中ZmSUT4基因表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖8所示。ZmSUT4基因在玉米的根、莖和葉中均有表達(dá)，且表達(dá)量存在明顯差異，以根中的表達(dá)量最高，葉次之，莖中的表達(dá)量最低。葉和根中的表達(dá)量分別是莖中表達(dá)量的3.81和4.03倍。可見(jiàn)，ZmSUT4基因在不同部位表達(dá)模式存在差異，其主要參與葉片蔗糖的合成及根部蔗糖的卸載。

2. 5 低溫脅迫下ZmSUT4基因在不同玉米組織中的表達(dá)模式分析結(jié)果

利用qRT-PCR檢測(cè)低溫脅迫下ZmSUT4基因在不同玉米組織中的表達(dá)模式，結(jié)果如圖9所示。ZmSUT4基因?qū)Φ蜏孛{迫有較明顯的響應(yīng)，但不同組織的響應(yīng)模式有所差異。根和葉中ZmSUT4基因表達(dá)量呈不同的波動(dòng)式變化趨勢(shì)，但均在脅迫24 h達(dá)最大值，分別是低溫脅迫前（0 h）表達(dá)量的2.21和2.62倍。莖中ZmSUT4基因的表達(dá)量在脅迫0～6 h逐漸增加，至脅迫6 h達(dá)最大值，是低溫脅迫前表達(dá)量的3.01倍，隨后快速下降，但仍高于低溫脅迫前表達(dá)量。可見(jiàn)，不同玉米組織中ZmSUT4基因?qū)Φ蜏孛{迫響應(yīng)的關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)不同，但均受低溫脅迫誘導(dǎo)高效表達(dá)，在植株抗低溫脅迫中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。

3 討論

SUTs作為一類重要的功能性蛋白，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用。目前，從玉米中已克隆獲得6個(gè)SUTs基因（Kühn and Grof，2010），但其在玉米逆境脅迫響應(yīng)中的作用機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)RT-PCR從玉米自交系黃早四中克隆獲得ZmSUT4基因，該基因全長(zhǎng)1621 bp，ORF長(zhǎng)度1506 bp，編碼501個(gè)氨基酸，經(jīng)同源比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，該基因編碼蛋白的氨基酸序列與單子葉植物甘蔗、高粱、水稻和大麥的SUT4同源性較高，均在85%以上，盡管雙子葉與單子葉植物屬于不同分支，但ZmSUT4蛋白與雙子葉的同源性仍在60%以上，說(shuō)明不同植物中SUT4蛋白的氨基酸序列高度保守，推測(cè)其在不同植物中發(fā)揮相似的生理功能。

本研究發(fā)現(xiàn)，ZmSUT4蛋白具有12個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，既屬于MFS家族成員，也屬于GPH超家族成員，其中第25～447位氨基酸是MFS家族蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，第17～484位氨基酸是GPH超家族成員的蔗糖運(yùn)轉(zhuǎn)子保守結(jié)構(gòu)域GPH-sucrose，與前人的相關(guān)研究結(jié)果（Kühn and Grof，2010;Yan，2013）基本一致。植物SUTs的5個(gè)亞族中，SUT4亞族是低親和/高轉(zhuǎn)運(yùn)能力的蛋白，定位于葉綠體、液泡膜和細(xì)胞膜（Weise et al.，2000;Rolland et al.，2003;Endler et al.，2006;Chincinska et al.，2008），如大麥HvSUT2、桃PpSUT4和水稻OsSUT2定位于液泡膜，參與液泡膜蔗糖的外運(yùn)（Endler et al.，2006;Sauer，2007;Eom et al.，2011;Zanona et al.，2015）;番茄LeSUT2和馬鈴薯StSUT4定位在細(xì)胞膜上，負(fù)責(zé)蔗糖韌皮部蔗糖裝載、卸載和跨膜運(yùn)輸（Hackel et al.，2006;Hofmann et al.，2007;Chincinska et al.，2008）。本研究的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，ZmSUT4蛋白為一種膜蛋白，可能位于細(xì)胞膜上。此外，本研究qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，在正常生長(zhǎng)條件下，ZmSUT4基因在玉米根、莖和葉中均有表達(dá)，但表達(dá)量存在明顯差異，與賀紅霞等（2015）研究結(jié)果一致。其中，ZmSUT4基因在葉片和根中的表達(dá)量較高，莖中的表達(dá)量較低，推測(cè)該基因可能與番茄LeSUT2和馬鈴薯StSUT4基因功能相似，參與蔗糖在源器官的裝載及庫(kù)器官的吸收和利用，為庫(kù)器官提供碳水化合物（Hackel et al.，2006;Hofmann et al.，2007;Chincinska et al.，2008）。

