楊悅　張興梅　孫壯等

摘要： 為探討轉(zhuǎn) ICE1 基因水稻耐冷性與膜脂過(guò)氧化和抗氧化酶活性的關(guān)系，以轉(zhuǎn) ICE1 基因和非轉(zhuǎn)基因水稻墾鑒稻10號(hào)為材料，研究4 ℃低溫脅迫對(duì)水稻幼苗膜脂過(guò)氧化程度和抗氧化酶活性的影響。結(jié)果表明，低溫脅迫期間，轉(zhuǎn) ICE1 基因水稻的相對(duì)電導(dǎo)率及丙二醛（MDA）含量均顯著低于非轉(zhuǎn)基因水稻，說(shuō)明 ICE1 基因的過(guò)量表達(dá)減輕了膜脂過(guò)氧化程度，保護(hù)了細(xì)胞膜系統(tǒng)；隨著冷處理時(shí)間的延長(zhǎng)，超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）和過(guò)氧化氫酶（CAT）活性均呈現(xiàn)先增強(qiáng)后減弱的趨勢(shì)，轉(zhuǎn) ICE1 基因水稻的SOD、CAT活性均強(qiáng)于非轉(zhuǎn)基因水稻，但POD活性弱于非轉(zhuǎn)基因水稻。說(shuō)明 ICE1 基因的過(guò)量表達(dá)可能通過(guò)減輕膜脂過(guò)氧化程度與調(diào)整抗氧化酶活性來(lái)增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因水稻的耐冷性。

關(guān)鍵詞： 水稻； ICE1 基因；低溫脅迫；耐冷性；膜質(zhì)過(guò)氧化；抗氧化酶活性

中圖分類號(hào)：Q943.2；S511.034 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2015）08-0071-03

黑龍江省地處高寒地區(qū)，水稻（Oryza sativa L.）因受到低溫冷害會(huì)導(dǎo)致減產(chǎn)甚至絕收，因此，冷害極大地限制了黑龍江省水稻產(chǎn)量的進(jìn)一步提高。水稻整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中都存在低溫冷害的可能，低溫可導(dǎo)致水稻生長(zhǎng)緩慢、發(fā)育不良，甚至停滯生長(zhǎng)；特別在水稻揚(yáng)花期遭遇低溫容易導(dǎo)致花粉敗育、受精不良、影響結(jié)實(shí)。在黑龍江省有限的積溫條件下，低溫會(huì)對(duì)水稻產(chǎn)量及其品質(zhì)造成極大地不良影響。 ICE1 （inducer of CBF expression 1）基因是從擬南芥中克隆到的、能調(diào)節(jié)植株耐冷性的轉(zhuǎn)錄因子，在低溫條件下可以活化ICE1蛋白，活化了的ICE1蛋白能激活 CBF3 基因表達(dá)，CBF3蛋白通過(guò)調(diào)控 CBF3 基因下游低溫應(yīng)答基因的表達(dá)，從而增強(qiáng)擬南芥的抗冷性 [1]。前期從擬南芥中克隆到了 ICE1 基因，并將其與35S 啟動(dòng)子連接，構(gòu)建了植物表達(dá)載體pCAMBIA1300-35S- ICE1 ，導(dǎo)入墾鑒稻10號(hào)水稻植株中，從而獲得轉(zhuǎn) ICE1 基因水稻的再生植株，并進(jìn)行繼代培養(yǎng) [2]。本研究對(duì)轉(zhuǎn) ICE1 基因水稻耐冷性與膜脂過(guò)氧化和抗氧化酶活性的關(guān)系進(jìn)行研究，以揭示轉(zhuǎn) ICE1 基因水稻膜脂特性及抗氧化酶活性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究采用轉(zhuǎn) ICE1 基因水稻墾鑒稻10號(hào)第4代T4-8和T4-9株系及未轉(zhuǎn)基因水稻品種墾鑒稻10號(hào)（CK）為試驗(yàn)材料，轉(zhuǎn) ICE1 基因水稻株系來(lái)自黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，該實(shí)驗(yàn)室利用PCR檢測(cè)目的基因的方法對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻的遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行檢測(cè)，轉(zhuǎn)基因水稻材料的 ICE1 基因穩(wěn)定遺傳 [2]。

