莫曉麗 周子維 把熠晨 武清揚(yáng) 賴鐘雄 孫云

摘要：【目的】分析茶樹光敏色素（PHY）基因（CsPHY）的生物學(xué)信息及不同采摘時間點(diǎn)茶葉中光敏色素基因表達(dá)量與黃酮含量的相關(guān)性，為茶葉適時采摘及品質(zhì)調(diào)控提供理論參考?！痉椒ā繌牟铇浠蚪M數(shù)據(jù)庫（CSA）中篩選出CsPHY基因家族成員，對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并通過鄰接法（NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。以一天中不同時間點(diǎn)0：00（R0）、6：00（R6）、12：00（R12）和18：00（R18）采摘的烏龍茶品種肉桂鮮葉為試材，通過實(shí)時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測CsPHY基因家族成員在不同時間點(diǎn)的表達(dá)量，并采用三氯化鋁比色法檢測茶葉中黃酮含量的日變化，以皮爾遜（Pearson）相關(guān)系數(shù)評估CsPHY基因相對表達(dá)量與黃酮含量的相關(guān)性?！窘Y(jié)果】共篩選獲得6個CsPHY基因家族成員，編碼蛋白的氨基酸數(shù)量674～1142個，分子量為76126.75～126714.53 Da，等電點(diǎn)（pI）為5.74～5.96，脂溶性系數(shù)為91.11～95.27，其中，CsPHY1基因?qū)儆赑HYC亞族，CsPHY2和CsPHY4基因?qū)儆赑HYA亞族，CsPHY3和CsPHY5基因?qū)儆赑HYB亞族，CsPHY6基因?qū)儆赑HYE亞族，說明CsPHY2和CsPHY4蛋白屬于Phy I型光敏色素，CsPHY1、CsPHY3、CsPHY5和CsPHY6蛋白屬于Phy II型光敏色素。6個CsPHY蛋白均與雙子葉植物PHY蛋白的親緣關(guān)系較近，其中，CsPHY2蛋白與水晶蘭PHYA亞族蛋白的親緣關(guān)系較近，CsPHY4蛋白與美味獼猴桃PHYA亞族蛋白的親緣關(guān)系較近;CsPHY3和CsPHY5蛋白均與美味獼猴桃PHYB亞族蛋白的親緣關(guān)系較近，且CsPHY5蛋白與葡萄PHYB亞族蛋白的親緣關(guān)系相近;CsPHY1蛋白與河岸葡萄PHYC亞族蛋白的親緣關(guān)系較近，CsPHY6蛋白與中華獼猴桃和河岸葡萄PHYE亞族蛋白的親緣關(guān)系較近。CsPHY1、CsPHY3、CsPHY4和CsPHY5基因在R6時的表達(dá)量最高，其中，CsPHY4和CsPHY5基因在R6時的表達(dá)量顯著高于其他時間點(diǎn)的表達(dá)量（P<0.05，下同），而CsPHY2和CsPHY6基因分別在R12和R18時的表達(dá)量達(dá)最高，其中CsPHY6基因在R18時的表達(dá)量顯著高于R12時的表達(dá)量。在R0～R18時段內(nèi)茶樹鮮葉中的黃酮含量無顯著變化（P>0.05），整體呈先下降后上升趨勢，在R18時達(dá)最高值，在R12時最低值。6個CsPHY基因家族成員中，僅CsPHY6基因與黃酮間呈極顯著正相關(guān)（P<0.01）?！窘Y(jié)論】CsPHY基因家族中僅缺少PHYD亞族成員，盡管各成員間功能結(jié)構(gòu)較相似，但表達(dá)模式存在明顯差異。光照影響茶樹葉片中黃酮含量，CsPHY6基因編碼的光受體蛋白CsPHY6參與調(diào)控茶樹葉片中的黃酮含量。

關(guān)鍵詞： 茶鮮葉;采摘時間;光敏色素基因;qRT-PCR;黃酮

中圖分類號： S571.1? ? ? ? ? ? ? &nbsp; ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）06-1173-10