本研究還發(fā)現(xiàn)，根和葉中ZmSUT4基因表達(dá)量均在低溫脅迫24 h達(dá)最大值，分別是低溫脅迫前表達(dá)量的2.21和2.62倍，莖中ZmSUT4基因的表達(dá)量在脅迫6 h達(dá)最大值，是低溫脅迫前表達(dá)量的3.01倍，可見(jiàn)，ZmSUT4基因?qū)Φ蜏孛{迫有較明顯的響應(yīng)，但在不同組織的響應(yīng)模式有所差異。Gong等（2015）也研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥葉片和根中AtSUC4基因受低溫脅迫誘導(dǎo)高表達(dá)。綜上所述，不同植物的SUT4基因具有相似調(diào)控功能。下一步應(yīng)將ZmSUT4基因轉(zhuǎn)入模式植物如擬南芥中，以期深入研究玉米ZmSUT4基因在逆境脅迫應(yīng)答中的調(diào)控機(jī)制。

4 結(jié)論

ZmSUT4基因受低溫脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，推測(cè)其是調(diào)控玉米響應(yīng)低溫脅迫的關(guān)鍵基因。

參考文獻(xiàn)：

賀紅霞，陳亮，康爽，林春晶，李楠，柳青，劉丹，薛晶，孫瑞聰，趙慧敏. 2015. 玉米ZmSUT4-J基因的克隆與植物表達(dá)載體構(gòu)建[J]. 吉林農(nóng)業(yè)科學(xué)，40（3）：18-22. [He H X，Chen L，Kang S，Lin C J，Li N，Liu Q，Liu D，Xue J，Sun R C，Zhao H M. 2015. Cloning of sucrose transporter ZmSUT4-J from Zea mays and construction of plant expre-ssion vector[J]. Journal of Jilin Agricultural Sciences，40（3）：18-22.]

李馨園，楊曄，張麗芳，左師宇，李麗杰，焦健，李晶. 2017. 外源ABA對(duì)低溫脅迫下玉米幼苗內(nèi)源激素含量及Asr1基因表達(dá)的調(diào)節(jié)[J]. 作物學(xué)報(bào)，43（1）：141-148. [Li X Y，Yang Y，Zhang L F，Zuo S Y，Li L J，Jiao J，Li J. 2017. Regulation on contents of endogenous hormones and Asr1 gene expression of maize seedling by exogenous ABA under low-temperature stress[J]. Acta Agronomica Sinica，43（1）：141-148.]

馬小龍，劉穎慧，袁祖麗，石云素，宋燕春，王天宇，黎裕. 2009. 玉米蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因ZmERD6 cDNAs的克隆與逆境條件下的表達(dá)[J]. 作物學(xué)報(bào)，35（8）：1410-1417. [Ma X L，Liu Y H，Yuan Z L，Shi Y S，Song Y C，Wang T Y，Li Y. 2009. Cloning of cDNAs for a novel sugar transporter gene，ZmERD6，from maize and its expression analysis under abiotic stresses[J]. Acta Agronomica Sinica，35（8）：1410-1417.]

齊素坤，侯夫云，秦楨，李愛(ài)賢，王慶美，張立明. 2016. 植物蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白研究進(jìn)展[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，48（2）：149-153. [Qi S K，Hou F Y，Qin Z，Li A X，Wang Q M，Zhang L M. 2016. Research progress of sucrose transporters in plant[J]. Shandong Agricultural Sciences，48（2）：149-153.]

Aoki N，Hirose T，F(xiàn)urbank R T. 2012. Sucrose transport in higher plants：From source to sink[J]. Advances in Photosynthesis and Respiration，34：703-729.

Chincinska I A，Liesche J，Krügel U，Michalska J，Geigenber-ger P，Grimm B，Kühn C. 2008. Sucrose transporter StSUT4 from potato affects flowering，tuberization，and shade avoidance response[J]. Plant Physiology，146（2）：515-528.

Endler A，Meyer S，Schelbert S，Schneider T，Weschke W，Peters S W，Keller F，Baginsky S，Martinoia E，Schmidt U G. 2006. Identification of a vacuolar sucrose transporter in barley and Arabidopsis mesophyll cells by a tonoplast proteomic approach[J]. Plant Physiology，141（1）：196-207.

Eom J S，Cho J I，Reinders A，Lee S W，Yoo Y，Tuan P Q，Choi S B，Bang G，Park Y I，Cho M H，Bhoo S H，An G，Hahn T R，Ward J M，Jeon J S. 2011. Impaired function of the tonoplast-localized sucrose transporter in rice，OsSUT2，limits the transport of vacuolar reserve sucrose and affects plant growth[J]. Plant Physiology，157（1）：109-119.

Frost C J，Nyamdari B，Tsai C J，Harding S A. 2012. The tonoplast-localized sucrose transporter in Populus（PtaSUT4） regulates whole-plant water relations，responses to water stress，and photosynthesis[J]. PLoS One，7（8）：e44467.

Gong X，Liu M L，Zhang L J，Ruan Y Y，Ding R，Ji Y Q，Zhang N，Zhang S B，F(xiàn)armer J，Wang C. 2015. Arabidopsis AtSUC2 and AtSUC4，encoding sucrose transporters，are required for abiotic stress tolerance in an ABA-dependent pathway[J]. Physiologia Plantarum，153（1）：119-136.

