王志紅 孔德鈞 陳麗莉 吳春 陳浩 楊志曉 韋克蘇 林英超

摘要：【目的】研究低氮下外源海藻糖對煙草幼苗葉綠素代謝與葉綠體發(fā)育的影響，以期揭示海藻糖調(diào)控低氮下植物氮素代謝的作用機制，為提高植物氮素利用效率提供參考?！痉椒ā坎捎门柙苑ū容^外源海藻糖對低氮處理和正常氮素水平（對照）煙草幼苗葉片葉綠素酶活性、葉綠素合成前體物質(zhì)含量、葉綠素合成關(guān)鍵酶活性及葉綠體結(jié)構(gòu)的影響?！窘Y(jié)果】施加外源海藻糖對低氮下煙草幼苗葉片葉綠素酶活性無顯著影響（P>0.05），但可增加葉綠素合成前體物質(zhì)5-氨基酮戊酸（ALA）、膽色素原（PBG）、尿卟啉原（URO）、原卟啉（Proto）、鎂原卟啉（Mg-Proto）和原葉綠素酸酯（Pchl）含量，提高葉綠素合成途徑中關(guān)鍵催化酶5-氨基酮戊酸脫水酶（ALAD）和尿卟啉原Ⅲ合成酶（UROS）活性。低氮處理后葉綠體結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，膜系統(tǒng)全部解體，但外源施加海藻糖可改善葉肉細(xì)胞葉綠體的完整性?！窘Y(jié)論】在低氮環(huán)境下施加外源海藻糖能提高烤煙幼苗的葉綠素含量，其原因不在于海藻糖可抑制葉綠素的降解，而在于海藻糖能促進(jìn)葉綠素的合成并維持葉綠體結(jié)構(gòu)的完整性。

關(guān)鍵詞： 海藻糖;氮素;煙草;葉綠素;葉綠體

中圖分類號： S572.01? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）06-1191-06

Abstract：【Objective】This study was conducted to analyze the effects of exogenous trehalose on tobacco seedlings chlorophyll metabolism and chloroplast development under low nitrogen condition，to reveal the underlying mechanisms that trehalose regulated nitrogen metabolism under low nitrogen condition，and to provide reference for improving plants nitrogen use efficiency. 【Method】Effects of exogenous trehalose on chlorophyllase activity，precursor substance of chlrophyll biosynthesis， chlorophyllase biosynthesis core enzyme activity and chloroplast structure of seedlings were investiga-ted with a pot experiment simulating low nitrogen condition（treatment） and optimal condition（control）. 【Result】There was no significant effects on chlorophyllase activity when exogenous trehalose was applied to tobacco seedlings under low nitrogen condition（P>0.05），however，contents of precursor substances of chlorophyll biosynthesis including 5-aminolevulinic acid（ALA），porphobilinogen（PBG），urogen（URO），protoporphyrin（Proto），Mg-protoporphyrin（Mg-Proto） and protochlorophyllide（Pchl） were increased，and activities of key enzymes of chlorophyll biosynthesis such as 5-aminolevelinate dehydratase（ALAD） and uroporporphyrinogn Ⅲ synthase（UROS） were enhanced. The structure and membrane system of chloroplast was destroyed seriously after long time low nitrogen treatment. Applying of exogenous trehalose improved the integrity of mesophyll cell. 【Conclusion】Instead of inhibiting chlorophyll degradation，the increased chlorophyll content in exogenous trehalose applied seedlings is due to its increased chlorophyll biosynthesis and the integrity of chloroplast under low nitrogen condition.

Key words： trehalose; nitrogen; tobacco; chlorophyll; chloroplast

收稿日期：2019-01-29

基金項目：貴州省科技廳科技項目（黔科合基礎(chǔ)〔2015〕2099，〔2016〕1097）;中國煙草總公司貴州省公司科技項目（201801）;貴州省煙草科學(xué)研究院科技項目（GZYKS2018-02）

作者簡介：*為通訊作者，林英超（1985-），博士，副研究員，主要從事煙草遺傳育種研究工作，E-mail： linyingchao@outlook.com。王志紅（1983-），主要從事煙草遺傳育種研究工作，E-mail：491569877@qq.com