Abstract：【Objective】By analyzing the bioinformatics of tea phytochrome（PHY） gene（CsPHY） and correlation between its expression and the content of flavonoids in tea plucked at different times，the objective of this study was to provide theoretical references for timely plucking and quality control of tea. 【Method】Tea tree CsPHY gene family members were selected from Tea Tree Genome Database（CSA），their bioinformatics were analyzed and phylogenetic tree was constructed through Neighbor-Joining method （NJ）.? Oolong tea Rougui plucked at different times 0：00（R0）， 6：00（R6）， 12：00（R12）， 18：00（R18） in one day were used as materials， the expression patterns of PHY gene family members at di-fferent times were analyzed by real-time fluorescence quantitative（qRT-qPCR）. The daily variation of flavonoids in tea was detected by AlCl3 colorimetry， the correlation between relative express levels of CsPHY genes and the content of flavonoids were evaluated by Pearson correlation coefficient. 【Result】Six CsPHY gene family members were obtained. The amino acids number of coded protein was 674-1142， the molecular weight was 76126.75-126714.53 Da， the isoelectric point（pI） was 5.74-5.96， and the aliphatic index was 91.11-95.27. CsPHY1 gene belonged to PHYC subfamily， CsPHY2 and CsPHY4 genes belonged to PHYA subfamily， CsPHY3 and CsPHY5 genes belonged to PHYB subfamily， CsPHY6 gene belonged to PHYE subfamily， indicating that CsPHY2 and CsPHY4 proteins belonged to Phy I type phytochrome， CsPHY1， CsPHY3， CsPHY5 and CsPHY6 proteins belonged to Phy II type phytochrome. The six tea tree CsPHY proteins were closely related to the PHY protein of dicotyledonous plants. Among them，the CsPHY2 protein was closely related to the PHYA subfamily protein of Monotropastrum globosum， and the CsPHY4 protein was closely related to the PHYA subfamily protein of Actinidia deliciosa. CsPHY3 and CsPHY5 proteins were closely related to the PHYB subfamily protein of the A. deliciosa， and CsPHY5 protein was closely related to the PHYB subfamily protein of Vitis vinifera. CsPHY1 protein was closely related to the PHYC subfamily of V. riparia. CsPHY6 protein was closely related to the PHYE subfamily proteins of A. chinensis and V. riparia. The expression levels of CsPHY1，CsPHY3，CsPHY4 and CsPHY5 genes were the highest at R6. The expression levels of CsPHY4 and CsPHY5 genes at R6 were significantly higher than those at other time points（P<0.05，the same below）. The highest expression levels of CsPHY2 and CsPHY6 genes were at R12 and R18 respectively， and the expression level of CsPHY6 gene at R18 was significantly higher than that at R12. There was no significant change in the content of flavonoids in fresh tea leaves during the period of R0-R18（P>0.05）. The trend of flavonoids content declined first and then upward， reaching the peak at R18 and the lowest at R12. Among the six CsPHY gene family members， only CsPHY6 gene was extremely positively correlated with flavonoids（P<0.01）. 【Conclusion】Only the PHYD subfamily member is missing from the tea tree CsPHY gene family. Although the functional structures are similar， there are great difference in expression patterns. Light affects the content of flavonoids in tea leaves， and CsPHY6 gene-encoded photoreceptor protein CsPHY6 is involved in the regulation of flavonoids content in tea leaves.

