周延清　張喻　李靜云　等

摘要：根據(jù)以前克隆的地黃RghBNG基因堿基序列，利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)特異引物，采用hiTAIL-PCR技術(shù)從懷地黃基因組DNA中擴(kuò)增出578 bp DNA片段。經(jīng)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，它與根癌土壤桿菌、土壤桿菌的纖維素合酶基因的同源性達(dá)81%～91%；它所含的453 bp的開(kāi)放閱讀框（ORF）編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列與根癌土壤桿菌、土壤桿菌、菜豆根瘤菌、豌豆根瘤菌纖維素合酶基因編碼蛋白質(zhì)氨基酸序列的同源性高達(dá)83%～99%，說(shuō)明蛋白質(zhì)可能具有纖維素合酶的結(jié)構(gòu)域。用hiTAIL-PCR技術(shù)克隆懷地黃纖維素合酶基因，為進(jìn)一步研究其分子作用機(jī)制和在地黃分子育種中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：懷地黃；纖維素合酶；hiTAIL-PCR技術(shù)；生物信息學(xué)分析

中圖分類號(hào)：S567.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）01-0021-03

收稿日期：2014-03-27

基金項(xiàng)目：河南省基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃（編號(hào)：092300410009）；河南省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（編號(hào)：14B180028）；國(guó)家大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃（編號(hào)：201310476102）；河南省高校科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)支持計(jì)劃（編號(hào)：13IRTSTHN009）。

作者簡(jiǎn)介：周延清（1963—），男，河南鄧州人，博士，教授，主要從事遺傳學(xué)教學(xué)與研究。E-mail：yqzhou@htu.cn。地黃（Rehmannia glutinosa Libosch）是玄參科（Scrophulariaceae）地黃屬（Rehmannia）多年生草本植物，共有6個(gè)種，廣泛分布于中國(guó)、韓國(guó)和日本等地[1]。地黃在河南、山東、山西、陜西等省廣泛分布，為我國(guó)大宗常用中藥材之一，傳統(tǒng)認(rèn)為懷慶地黃[稱為懷地黃（R. glutinosa f.hueichingensis）]質(zhì)量?jī)?yōu)良[2]。地黃塊根入藥，富含梓醇、糖類和苷類物質(zhì)、維生素、多種氨基酸、多種微量元素，具有防癌、抗癌、增強(qiáng)免疫力、延緩衰老、增強(qiáng)造血能力、降低血糖、防治糖尿病并發(fā)癥等功能[3]和重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[4]。在方劑中，地黃的使用量占了很大的比重，例如六味地黃丸、知柏地黃丸和杞菊地黃丸等。 在保健使用方面，已經(jīng)開(kāi)發(fā)出一些含有地黃成分的產(chǎn)品，如地黃精、地黃茶和地黃醋等[5]。國(guó)內(nèi)外關(guān)于地黃基因克隆、功能分析和表達(dá)模式研究已有報(bào)道。例如，用RT-PCR方法擴(kuò)增的地黃肌動(dòng)蛋白基因片段，可用作內(nèi)參基因[6]；通過(guò)RT-qPCR分析地黃中11個(gè)內(nèi)參基因的mRNA表達(dá)差異情況[7]；用SSH方法克隆地黃塊根中RgPR-10 基因，研究其在地黃根和莖以及原核表達(dá)情況[3，8]；利用Solexa測(cè)序技術(shù)、生物信息學(xué)和熒光定量 PCR 分析從正茬地黃和重茬地黃中鑒定出89個(gè)miRNAs，預(yù)測(cè)其中 7個(gè)新型 miRNAs的15個(gè)靶基因，在正茬地黃和重茬地黃之間構(gòu)建miRNAs 差異表達(dá)譜[4，9]；進(jìn)行地黃赤霉素、脫落酸和部分寡糖合成代謝關(guān)鍵酶基因以及擴(kuò)展蛋白基因RgExpA1的克隆與表達(dá)分析[10-11]；用 PCR 技術(shù)克隆懷地黃轉(zhuǎn)座酶基因[12]；此外，還進(jìn)行了懷地黃RgVP和RgKAT基因的克隆和時(shí)空表達(dá)分析[13]及懷地黃3-酮酯酰CoA-硫解酶基因的克隆、序列特征和時(shí)空表達(dá)分析[14]。但尚未見(jiàn)克隆地黃纖維素合酶基因的報(bào)道，纖維素合成酶是將纖維素水解成纖維二糖和葡萄糖的一組復(fù)雜酶系的總稱[15-16]。迄今為止，已有從毛竹[17]和苧麻[18]等植物中克隆纖維素合酶基因的報(bào)道。本研究根據(jù)以前克隆的地黃RghBNG基因堿基序列[19]，利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)特異引物，采用hiTAIL-PCR技術(shù)[20]克隆懷地黃纖維素合酶基因序列，用生物信息學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行分析，為進(jìn)一步研究其分子作用機(jī)制和在地黃分子育種中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