1.2 試驗(yàn)方法

采用轉(zhuǎn) ICE1 基因T4-8株系、T4-9株系與CK水稻種子，在25 ℃恒溫條件下浸種，播種在小培養(yǎng)缽中，每個(gè)品種（系）18個(gè)重復(fù)，共計(jì)54個(gè)處理。將培養(yǎng)缽置于光照培養(yǎng)箱中，[JP3]培養(yǎng)條件為溫度25 ℃，光照16 h/d，照度250 μmol/（m2·s）， 相對(duì)濕度80%，培養(yǎng)期間澆灌Hoagland營(yíng)養(yǎng)液。水稻幼苗培養(yǎng)4周后，放置4 ℃條件下進(jìn)行冷處理，分別在0、2、4、6、8、10 d后停止冷處理，測(cè)定水稻植株中相對(duì)電導(dǎo)率、丙二醛（MDA）含量及超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）的活性。冷處理10 d非轉(zhuǎn)基因水稻幼苗外觀表現(xiàn)萎蔫，轉(zhuǎn)基因水稻變化不大 [2]。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目

水稻植株電導(dǎo)率的測(cè)定采用郝建軍等的方法 [3]；水稻植株丙二醛（MDA）含量的測(cè)定參照王學(xué)奎等的方法 [4]；水稻植株酶活性的測(cè)定 [4]：超氧化物歧化酶（SOD） 活性的測(cè)定采用氮藍(lán)四唑法（NBT），過(guò)氧化物酶（POD）活性的測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法，過(guò)氧化氫酶（CAT）活性的測(cè)定采用紫外吸收法。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 Excel 和 SPSS 13.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫下轉(zhuǎn) ICE1 基因水稻電導(dǎo)率的變化

植物組織外滲液電導(dǎo)率的變化能夠反映出細(xì)胞質(zhì)膜的傷害程度和植物抗逆性的強(qiáng)弱。低溫脅迫下，細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能會(huì)受到傷害，導(dǎo)致膜透性增大，電解質(zhì)外滲，電導(dǎo)率增大 [6]。本研究水稻幼苗經(jīng)低溫處理后的相對(duì)電導(dǎo)率結(jié)果如圖1所示，低溫處理前（0 d），轉(zhuǎn) ICE1 基因水稻的相對(duì)電導(dǎo)率略低于CK，但差異不顯著。低溫處理后，轉(zhuǎn)基因水稻與CK的相對(duì)電導(dǎo)率均增加，且隨著低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)呈直線增加的趨勢(shì)，相對(duì)電導(dǎo)率與處理時(shí)間的關(guān)系擬合的直線方程分別為y=5.072+7.674x，r=0.990（CK）；y=6.570+3.536x，r=0.989（T4-8）；y=5.563+3.609x，r=0.989（T4-9），CK增幅較大，T4-8、T4-9增幅相對(duì)較小。低溫脅迫2 d，CK水稻相對(duì)電導(dǎo)率為22.51%，分別比T4-8、T4-9水稻高994、11.08百分點(diǎn)；低溫脅迫10 d，CK水稻相對(duì)電導(dǎo)率達(dá)最大，為86.30%，[JP3]分別比T4-8、T4-9水稻高42.00、42.60百分點(diǎn)。方差分析結(jié)果表明，在低溫脅迫期間，轉(zhuǎn) ICE1 基因水稻與CK之間的相對(duì)電導(dǎo)率差異顯著，而T4-8與T4-9之間差異不顯著。

低溫脅迫后，轉(zhuǎn) ICE1 基因和非轉(zhuǎn)基因水稻的電導(dǎo)率變化規(guī)律相同，其相對(duì)電導(dǎo)率均是隨著低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)趨于增大，但分析數(shù)據(jù)結(jié)果表明，轉(zhuǎn) ICE1 基因水稻的相對(duì)電導(dǎo)率顯著低于CK，說(shuō)明低溫脅迫下 ICE1 基因的導(dǎo)入保護(hù)了細(xì)胞膜，減少了細(xì)胞液的外滲，提高了水稻的耐冷性，使植株受傷害的程度較輕。由此可見，低溫脅迫下 ICE1 基因具有增強(qiáng)水稻對(duì)低溫冷害的抗御作用。