Key words： fresh tea leaves; plucking time; phytochrome gene; qRT-PCR; flavonoid

0 引言

【研究意義】在自然光條件下，植物通過光受體感知光周期和光質(zhì)，從而影響植物次生代謝。光敏色素（Phytochrome，PHY）是一類吸收紅光—遠(yuǎn)紅光可逆轉(zhuǎn)換的光受體蛋白（色素蛋白質(zhì)），廣泛存在于藍(lán)細(xì)菌、低等植物和高等植物體中（Rockwell and Lagarias，2010），屬可溶性色素蛋白。茶樹次生代謝產(chǎn)物是茶葉重要的功能成分，對茶葉品質(zhì)起決定性作用，如黃酮類化合物是烏龍茶中重要的品質(zhì)和功效成分，同時影響烏龍茶滋味和湯色品質(zhì)（羅麗和郭雅玲，2004;夏濤和高麗萍，2009）。研究發(fā)現(xiàn)，光處理對黃酮類化合物合成有明顯促進(jìn)效果（徐茂軍等，2003;張曉燕等，2014），說明PHY間接調(diào)控茶葉的品質(zhì)。茶樹鮮葉采摘是茶葉生產(chǎn)環(huán)節(jié)的第一步，采摘時間的差異通常對成品茶品質(zhì)造成影響。恰當(dāng)?shù)牟枞~采摘時間不僅有利于后續(xù)加工工藝的開展，還可影響自然光條件下茶樹PHY基因（CsPHY）的表達(dá)模式，從而間接影響茶葉內(nèi)含物的合成，因此，研究茶樹PHY相關(guān)基因的表達(dá)模式及與黃酮日變化的相關(guān)性對解析早、午、晚青付制成品茶造成的品質(zhì)差異并制定適宜的茶葉采摘時間提供理論參考?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】植物中的PHY基因家族至少含3個成員（Mathews et al.，1995）。模式植物擬南芥PHY基因分別屬于PHYA、PHYB、PHYC、PHYD和PHYE亞族，其中PHYA、PHYB和PHYC亞族基因的序列相似性低于50%，但PHYD和PHYB亞族基因的相似度較高，其原因是PHYD亞族是在擬南芥最后一次全基因組復(fù)制事件中從PHYB亞族派生出來（Sharrock and Quail，1989）。PHYA亞族基因編碼的蛋白屬PhyⅠ型光敏色素，接收波長700～750 nm連續(xù)遠(yuǎn)紅光，對光反應(yīng)不穩(wěn)定，在光照下其mRNA活性受到抑制;PHYB、PHYC、PHYD和PHYE亞族基因編碼的蛋白屬光敏Phy Ⅱ型光敏色素，具有高度的光穩(wěn)定性，不受光影響，接收600～700 nm紅光，屬組成型表達(dá)（Clark et al.，1994;馬曉凈，2018）。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，番茄中也存在上述5個亞族的PHY基因（Alba et al.，2000）;水稻中僅有PHYA，PHYB和PHYC亞族成員（王靜和王艇，2007），但至今尚未在單子葉植物中發(fā)現(xiàn)PHYE亞族基因。目前，PHY的生理功能研究主要集中在參與植物形態(tài)建成，包括種子萌發(fā)（Franklin and Quail，2010）、開花誘導(dǎo)（顧建偉等，2011）、去黃化作用（劉栓桃等，2014）等，以及對不同光信號的應(yīng)激反應(yīng)和化學(xué)成分調(diào)節(jié)（Rockwell et al.，2006）等方面。Alba等（2000）研究發(fā)現(xiàn)，番茄果實(shí)中番茄紅素的積累與光敏色素有關(guān)。陳碧薇（2014）研究表明，沉默番茄PHY基因下游轉(zhuǎn)錄因子可提高番茄果實(shí)的營養(yǎng)品質(zhì)、抗氧化能力及類黃酮含量。李娜等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，藍(lán)光照射能提高大豆芽苗菜中類黃酮合成關(guān)鍵酶的活性，并上調(diào)相關(guān)基因的表達(dá)水平。劉轉(zhuǎn)霞等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，香蕉含PHYA、PHYB、PHYC1和PHYC2等4種PHY基因，其中PHYC1基因能積極響應(yīng)紅光刺激。牛驤等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，玉米在不同光質(zhì)和光周期處理下2個PHYC基因在玉米形態(tài)建成中發(fā)揮關(guān)鍵作用?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】至今，鮮見有關(guān)CsPHY基因家族成員的表達(dá)模式及黃酮日變化規(guī)律的研究報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】從茶樹基因組數(shù)據(jù)庫中篩選出CsPHY基因家族成員，并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析;以一天中不同時間點(diǎn)0：00（R0）、6：00（R6）、12：00（R12）和18：00（R18）采摘的烏龍茶品種肉桂鮮葉為試材，通過實(shí)時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測CsPHY基因家族成員在不同時間點(diǎn)的表達(dá)量，并采用三氯化鋁比色法檢測茶葉中黃酮含量的日變化，以皮爾遜相關(guān)系數(shù)評估CsPHY基因相對表達(dá)量與黃酮含量的相關(guān)性，為解析早、午、晚青付制成品茶的品質(zhì)差異及制定適宜的茶葉采摘時間提供理論參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試烏龍茶品種肉桂（Camellia sinensis cv. Rougui）是福建武夷巖茶的當(dāng)家品種，付制烏龍茶香氣辛銳持久、帶桂皮香、滋味醇厚回甘，深受消費(fèi)者青睞，由福建農(nóng)林大學(xué)茶學(xué)教學(xué)科研實(shí)踐基地茶樹資源圃提供。主要試劑：RNAprep Pure Plant Kit（DP432）試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，PrimeScriptTM RT Reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒（RR047A）和SYBR? Premix Ex Taq II試劑盒均購自寶生物工程（大連）有限公司，其他生化試劑均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。1% AlCl3溶液的配制：稱取三氯化鋁（AlCl·6H2O）7567 g，加水溶解并稀釋至100 mL。qRT-PCR引物委托鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司合成。主要儀器設(shè)備：Allegra 64R臺式高速冷凍離心機(jī)（Beckman Coulter，美國）、超微量核酸分析儀（Themo，美國）、實(shí)時熒光定量PCR儀（Roche，美國）、UV-5900（PC）型紫外可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）和電泳凝膠成像系統(tǒng)（BIO-RAD，美國）。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 樣品采集 2018年5月分別于0：00（R0）、06：00（R6）、12：00（R12）和18：00（R18）4個時間點(diǎn)采集烏龍茶品種肉桂的鮮葉，采摘標(biāo)準(zhǔn)為年生長無病蟲害的中開面三四葉約20.0 g。其中，5.0 g鮮葉用錫箔紙包好，立即放入液氮中3 min，然后取出樣品快速放入-70 ℃冰箱中保存?zhèn)溆茫糜诳俁NA的抽提;剩余15.0 g鮮葉微波（中高火，3 min）烘烤，再充分研磨成粉末，用于黃酮含量檢測。每次取樣設(shè)3個重復(fù)。