0 引言

【研究意義】氮素參與植物的許多代謝過程，其供應(yīng)量是影響植物生長速率、形態(tài)建成及養(yǎng)分在體內(nèi)運輸和分配等的重要因素（Hortensteiner and Fel-ler，2002）。當(dāng)前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)活動中不合理的氮肥投入導(dǎo)致作物氮素利用率下降、土壤氮素殘余過多，在造成資源浪費和經(jīng)濟(jì)損失的同時，還引發(fā)了多種環(huán)境問題（姬景紅等，2017;周麗平等，2018）。海藻糖是由兩分子葡萄糖通過α，α-1，1糖苷鍵連接而成的化學(xué)性質(zhì)極為穩(wěn)定的非還原性雙糖，廣泛存在于細(xì)菌、真菌以及無脊椎動物中，對多種生物活性物質(zhì)具有非特異性保護(hù)作用，在調(diào)控植物營養(yǎng)缺乏、干旱等逆境脅迫反應(yīng)中具有重要作用（Paul et al.，2008）。海藻糖可能是調(diào)節(jié)植物基因表達(dá)和生長發(fā)育的重要信號因子。因此，明確海藻糖對植物氮素代謝的調(diào)控作用及其作用機制，對提高植物氮素利用率具有重要的實踐意義。【前人研究進(jìn)展】海藻糖在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)合成，影響葉綠體內(nèi)淀粉的合成、脅迫環(huán)境下葉綠體的生物學(xué)功能及光合作用結(jié)構(gòu)的發(fā)育（Kolbe et al.，2005;Lunn et al.，2006）;擬南芥的一些海藻糖-6-磷酸磷酸酶（TPPs）定位于葉綠體內(nèi)，而T6P轉(zhuǎn)運蛋白橫跨葉綠體膜，證明海藻糖與葉綠體及其內(nèi)部光合色素代謝及功能等存在密切關(guān)系（Fragoso et al.，2009）。Garcia等（1997）研究表明，較高濃度的外源海藻糖可有效緩解鹽脅迫導(dǎo)致的葉綠素含量降低。Pellny等（2004）研究表明，在煙草植株中過量表達(dá)海藻糖合成基因雖導(dǎo)致其植株發(fā)育不良、葉片較小且顏色發(fā)暗，但可提高葉片的光合作用能力，延緩葉片衰老。Lin等（2017）發(fā)現(xiàn)海藻糖能提高氮素不足環(huán)境下煙草幼苗葉片的葉綠素含量和光合作用速率?？梢?，海藻糖對葉片發(fā)育、葉綠體結(jié)構(gòu)，特別是光合色素等植物光合系統(tǒng)的發(fā)育具有重要影響（Wingler and Paul，2013;Yadav et al.，2014;Figueroa and Lunn，2016）?！颈狙芯壳腥朦c】目前，針對低氮下海藻糖對植物葉綠素代謝的調(diào)控活動，以及對葉肉細(xì)胞葉綠體發(fā)育的影響尚無研究報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以煙草幼苗為試驗材料，采用盆栽法，探討外源海藻糖對低氮培養(yǎng)條件下葉綠素合成前體物質(zhì)、葉綠素降解及葉綠體結(jié)構(gòu)的影響，以期揭示海藻糖調(diào)控低氮下植物氮素代謝的作用機制，為提高植物氮素利用效率提供參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試材料為烤煙品種K326，種子由貴州省煙草科學(xué)研究院提供。

1. 2 試驗方法

試驗設(shè)4個處理，分別為：T1，對照組;T2，對照+海藻糖組;T3，低氮組;T4，低氮+海藻糖組。

煙草幼苗采用常規(guī)育苗方法，播種30 d后選取生長一致的幼苗移栽到以珍珠巖為培養(yǎng)基質(zhì)的培養(yǎng)盆（口徑×低徑×高度=12.0 cm×8.8 cm×10.8 cm）中，并隨機分成以上4組，每組15株，分別澆灌不同的營養(yǎng)液。參照Kavanová等（2008）的研究結(jié)果，霍格蘭營養(yǎng)液根據(jù)NO3-水平分為1.0 mmol/L NO3-（低氮組）和7.5 mmol/L NO3-（對照組，正常氮素供應(yīng)）。營養(yǎng)液的其他成分組成為：對照組含2.5 mmol/L Ca（NO3）2、2.5 mmol/L KNO3、0.4 mmol/L KCl和0.4 mmol/L CaCl2;低氮組含1.0 mmol/L KNO3、0.7 mmol/L K2SO4和2.0 mmol/L CaCl2;另各組均含有的微量元素包括125.0 μmol Fe-ethylenediaminetetraacetic acid、46.0 μmol H3BO3、9.0 μmol MnSO4、1.0 μmol ZnSO4、0.3 μmol CuSO4、0.1 μmol Na2MoO4、1.0 mmol/L MgSO4、0.18 mmol/L KH2PO4、0.21 mmol/L K2HPO4和0.5 mmol/L NaCl。在前期預(yù)備試驗的基礎(chǔ)上，自處理之日起，每2 d于18：00向煙草植株均勻噴施特定濃度的海藻糖（8.0 mmol/L），每次噴施劑量為5 mL/株。