2.2 低溫脅迫下轉(zhuǎn) ICE1 基因水稻丙二醛含量的變化

植物在逆境條件下往往發(fā)生膜脂過(guò)氧化作用，MDA是膜脂過(guò)氧化的產(chǎn)物之一，其含量可以反映細(xì)胞膜脂過(guò)氧化程度及細(xì)胞遭受傷害的程度 [7]。本試驗(yàn)水稻幼苗經(jīng)低溫處理后的MDA含量如圖2所示，低溫處理前（0 d），轉(zhuǎn) ICE1 基因水稻的MDA含量與CK相近。在低溫脅迫下，CK水稻中MDA含量隨冷處理時(shí)間的延長(zhǎng)呈線性增加的趨勢(shì)，MDA含量與處理時(shí)間的關(guān)系可以擬合為直線方程：y=3.259+1.350x，r=0.980；低溫處理2 d，轉(zhuǎn)基因水稻中MDA含量略有增加，其后基本處于相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)。由圖2可以看出，低溫脅迫2 d，CK水稻中的MDA含量快速增加，與脅迫前相比提高了71.9%；而T4-8、T4-9水稻MDA含量與脅迫前相比分別提高291%、30.2%。低溫脅迫10 d，CK水稻MDA含量最高達(dá)1531 μmol/g；而T4-8、T4-9水稻MDA含量分別為4.53、 4.63 μmol/g。低溫處理前，CK與T4-8、T4-9水稻MDA含量差異不顯著；低溫處理后，CK與T4-8、T4-9水稻差異顯著，T4-8、T4-9的MDA含量相差不大。由此可見，外源基因 ICE1 提高了水稻細(xì)胞膜脂的抗氧化能力。

一些試驗(yàn)結(jié)果證明 [8-10]，低溫會(huì)使植物幼苗的MDA含量增加，從而促進(jìn)膜脂過(guò)氧化過(guò)程，導(dǎo)致膜傷害。此外，MDA本身也是具有細(xì)胞毒性的物質(zhì)，它與細(xì)胞體內(nèi)的酶結(jié)合、交聯(lián)后[CM（25]，會(huì)使之失去活性，從而進(jìn)一步破壞膜結(jié)構(gòu)。本試驗(yàn)中轉(zhuǎn)ICE1 基因水稻在低溫脅迫下MDA含量顯著低于CK，表明低溫脅迫下外源基因 ICE1 可能對(duì)膜保護(hù)系統(tǒng)發(fā)揮作用。

2.3 低溫脅迫對(duì)轉(zhuǎn) ICE1 基因水稻SOD的影響

SOD是生物體內(nèi)特異清除超氧陰離子自由基的酶，能催化超氧陰離子發(fā)生歧化反應(yīng)，清除植物組織和細(xì)胞內(nèi)的超氧自由基，減緩氧自由基對(duì)細(xì)胞膜的損傷，減輕活性氧對(duì)植物的危害。圖3為低溫脅迫下轉(zhuǎn) ICE1 基因與非轉(zhuǎn)基因水稻SOD活性的變化。在低溫脅迫期間，水稻中SOD活性呈規(guī)律性變化，低溫脅迫初期，水稻中的SOD活性增強(qiáng)，低溫脅迫2 d 3個(gè)品種（系）水稻中的SOD活性均達(dá)到最大值，分別為1163、17.55、17.61 U/mg，其后CK和轉(zhuǎn)基因水稻的SOD活性均呈下降趨勢(shì)。低溫脅迫10 d，CK水稻SOD活性減至368 U/mg；而T4-8、T4-9水稻中的SOD活性與脅迫前相近。在整個(gè)低溫脅迫期間，轉(zhuǎn) ICE1 基因水稻SOD活性均強(qiáng)于CK，且差異顯著。表明在低溫脅迫條件下， ICE1 基因的過(guò)量表達(dá)有助于增強(qiáng)SOD活性，增強(qiáng)水稻清除超氧自由基的能力，保護(hù)細(xì)胞膜，從而提高水稻的耐冷性。