1. 2. 2 CsPHY基因序列篩選 以茶樹全基因組數(shù)據(jù)庫（Tea Tree Genome Database，CSA）為基礎(chǔ)（Xia et al.，2017），在Pfam功能注釋庫（Functional annotations，TSV）中以PHY基因典型蛋白結(jié)構(gòu)域的登錄號（PF00989）為條件進(jìn)行檢索，并將搜索獲得的CsPHY基因序列片段依次命名為CsPHY1、CsPHY2、CsPHY3、CsPHY4、CsPHY5和CsPHY6。

1. 2. 3 生物信息學(xué)分析 采用ExPASy對CsPHY基因進(jìn)行理化性質(zhì)預(yù)測，并在NCBI中進(jìn)行同源序列比對，利用MEGA 7.0的鄰接法（NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。根據(jù)CsPHY基因編碼蛋白的氨基酸序列，在motif research網(wǎng)站上進(jìn)行基序預(yù)測分析，并利用SMART預(yù)測其結(jié)構(gòu)域。

1. 2. 4 總RNA提取及cDNA合成 參照RNAprep Pure Plant Kit說明以離心柱法抽提茶樹葉片中的總RNA，利用超微量核酸分析儀檢測其濃度和純度，1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。采用PrimeScriptTM RT Reagent Kit逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，將獲得的cDNA文庫置于-20 ℃條件下貯藏備用。

1. 2. 5 qRT-PCR檢測 采用SYBR? Premix Ex Taq II試劑盒對不同采摘時間葉片的CsPHY基因表達(dá)情況進(jìn)行檢測。利用DNAman設(shè)計目的基因的特異性引物如表1所示。以CsGADPH、18S rRNA和CsACT為內(nèi)參基因（Zhou et al.，2019）。反應(yīng)體系20.0 μL：SYBR Green Master Mix 10.0 μL，正、反向引物各0.8 μL，滅菌水7.4 μL，cDNA模板1.0 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，進(jìn)行40個循環(huán)。