懷地黃85-5種植于河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院試驗(yàn)田，取其新鮮塊根用于提取DNA。

大腸桿菌DH5α菌株由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存，DNA凝膠回收試劑盒（上海生工服務(wù)有限公司）、Taq DNA聚合酶和DNA Marker（北京全式金生物技術(shù)有限公司）及克隆載體pMD19-T （TaKaRa 公司），引物合成和基因測(cè)序分別由北京華大基因有限公司和上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

1.2方法

1.2.1懷地黃基因組DNA的提取用CTAB法提取懷地黃基因組DNA，用紫外分析法和瓊脂糖凝膠電泳方法檢測(cè)基因組DNA的濃度、大小和純度。

1.2.2引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)筆者所在實(shí)驗(yàn)室前期研究克隆的地黃RghBNG基因堿基序列（登錄號(hào)為JX290370），利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)3條下游特異引物，上游非特異性引物序列參見(jiàn)文獻(xiàn)[20]（表1）。

1.2.3hiTAIL-PCR反應(yīng)及檢測(cè)根據(jù)Liu等的hiTAIL-PCR程序[20]略作改進(jìn)。以懷地黃基因組DNA為模板，RH1分別與LAD1～LAD4配對(duì)，進(jìn)行第1輪PCR反應(yīng)，其反應(yīng)液組分見(jiàn)表2，程序如下：93 ℃熱啟動(dòng)2 min；95 ℃預(yù)變性 1 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸3 min，10個(gè)

表1所用引物名稱及其序列

引物名稱引物序列（5′→

反應(yīng)成分用量（μL）第1輪第2輪第3輪 模板1.01.01.0dNTP預(yù)混物（各2.5 mmol/L）4.0 4.02.010×LA PCR緩沖液（加入Mg2+） 2.02.5 2.5TaKaRa公司的5 U/μL LA Taq 0.50.6 0.5100 pmol/μL上游引物1.0 0.30.610 pmol/μL下游引物 0.3 0.3 0.6水 11.2 16.3 17.8

1.2.4基因片段的克隆、測(cè)序按照TaKaRa公司的載體pMD19-T說(shuō)明書，將回收的目的片段進(jìn)行連接反應(yīng)，連接液為5 μL，載體為0.5 μL，回收DNA的量為4.5 μL，共10 μL，16 ℃連接過(guò)夜。取10 μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，取細(xì)胞懸浮液涂布于含氨芐青霉素Amp的LB平板上，37 ℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜，挑取菌落，進(jìn)行PCR檢測(cè)。將檢測(cè)為陽(yáng)性的克隆送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

1.2.5基因片段的生物信息學(xué)分析在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（NCBI）網(wǎng)站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）上運(yùn)用BLAST軟件進(jìn)行目的基因的同源性搜索，并進(jìn)行同源性比較。用MEGA 5的Neighbor-Joining 法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)[15]。通過(guò) NCBI 網(wǎng)站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）預(yù)測(cè)氨基酸的保守域[14]。