1. 3 測定指標(biāo)及方法

1. 3. 1 葉綠素酶活性測定 處理后第7和14 d分別取上數(shù)第一張完全展開葉，按照植物葉綠素酶Elisa試劑盒（GTX，美國）產(chǎn)品說明書進(jìn)行葉綠素酶活性測定，葉綠素酶活性單位為μmol/（g·min）。

1. 3. 2 葉綠素合成前體物質(zhì)測定 處理開始，分別于第0、2、7和14 d取上數(shù)第一張完全展開葉進(jìn)行5-氨基酮戊酸（ALA）、膽色素原（PBG）、尿卟啉原（URO）、原卟啉（Proto）、鎂原卟啉（Mg-Proto）和原葉綠素酸酯（Pchl）含量測定。ALA的提取及含量測定參照Dei（1985）的方法，PBG含量測定及URO的提取和含量測定參照Bogorad（1962）的方法，Proto、Mg-Proto和Pchl含量測定參照Rebeiz等（1975）、Lee等（1992）的方法。

1. 3. 3 葉綠素合成關(guān)鍵酶活性測定 自處理開始，分別于第0、2、7和14 d取上數(shù)第一張完全展開葉進(jìn)行5-氨基酮戊酸脫水酶（ALAD）和尿卟啉原Ⅲ合成酶（UROS）活性測定。ALAD活性測定參考楊清等（2012）的方法，UROS活性測定參照范軍和郭藹光（2000）的方法。

1. 3. 4 取材及電鏡樣品制備 分別在處理后第14 d取煙株幼苗的中部完全展開葉片，切成長度1.0～1.5 cm、寬度約0.5 cm的小塊，置于pH 6.8的戊二醛固定液中（v/v=2.5%）固定2 h（4 ℃），用pH 6.8的0.1 mol/L磷酸緩沖液沖洗2次后，分別用乙醇和Epon 812包埋劑進(jìn)行梯度脫水、包埋。切片由ULTRACUTE型超薄切片機完成，最后利用JEM-1200EX透射電鏡進(jìn)行觀察和拍照。

1. 4 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，用單因素方差分析（One-way ANOVA）分析平均數(shù)間的差異顯著性;利用Sigmaplot 10.0制圖。

2 結(jié)果與分析

2. 1 低氮下外源海藻糖對煙株葉片葉綠素酶活性的影響

由圖1可知，與正常氮素供應(yīng)環(huán)境（T1、T2）相比[（分別為5.18和5.03 μmol/（g·min）]，低氮處理（T3、T4）在短時間內(nèi)（處理后7 d）即可顯著提高煙株葉片內(nèi)的葉綠素酶活性（P<0.05，下同），分別達(dá)6.45和6.31 μmol/（g·min）。直至處理后14 d，低氮組（T3、T4）葉片內(nèi)的葉綠素酶活性均顯著高于正常氮素供應(yīng)的對照組（T1）。然而，在氮素供應(yīng)相同的植株中，是否噴施外源海藻糖對煙株葉片內(nèi)葉綠素酶活性的變化無顯著影響（P>0.05，下同）。

2. 2 低氮下外源海藻糖對煙株葉片葉綠素合成前體物質(zhì)的影響

由圖2-A可知，在整個試驗過程中，正常氮素供應(yīng)環(huán)境（T1、T2）下的煙株葉片中ALA含量隨處理后天數(shù)的增加不斷提高，且添加外源海藻糖并未顯著改變其含量;處理后14 d，低氮處理（T3、T4）顯著降低了ALA含量（分別為1.34和2.42 μmol/g），但低氮下噴施外源海藻糖（T4）可有效抑制ALA含量的降低。