1. 2. 6 黃酮含量測定 采用三氯化鋁比色法測定茶葉中黃酮含量：取研磨成粉末的茶樣1.00 g，加入40.0 mL水，于沸水浴中提取30 min后過濾，加水定容至50.0 mL后搖勻，吸取0.5 mL試液，加入1%三氯化鋁定容至10.0 mL，搖勻，靜置10 min后比色，以空白試劑作參比，于波長420 nm處測吸光度，計算公式如下：

其中，E為試液測得的吸光度;320為當(dāng)E=1.00時相當(dāng)于320 μg黃酮;L1為試液總量;L2為測定時的用液量;M為試樣干重。

1. 3 統(tǒng)計分析

利用多內(nèi)參法2-△Ct校正qRT-PCR定量試驗(yàn)結(jié)果（Zhou et al.，2019）。采用Graphpad Prism 6.0和PASW Statistics 18.0對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析及制圖，利用皮爾遜相關(guān)系數(shù)（Ahlgren et al.，2003）評估PHY基因的表達(dá)量與黃酮含量的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2. 1 CsPHY基因篩選結(jié)果及其編碼蛋白的理化性質(zhì)分析結(jié)果

從茶樹全基因組數(shù)據(jù)庫中篩選獲得6個CsPHY基因家族成員，依次命名為CsPHY1、CsPHY2、CsPHY3、CsPHY4、CsPHY5和CsPHY6，其相關(guān)理化性質(zhì)如表2所示。6個CsPHY基因家族成員編碼蛋白的氨基酸數(shù)量674～1142個，分子量為76126.75～126714.53 Da，其中以CsPHY4蛋白的氨基酸數(shù)量和分子量最多，CsPHY6蛋白的最少;等電點(diǎn)（pI）為5.74～5.96，以CsPHY6蛋白最大;脂溶性系數(shù)為91.11～95.27，以CsPHY1蛋白最大。

2. 2 CsPHY基因進(jìn)化分析結(jié)果

為系統(tǒng)了解CsPHY基因家族成員與其他物種PHY基因的親緣關(guān)系和進(jìn)化距離，對篩選獲得的6個茶樹PHY基因編碼蛋白的氨基酸序列在NCBI上進(jìn)行BLASTp同源比對分析，共獲得獼猴桃、葡萄等28個其他物種的61個PHY蛋白氨基酸序列，構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹如圖1所示。6個CsPHY基因分別屬于PHYA、PHYB、PHYC和PHYE四個亞族，其中，CsPHY1屬于PHYC亞族，CsPHY2和CsPHY4基因?qū)儆赑HYA亞族，CsPHY3和CsPHY5基因?qū)儆赑HYB亞族，CsPHY6基因?qū)儆赑HYE亞族，說明CsPHY2和CsPHY4蛋白屬于Phy I型光敏色素，CsPHY1、CsPHY3、CsPHY5和CsPHY6蛋白屬于Phy II型光敏色素。且6個CsPHY蛋白均與雙子葉植物PHY蛋白的親緣關(guān)系較近，其中，CsPHY2蛋白與水晶蘭PHYA亞族蛋白的親緣關(guān)系較近，CsPHY4蛋白與美味獼猴桃PHYA亞族蛋白的親緣關(guān)系較近;CsPHY3和CsPHY5蛋白均與美味獼猴桃PHYB亞族蛋白親緣關(guān)系較近，且CsPHY5蛋白與葡萄的PHYB亞族蛋白親緣關(guān)系相近;CsPHY1蛋白與河岸葡萄PHYC亞族蛋白的親緣關(guān)系較近，CsPHY6蛋白與中華獼猴桃和河岸葡萄PHYE亞族蛋白的親緣關(guān)系較近。