2結(jié)果與分析

2.1地黃基因組DNA片段的擴(kuò)增與電泳

用CTAB法提取懷地黃基因組DNA，經(jīng)紫外分光度法和瓊脂糖凝膠電泳方法分析符合后續(xù)試驗(yàn)要求后，用作模板，進(jìn)行hiTAIL-PCR，共擴(kuò)增出3個(gè)條帶（圖1）。

2.2地黃基因組DNA片段的回收、克隆與測(cè)序

用試劑盒回收?qǐng)D1中B片段，克隆至載體pMD19-T，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示B片段長(zhǎng)578 bp（圖1）。

2.3地黃類纖維素合酶基因的ORF及其編碼蛋白質(zhì)氨基酸序列分析

利用 ORF Finder 分析B片段測(cè)序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)其含有453 bp 開(kāi)放閱讀框，編碼151個(gè)氨基酸（圖2）。預(yù)測(cè)其編碼蛋白質(zhì)分子量約為18 ku，等電點(diǎn)為9.00，摩爾消光系數(shù)為34 045，不穩(wěn)定系數(shù)為49.51，為略堿性的不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。

2.4多序列比對(duì)與系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

將測(cè)序所得的氨基酸序列在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)與已知10個(gè)物種的纖維素合酶基因及其編碼的氨基酸序列高度同源（表3）。用軟件MEGA 5構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖3）表明，其與根癌土壤桿菌和土壤桿菌的親緣關(guān)系最近。

2.5氨基酸保守域的預(yù)測(cè)

在NCBI 網(wǎng)站預(yù)測(cè)該氨基酸的保守域，發(fā)現(xiàn)其含有纖維表3地黃與其他物種纖維素合酶的同源性比較

物種GenBank登錄號(hào)氨基酸同源性

（%）核苷酸同源性

（%）根癌土壤桿菌（Agrobacterium tumefaciens）WP_003506371.19991土壤桿菌（Agrobacterium sp.）WP_020011862.19991菜豆根瘤菌（Rhizobium phaseoli）WP_016734164.188—豌豆根瘤菌（R. leguminosarum）WP_003578482.188—三葉草根瘤菌（R. leguminosarum bv.trifolii） YP_002975124.187—費(fèi)氏中華根瘤菌（Sinorhizobium fredii）YP_005192181.186 —苜蓿中華根瘤菌（S. meliloti）YP_007193525.185 —中華根瘤菌（S. medicae）WP_018010495.184 —

素合酶催化亞單位（UDP-forming）的保守域（圖4）。

3結(jié)論與討論

本研究根據(jù)以前克隆的地黃RghBNG基因堿基序列[19]，利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)特異引物，采用hiTAIL-PCR技術(shù)從懷地黃基因組DNA中擴(kuò)增出A、B、C 等3條帶，分別對(duì)其進(jìn)行回收、克隆、測(cè)序和生物信息學(xué)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，B帶大小為578 bp，含有453 bp的開(kāi)放閱讀框，編碼151個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)（另外2條帶A和C的分析結(jié)果在此未呈現(xiàn)）。它與根癌土壤桿菌、土壤桿菌的纖維素合酶基因的同源性達(dá)81%～91%，其編碼的氨基酸序列與根癌土壤桿菌、土壤桿菌、菜豆根瘤菌、豌豆根瘤菌等纖維素合酶基因編

碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列同源性達(dá)83%～99%，而且其編碼的蛋白質(zhì)具有纖維素合成酶的結(jié)構(gòu)域。本研究首次從懷地黃中分離克隆了纖維素合酶基因，為研究其在地黃生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的作用和地黃基因工程育種奠定了基礎(chǔ)。該懷地黃DNA片段與其他植物纖維素合酶基因不同源，但與根瘤菌纖維素合成酶基因同源，可能是因?yàn)榈攸S生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中地黃塊根與其根際根瘤菌共生而發(fā)生后者基因組DNA片段轉(zhuǎn)移并整合到地黃基因組DNA中。但是，其具體形成原因有待進(jìn)一步深入研究。

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