由圖2-B～圖2-E可看出，與ALA含量變化相似，生長在正常氮素供應(yīng)環(huán)境（T1、T2）下的煙株，其葉片中PBG、URO、Proto和Mg-Proto含量也隨處理后天數(shù)的增加不斷提高，且短期內(nèi)（處理后2 d）外源海藻糖并未顯著改變其含量。處理后14 d，低氮處理（T3）顯著降低了葉片內(nèi)各葉綠素合成前體物質(zhì)含量，PBG、URO、Proto和Mg-Proto含量分別為6.13、16.15、9.43和29.26 μmol/g。而低氮下噴施外源海藻糖（T4）可有效緩解氮素缺失引發(fā)的葉綠素合成前體物質(zhì)含量的降低，各葉綠素合成前體物質(zhì)含量分別上升到9.32、39.47、16.28和46.53 μmol/g。

由圖2-F可看出，在正常氮素供應(yīng)環(huán)境（T1）下培養(yǎng)的煙株中，葉片內(nèi)的Pchl含量隨著生長發(fā)育的進(jìn)行逐漸提高，到一定階段后略有降低，噴施外源海藻糖（T2）則可進(jìn)一步提高其含量。低氮處理（T3）14 d后葉片Pchl含量（9.20 μmol/g）顯著下降，但噴施外源海藻糖（T4）能有效抑制由此引發(fā)的下降，T4處理Pchl含量為16.73 μmol/g，顯著高于T3處理。

2. 3 低氮下外源海藻糖對煙株葉片葉綠素合成關(guān)鍵酶活性的影響

由圖3-A可看出，在正常氮素供應(yīng)環(huán)境下，催化ALA向PBG轉(zhuǎn)化的ALAD活性隨著煙株生長發(fā)育的進(jìn)行不斷提高，外源海藻糖在短期內(nèi)（處理后2 d）會提高其活性，與對照組（T1）相比，低氮處理（T3）顯著提高了ALAD活性，但隨著時間的延長，其活性急劇下降;而低氮下噴施外源海藻糖（T4）能顯著提高ALAD活性。

由圖3-B可看出，在正常氮素供應(yīng)環(huán)境（T1、T2）下煙株葉片內(nèi)UROS活性不斷提高，外源海藻糖對其活性無顯著影響。而低氮處理（T3）顯著降低了葉片UROS活性，且噴施外源海藻糖（T4）也未顯著提高其活性。

2. 4 低氮下外源海藻糖對煙株葉片葉綠體結(jié)構(gòu)的影響

在對照組（T1）葉肉細(xì)胞中，大部分葉綠體靠近細(xì)胞外圍分布，緊貼細(xì)胞壁周圍，具有較飽滿、完整的形態(tài)，同時可見清晰的基粒片層，膜系統(tǒng)結(jié)構(gòu)也非常完整（圖4-A）。在T2處理組葉肉細(xì)胞內(nèi)，葉綠體的形態(tài)依然飽滿、完整，基粒片層整齊有序，膜系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與對照組一樣完整（圖4-B）。隨著低氮處理時間的延長，細(xì)胞內(nèi)液泡體積增大，葉綠體幾乎全部游離于細(xì)胞壁，結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，膜系統(tǒng)幾乎全部破碎，原來完整的結(jié)構(gòu)已不存在，與細(xì)胞質(zhì)幾乎融為一體，內(nèi)部的類囊體與片層結(jié)構(gòu)均已消失（圖4-C）。外源海藻糖改善了葉肉細(xì)胞葉綠體的完整性，但其仍然出現(xiàn)了部分中空現(xiàn)象，基粒片層也由緊密變得松散，膜邊緣模糊（圖4-D）。

