許乙威+賈舉聞+簡鋒

【摘要】 目的 探討基因芯片在胃癌及腫瘤球細胞差異表達基因篩選中的應用價值。方法 在無菌條件下， 對人胃癌細胞HGC-27及其腫瘤球細胞進行體外培養(yǎng)， 對兩種細胞的總RNA進行提取， 并實施純化處理。對總RNA做雜交處理， 采用TreeViem及Cluster軟件分析及顯示所得熒光信號。結果 根據(jù)差異顯示性標準， 對照人胃癌細胞， 顯示腫瘤球細胞中， 有1746條差異表達基因。其中， 基因表達上調608個， 基因表達下調1138個， 且涉及方面較多， 包括腫瘤形成、信號傳導、細胞生長等。結論 人胃癌細胞HGC-27及其腫瘤球細胞具有一定基因表達差異， 基因芯片篩選價值較高， 且腫瘤形成在腫瘤球細胞變化中發(fā)揮著重要的作用， 需引起高度關注。

【關鍵詞】 基因芯片；胃癌細胞；腫瘤球細胞；基因表達

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.30.076

作為臨床上一種常見惡性腫瘤， 胃癌患病率較高。以往， 臨床上多采用手術、化療、放療、中藥等方法進行治療， 但病死率仍較高[1]。近年來， 基因芯片技術在胃癌的基礎研究領域得到廣泛應用， 能隨時獲取腫瘤細胞生長各期與腫瘤生長相關基因的表達模式， 可為治療胃癌提供新的思路[2]。本研究采用基因芯片技術， 對人胃癌細胞及其腫瘤球細胞的差異表達基因進行篩選， 從而尋找新的治療胃癌的途徑， 現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1. 1 材料 本研究所用材料包括購自中科院細胞庫的人胃癌細胞HGC-27；購自Gibco公司的胰蛋白酶；購自Sigma公司的hechst33342；購自Invitrogen公司的表皮生長因子、DMEM、DMEM/F12等。

1. 2 有血清培養(yǎng)液的培養(yǎng) 以100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素、含%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液， 將HGC-27于5%二氧化碳、37℃條件下進行培養(yǎng)， 及時對培養(yǎng)液進行更換， 消化傳代采用0.25%胰蛋白酶進行。

1. 3 無血清培養(yǎng)液的培養(yǎng) 以無血清、含100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素、20 ng/ml表皮生長因子的DMEM/F12培養(yǎng)液， 將HGC-27接種到低吸附塑料6孔板中， 在5%二氧化碳、37℃條件下進行培養(yǎng)， 對腫瘤球形成情況進行觀察， 每日增加200 μl新鮮培養(yǎng)液。

1. 4 提取總RNA 人胃癌細胞HGC-27及其腫瘤球細胞的總RNA提取采用Trizol試劑進行， 并做純化處理， RNA質量采用甲醛變性膠電泳進行檢測。

1. 5 基因表達譜芯片雜交 采用GeneChip IVT Eepress Kit進行， 嚴格按照說明書進行操作， 從而合成每個樣品的cRNA。將基因芯片與標記的cRNA進行雜交。

1. 6 收集與分析芯片圖像 對基因芯片實施洗滌與染色處理， 微陣列掃描采用基因芯片掃描儀3000進行， 對芯片圖像進行收集， 對數(shù)據(jù)進行讀取。樣品間基因轉錄差異分析采用校正后的原始數(shù)據(jù)完成。

2 結果

2. 1 腫瘤球培養(yǎng)及總RNA提取 在SSM培養(yǎng)液中， 細胞呈現(xiàn)均勻貼壁生長狀態(tài)。在SFM培養(yǎng)液中培養(yǎng)7 d， 細胞呈現(xiàn)致密腫瘤球狀態(tài)。實施甲醛凝膠電泳， HGC-27及腫瘤球細胞的RNA電泳條帶清晰， 提示總RNA完整無降解， 可實施芯片實驗。

2. 2 基因表達譜芯片雜交 將基因芯片與標記的cRNA進行雜交， 芯片上各位點信號強度采用掃描儀3000進行明確。而HGC-27細胞及腫瘤球細胞中各基因表達水平均能經由芯片上各位點信號強度進行反映。