2.4 低溫脅迫對(duì)轉(zhuǎn) ICE1 基因水稻POD的影響

由圖4可知，低溫處理前，轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因水稻的POD活性差異不大，低溫處理后，非轉(zhuǎn)基因水稻的POD活性顯著增強(qiáng)，低溫脅迫 2 d時(shí)達(dá)到最大值，為33.08 U/（mg·min），其后POD活性直線減弱，低溫脅迫 10 d時(shí)減至 19.86 U/（mg·min）。[JP3]T4-8和T4-9水稻的POD活性在低溫處理后雖然有所增強(qiáng)，但明顯弱于CK，在低溫脅迫 4 d時(shí)達(dá)到最大值，為19.41、19.53 U/（mg·min）， 其后POD活性處于相對(duì)穩(wěn)定水平，低溫脅迫 10 d時(shí)T4-8和T4-9水稻POD活性分別減至14.84、15.16 U/（mg·min）。方差分析結(jié)果表明，低溫處理后T4-8和T4-9水稻POD活性均顯著弱于非轉(zhuǎn)基因水稻，但T4-8和T4-9之間差異不顯著。由此推測(cè)，外源基因可能插入到影響POD基因表達(dá)的相關(guān)序列中， ICE1 基因可能削弱了原水稻植株中POD基因的表達(dá)，從而使轉(zhuǎn)基因

水稻的POD活性低于非轉(zhuǎn)基因水稻。

2.5 低溫脅迫對(duì)轉(zhuǎn) ICE1 基因水稻CAT的影響

CAT是植物體內(nèi)分解過(guò)氧化物、消除其對(duì)植物的危害、防止植物衰老的抗性酶，它可以促使H2O2分解為O2和H2O，防御細(xì)胞遭受H2O2的毒害。通過(guò)檢測(cè)CAT活性可以看出， ICE1 基因的表達(dá)是否提高了水稻抵御過(guò)氧化氫的能力。由圖5可知，隨著低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，水稻中的CAT活性表現(xiàn)為先增強(qiáng)后逐漸減弱，并且轉(zhuǎn)基因水稻T4-8和T4-9的CAT活性均強(qiáng)于CK，其差異顯著，而T4-8和T4-9之間差異不顯著。低溫脅迫前，轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因水稻體內(nèi)CAT活性均相對(duì)較弱，但T4-8、T4-9水稻CAT活性強(qiáng)于CK，分別比CK強(qiáng)14.88%、16.72%。低溫脅迫2 d，CK水稻CAT活性達(dá)到最大值，為13.35 U/（mg·min），但弱于同期T4-8和T4-9水稻，其后CK水稻的CAT活性持續(xù)減弱，低溫脅迫 10 d時(shí)減至最低值，為9.92 U/（mg·min）。T4-8、 T4-9水稻 CAT活性在低溫脅迫 4 d時(shí)達(dá)到最大值，較同期CK強(qiáng)4815%、49.72%，其后T4-8、T4-9水稻CAT活性緩慢減弱，低溫脅迫 10 d時(shí)分別減為11.8、12.2 U/（mg·min）， 但分別比同期CK強(qiáng)1.88、2.28 U/（mg·min）。以上結(jié)果表明， ICE1 基因過(guò)量表達(dá)能提高水稻體內(nèi)的CAT活性，或促進(jìn)CAT的合成，從而提高水稻清除H2O2的能力。

3 結(jié)論與討論

植物體自身具有復(fù)雜的抗冷防御機(jī)制，在逆境條件下可以開啟多個(gè)防御系統(tǒng)。1個(gè)基因可以調(diào)控多個(gè)防御應(yīng)答機(jī)制，而1個(gè)應(yīng)答機(jī)制也受多個(gè)基因的調(diào)控。在植物體內(nèi) ICE1 作為上游轉(zhuǎn)錄因子，可能調(diào)控多個(gè)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，參與到耐冷機(jī)制中，從而使植株獲得較高的耐冷性 [11]。