3 討論

有研究表明，外源海藻糖可有效緩解低氮導(dǎo)致的葉綠素含量降低（Lin et al.，2017）。然而，對于海藻糖的作用機制卻知之甚少。在葉片衰老過程中葉綠素逐漸分解，其分解代謝反應(yīng)的第一步即是葉綠素被葉綠素酶催化分解。本研究結(jié)果表明，在氮素供應(yīng)相同的植株中，外源海藻糖并未顯著改變?nèi)~綠素酶活性，說明外源海藻糖不是通過抑制葉綠素的分解而維持葉綠素水平?；诖耍狙芯坑痔接懥说偷峦庠春Ｔ逄菍熤暧兹~葉綠素合成前體物質(zhì)和關(guān)鍵酶活性的影響。葉綠素的生物合成涉及16步反應(yīng)，其中任何一步發(fā)生變化均會導(dǎo)致葉綠素含量的變化（史典義等，2009;苗晗等，2010）。ALA的合成與轉(zhuǎn)化是葉綠素合成的關(guān)鍵節(jié)點（Gough et al.，2003;Bollivar，2006;王平榮等，2009），直接決定葉綠素的合成與含量。本研究中，外源海藻糖顯著提高了低氮下煙株葉片內(nèi)葉綠素合成前體物質(zhì)ALA的含量，保證了足夠的ALA轉(zhuǎn)化合成PBG，與喻敏等（2006）研究發(fā)現(xiàn)ALA向PBG轉(zhuǎn)化合成途徑受阻導(dǎo)致桑樹斑葉突變體葉綠素含量降低的結(jié)論一致。此外，低氮處理組中外源海藻糖同樣顯著提高了煙株葉片的PBG、URO、Proto、Mg-Prot和Pchl含量，證明其葉片中葉綠素合成代謝處于較高水平，最終提高了葉片葉綠素水平與光合作用效率。類似的研究結(jié)果在葫蘆科植物中也有發(fā)現(xiàn)，郝樹芹等（2009）報道西葫蘆銀葉病發(fā)病葉片中URO Ⅲ向Proto Ⅳ的合成受阻造成葉綠素合成降低，并最終影響葉片的光合作用效率。

低氮處理顯著降低了葉片的ALAD和UROS活性，外源海藻糖則提高了兩者的活性。因ALAD和UROS分別催化ALA向PBG轉(zhuǎn)化和PBG向UROⅢ轉(zhuǎn)化，因此這可能與其對應(yīng)的底物含量有關(guān)系，即低氮環(huán)境下的煙株幼苗中，外源海藻糖提高了ALA含量與ALAD活性，同時也提高了葉綠素合成速率。低氮下外源海藻糖提高了葉綠素合成前體物質(zhì)含量與葉片內(nèi)葉綠素的合成速率，進(jìn)一步解釋了外源海藻糖促進(jìn)低氮下煙株幼苗氮素代謝效率的機制（Lin et al.，2017）。

葉綠體是植物進(jìn)行光合作用的場所，植物能否正常生長最終取決于光合性能的好壞，完整的葉綠體結(jié)構(gòu)是保證植物進(jìn)行正常光合的前提。干旱脅迫下海藻糖合成能保護(hù)葉綠體（Lee et al.，2003;Wingler and Paul，2013）。本研究結(jié)果表明，低氮處理下煙草葉綠體結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，已失去自身完整結(jié)構(gòu)，光合作用功能大幅下降。在甘薯、甘蔗等植物中也有類似報道（袁丹等，2017）。而施加外源海藻糖后，其葉肉細(xì)胞內(nèi)葉綠體結(jié)構(gòu)得到改善，葉片光合作用功能亦有改善（Lin et al.，2017），對于海藻糖的這種功能，其他物種中尚未見報道。

綜上所述，低氮下外源海藻糖對煙株幼苗葉片葉綠素的分解無顯著影響，但卻可顯著提高葉綠素合成前體物質(zhì)含量及部分關(guān)鍵酶的活性。同時，相比于低氮環(huán)境下培養(yǎng)的煙株，外源海藻糖也改善了葉片的葉綠體結(jié)構(gòu)。這可能是低氮下外源海藻糖提高煙株幼苗葉片葉綠素含量與光合作用速率的根本原因所在。本研究豐富了海藻糖生物學(xué)功能的相關(guān)知識，同時為通過生物技術(shù)手段提高植物氮素利用率提供了理論依據(jù)，但對于海藻糖調(diào)控葉綠素合成代謝與葉綠體發(fā)育的作用機制還有待進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

在低氮環(huán)境下施加外源海藻糖能提高烤煙幼苗葉片的葉綠素含量，其原因不在于海藻糖可抑制葉綠素的降解，而在于海藻糖能促進(jìn)葉綠素的合成并維持葉綠體結(jié)構(gòu)的完整性。

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（責(zé)任編輯 王 暉）