Gupta A K，Kaur N. 2005. Sugar signalling and gene expre-ssion in relation to carbohydrate metabolism under abiotic stresses in plants[J]. Journal of Biosciences，30（5）：761-776.

Hackel A，Schauer N，Carrari F，F(xiàn)ernie A R，Grimm B，Kühn C. 2006. Sucrose transporter LeSUTl and LeSUT2 inhibition affects tomato fruit development in different ways[J]. The Plant Journal，45（2）：180-192.

Hirose T，Zhang Z J，Miyao A，Hirochika H，Ohsugi R，Terao T. 2010. Disruption of a gene for rice sucrose transpor-ter，OsSUT1，impairs pollen function but pollen maturation is unaffected[J]. Journal of Experimental Botany，61（13）：3639-3646.

Hofmann J，Wieczorek K，Bl?chl A，Grundler F M. 2007. Sucrose supply to nematode-induced syncytia depends on the apoplasmic and symplasmic pathways[J]. Journal of Experimental Botany，58（7）：1591-601.

Ibraheem O，Dealtry G，Roux S，Bradley G. 2011. The effect of drought and salinity on the expressional levels of sucrose transporters in rice（Oryza sativa Nipponbare） cultivar plants[J]. Plant Omics Journal，4（2）：68-74.

Jia W Q，Zhang L J，Wu D，Liu S，Gong X，Cui Z H，Cui N，Cao H Y，Rao L B，Wang C. 2015. Sucrose transporter AtSUC9 mediated by a low sucrose level is involved in Arabidopsis abiotic stress resistance by regulating sucrose distribution and ABA accumulation[J]. Plant Cell Physio-logy，56（8）：1574-1587.

Kühn C，Grof C P L. 2010. Sucrose transporters of higher plants[J]. Current Opinion in Plant Biology，13（3）：288-298.

Ma Q J，Sun M H，Liu Y J，Lu J，Hu D G，Hao Y J. 2016. Molecular cloning and functional characterization of the apple sucrose transporter gene MdSUT2[J]. Plant Physio-logy and Bochemistry，109：442-451.

Noiraud N，Delrot S，Lemoine R. 2000. The sucrose transpor-ter of celery. Identification and expression during salt stress[J]. Plant Physiology，122（4）：1447-1455.

Reinders A，Schulze W，Kühn C，Barker L，Schulz A，Ward J M，F(xiàn)rommer W B. 2002. Protein-protein interactions between sucrose transporters of different affinities colocali-zed in the same enucleate sieve element[J]. The Plant Cell，14（7）：1567-1577.

Reinders A，Sivitz A B，Starker C G，Gantt J S，Ward J M. 2008. Functional analysis of LjSUT4，a vacuolar sucrose transporter from Lotus japonicus[J]. Plant Molecular Bio-logy，68（3）：289-299.

Rolland N，F(xiàn)erro M，Seigneurin-Berny D，Garin J，Douce R，Joyard J. 2003. Proteomics of chloroplast envelope membranes[J]. Photosynthesis Research，78（3）：205-230.

Sauer N. 2007. Molecular physiology of higher plant sucrose transporters[J]. FEBS Letters，581（12）：2309-2317.

Schulze W X，Reinders A，Ward J，Lalonde S，F(xiàn)rommer W B. 2003. Interactions between co-expressed Arabidopsis sucrose transporters in the split-ubiquitin system[J]. BMC Biochemistry，4（1）：1-10.

Sun A J，Xu H L，Gong W K，Zhai H L，Meng K，Wang Y Q，Wei X L，Xiao G F，Zhu Z. 2008. Cloning and expression analysis of rice sucrose transporter genes OsSUT2M and OsSUT5Z[J]. Journal of Integrative Plant Biology，50（1）：62-75.

Weise A，Barker L，Kühn C，Lalonde S，Buschmann H，F(xiàn)rommer W B，Ward J M. 2000. A new subfamily of sucrose transporters，SUT4，with low affinity/high capacity locali-zed in enucleate sieve elements of plants[J]. The Plant Cell，12（8）：1345-1355.

Xue G P，Mclntyre C L，Glassop D，Shorter R. 2008. Use of expression analysis to dissect alterations in carbohydrate metabolism in wheat leaves during drought stress[J]. Plant Molecular Biology，67（3）：197-214.

Yan N. 2013. Structural advances for the major facilitator superfamily（MFS） transporters[J]. Trends in Biochemical Sciences，38（3）：151-159.

Zanon L，F(xiàn)alchi R，Hackel A，Kühn C，Vizzotto G. 2015. Expression of peach sucrose transporters in heterologous systems points out their different physiological role[J]. Plant Sciene，238：262-272.

Zhao J F，Sun Z F，Zheng J，Guo X Y，Dong Z G，Huai J L，Gou M Y，He J G，Jin Y S，Wang J H，Wang G Y. 2009. Cloning and characterization of a novel CBL-interacting protein kinase from maize[J]. Plant Molecular Biology，69（6）：661-674.

（責(zé)任編輯 陳 燕）