應(yīng)用組成型啟動(dòng)子CaMV35S與 ICE1 基因構(gòu)建植物表達(dá)載體， ICE1 基因可以在轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)組成型表達(dá)。由試驗(yàn)結(jié)果可知，常溫下轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因水稻植株在表型上沒有表現(xiàn)出明顯的差異，兩者抗氧化酶活性差異不大。由此可見，在正常生長(zhǎng)條件下，過(guò)量表達(dá) ICE1 基因?qū)λ局仓甑纳L(zhǎng)及生理指標(biāo)影響不大。常溫下可能 ICE1 基因表達(dá)產(chǎn)物不起作用或作用較弱，因此，過(guò)量表達(dá) ICE1 基因沒有產(chǎn)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)，水稻植株的表型和體內(nèi)生理指標(biāo)沒有表現(xiàn)出明顯的差異。低溫脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因水稻抗冷性增強(qiáng)，主要表現(xiàn)為轉(zhuǎn) ICE1 基因水稻的相對(duì)電導(dǎo)率遠(yuǎn)低于非轉(zhuǎn)基因水稻；低溫脅迫期間轉(zhuǎn)基因水稻MDA含量變化不大，且顯著低于非轉(zhuǎn)基因水稻，說(shuō)明 ICE1 基因的過(guò)量表達(dá)減輕了膜脂過(guò)氧化程度，抑制了MDA的積累，保護(hù)了細(xì)胞膜系統(tǒng)，減少了細(xì)胞內(nèi)容物的外滲。SOD、POD和CAT是膜保護(hù)系統(tǒng)重要的3種酶，具有清除植物組織和細(xì)胞內(nèi)的自由基，使植物體內(nèi)自由基維持在一個(gè)較低水平，減緩自由基對(duì)細(xì)胞膜傷害的作用 [12]。本研究結(jié)果表明，低溫脅迫期間，水稻中的SOD、POD、CAT活性表現(xiàn)為先增強(qiáng)后減弱，說(shuō)明低溫脅迫初期水稻啟動(dòng)了體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)，抗氧化酶活性增強(qiáng)，清除自由基能力提高了；隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，抗氧化酶活性減弱，可能是因?yàn)殡S著低溫脅迫的加劇，自由基產(chǎn)生量增加，對(duì)抗氧化酶造成傷害，抗氧化酶活性減弱，這又會(huì)加重自由基對(duì)植物細(xì)胞和組織的傷害。轉(zhuǎn)基因水稻SOD、CAT活性均高于非轉(zhuǎn)基因水稻，酶活性差異顯著，在低溫處理后期表現(xiàn)更為突出，說(shuō)明在低溫脅迫條件下， ICE1 基因過(guò)量表達(dá)并發(fā)揮了作用，通過(guò)提高抗氧化酶活性來(lái)提高清除自由基的能力，從而減輕自由基對(duì)植物細(xì)胞和組織的傷害。 ICE1 基因可能是通過(guò)一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)作用于抗氧化酶，從而維持植物較高的抗氧化酶活性，有利于細(xì)胞的正常代謝，最終表現(xiàn)出轉(zhuǎn)基因水稻耐冷性增強(qiáng)。

本研究中轉(zhuǎn)基因水稻POD活性的變化趨勢(shì)與SOD、CAT不同，雖然低溫脅迫期間POD活性緩慢減弱，但低溫脅迫后酶活性低于非轉(zhuǎn)基因水稻。這暗示著外源基因 ICE1 的轉(zhuǎn)入和過(guò)量表達(dá)對(duì)過(guò)氧化物酶活性產(chǎn)生了一定的影響。 ICE1 基因的轉(zhuǎn)入可能插入到影響POD基因表達(dá)的序列內(nèi)，影響了POD的表達(dá)，或者 ICE1 自身表達(dá)產(chǎn)物對(duì)POD活性有作用，從而使轉(zhuǎn)基因水稻的POD活性弱于非轉(zhuǎn)基因水稻；另外，也有可能與CAT活性有關(guān)，CAT和POD同為清除H2O2的主要酶類，CAT活性的增強(qiáng)影響了POD活性，CAT對(duì)低溫脅迫表現(xiàn)敏感而POD表現(xiàn)不敏感?？傮w上看，POD的不敏感并沒有影響轉(zhuǎn)基因植株整體的耐冷性，低溫脅迫條件下轉(zhuǎn) ICE1 基因水稻的耐冷性仍高于非轉(zhuǎn)基因水稻。

綜上所述，盡管在低溫脅迫條件下轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因水稻各種抗氧化酶活性的變化存在一定的差異，但轉(zhuǎn)基因水稻整體表現(xiàn)出了明顯的耐冷性，本研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn) ICE1 基因水稻抗膜質(zhì)過(guò)氧化能力高于非轉(zhuǎn)基因水稻。本試驗(yàn)中轉(zhuǎn) ICE1 基因水稻膜脂過(guò)氧化酶和抗氧化酶活性方面的研究與前人的研究結(jié)果 [13]基本一致。

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