2. 3 芯片圖像采集及數(shù)據(jù)分析 經由計算機對雜交點熒光信號強度進行定性、定量處理， 根據(jù)差異顯示性標準對照人胃癌細胞， 腫瘤球細胞中， 有1746條差異表達基因。其中， 基因表達上調608個， 基因表達下調1138個。而腫瘤球細胞中表達上調10倍以上的基因包括TDO2、GDF15、EGR1、DUSP6、ETV5、PHLDB2、MAFF、TRIB3、COL1A2、CREB5、TOX、EMP1、AKR1C3、ELK3、PROCR、LRRC4B、SHOX2等。腫瘤球細胞中表達下調10倍以上的基因包括TMEFF2、SFRP4、GRIK3、CHODL、CNR1、CNTN1、IGFBP5、EDNRA、AMBN、SEPP1、KBTBD10、DCT等。而且， 基因表達的變化涉及方面較多， 包括腫瘤形成、信號傳導、細胞生長等。

3 討論

現(xiàn)階段， 隨著人類基因組計劃的不斷深入， 研究重點逐步過渡到后基因組時代[3]。早在20世紀， 美國學者發(fā)現(xiàn)基因芯片， 認為芯片DNA與樣品cDNA結合被標記， 能對細胞所有基因進行描述， 且能對與某些生命現(xiàn)象相關的基因表達進行了解和掌握， 在基因調控研究中有著較高的應用價值[4]。此外， 基因芯片技術還能對生物樣本所有基因的表達水平進行檢測， 從而獲得基因組水平的基因表達譜數(shù)據(jù)[5]。經由分析這些數(shù)據(jù)， 能對基因功能及基因之間的相互作用進行了解和掌握[6]。

本研究采用基因芯片技術， 對人胃癌細胞及其腫瘤球細胞的差異表達基因進行篩選， 從而尋找新的治療胃癌的途徑。結果顯示， 根據(jù)差異顯示性標準， 對照人胃癌細胞， 腫瘤球細胞中， 基因表達上調608個， 基因表達下調1138個， 且涉及方面較多， 包括腫瘤形成、信號傳導、細胞生長等?？紤]到存在較多的差異基因， 故本研究僅重點對差異在10倍以上的基因進行分析。結果發(fā)現(xiàn)， GDF15、ETV5等與腫瘤形成及轉移相關的基因表達明顯上調。同時， TMEFF2、IGFBP5等可抑制腫瘤形成的基因表達明顯下降。結果表明， 在腫瘤形成過程中， 腫瘤球細胞變化發(fā)揮著重要的作用。這都能為臨床研究胃癌發(fā)病機制提供一定的參考價值， 有利于深入分析胃癌分子診斷標志、藥物作用靶標等， 臨床價值較高。

綜上所述， 人胃癌細胞HGC-27及其腫瘤球細胞具有一定基因表達差異， 基因芯片篩選價值較高， 腫瘤形成在腫瘤球細胞變化中發(fā)揮著重要的作用， 需引起高度關注。

參考文獻

[1] 時偉紅， 于岳寶， 李兆陽， 等. 基因芯片篩選胃癌及腫瘤球細胞差異表達基因. 現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學， 2012， 20（5）：905-908.

[2] Shi WH， Yu YB， Li ZY， et al. Screening for genes that are differentially-expressed between gastric cancer cells and gastric tumor sphere cells using the gene chip technique. Genetics & Molecular Research Gmr， 2015， 14（4）：14893-14899.

[3] Shi W， Yuebao YU， Zhaoyang LI， et al. Differential expression gene of human gastric cancer line HGC-27 cells and its tumor sphere cells screened by gene chip technique. Journal of Modern Oncology， 2012， 25（12）：1363-1365.

[4] 趙路， 楊娟， 于婧， 等. 食管鱗癌組織及周圍正常食管黏膜組織差異表達基因的篩選. 世界華人消化雜志， 2011， 19（22）： 2328-2333.

[5] 曹明楠， 崔俊， 李衛(wèi)東. 基因芯片技術在抗腫瘤藥物研究和腫瘤診斷中的應用. 中國藥理學與毒理學雜志， 2014， 28（6）：932-938.

[6] 王珊珊， 廖清船， 許靜， 等. 基因芯片技術在中藥腫瘤藥理研究中的應用. 中國藥房， 2011， 22（31）：2968-2970.

[收稿日期：2016-10-20]