2. 3 CsPHY基因結(jié)構(gòu)域和Motif分析結(jié)果

利用SMART在線分析CsPHY蛋白的氨基酸序列，結(jié)果如圖2所示。6個CsPHY蛋白中共存在7種結(jié)構(gòu)域，分別為PAS_2（PF08446）、GAF、PHY（PF00360）、PAS、PAC、HisKA和HATPase_c。其中，CsPHY1、CsPHY2、CsPHY3、CsPHY4和CsPHY5的N段均具有光敏色素典型的PAS-GAF-PHY結(jié)構(gòu)域，而C端（除CsPHY1外）均具有PAC、HisKA和HATPase_c結(jié)構(gòu)域。雖然CsPHY2和CsPHY4均屬于PHYA亞族，但CsPHY4的C端多了2個PAC結(jié)構(gòu)域。CsPHY1屬于PHYC亞族，其結(jié)構(gòu)與CsPHY4相似，但C端缺少1個PAC和HATPase_c結(jié)構(gòu)域。CsPHY3和CsPHY5均屬PHYB亞族，二者差異主要體現(xiàn)在CsPHY3的C端不具備PAC結(jié)構(gòu)域。CsPHY6屬PHYE亞族，與其他成員的差異主要體現(xiàn)在CsPHY6的N端缺少PAS結(jié)構(gòu)域，且其PHY結(jié)構(gòu)域的220～226 aa區(qū)間出現(xiàn)7個氨基酸重疊現(xiàn)象，而C端結(jié)構(gòu)域與CsPHY4類似，但均缺乏HATPase_c結(jié)構(gòu)域。

此外，CsPHY1、CsPHY2、CsPHY4和CsPHY5均存在低復(fù)雜結(jié)構(gòu)域（圖2）。運(yùn)用Motif Search在線預(yù)測6個CsPHY蛋白的基序，結(jié)果顯示，6個CsPHY蛋白共含10種Motif（Motif1～Motif10），其中，CsPHY1、CsPHY2、CsPHY3、CsPHY4和CsPHY5均存在Motif1～Motif5，而CsPHY2、CsPHY3和CsPHY4的C端還存在長約1000 aa的Motif6，而Motif7～Motif9僅在CsPHY6中存在，同時Motif10僅存在于CsPHY3中的900～950 aa區(qū)間內(nèi)（圖3）。

2. 4 茶樹PHY基因在不同采摘時間點(diǎn)的表達(dá)模式檢測結(jié)果

不同采摘時間點(diǎn)茶樹鮮葉中CsPHY基因的表達(dá)量如圖4所示。CsPHY1、CsPHY3、CsPHY4和CsPHY5基因在R6時的表達(dá)量最高，其中，CsPHY4和CsPHY5基因在R6時的表達(dá)量顯著高于其他時間點(diǎn)的表達(dá)量（P<0.05，下同），而CsPHY2和CsPHY6基因分別在R12和R18時的表達(dá)量達(dá)最高，其中CsPHY6基因在R18時的表達(dá)量顯著高于R12時的表達(dá)量?？梢?，CsPHY1、CsPHY2、CsPHY3、CsPHY4和CsPHY5基因的表達(dá)量在清晨或中午達(dá)峰值，而凌晨和傍晚的表達(dá)量較低，但CsPHY6基因的表達(dá)量日變化有所不同，在傍晚達(dá)峰值。

2. 5 黃酮含量測定結(jié)果

不同采摘時間點(diǎn)茶樹鮮葉的黃酮含量檢測結(jié)果如圖5所示。在R0～R18時段內(nèi)茶樹鮮葉中的黃酮含量無顯著性變化（P>0.05，下同），整體呈先下降后上升趨勢，在R18時達(dá)最高值，為5.58 mg/g，在R12時最低，為4.61 mg/g。由于R0～R12時段的自然光由弱變強(qiáng)，R12～R18時段的自然光由強(qiáng)到弱，黃酮含量隨光強(qiáng)的增強(qiáng)而下降，表明自然光的交替變化能引起茶樹葉片中黃酮含量變化。

2. 6 CsPHY基因的表達(dá)量與黃酮含量的相關(guān)性分析結(jié)果

利用皮爾遜相關(guān)系數(shù)評估茶樹CsPHY基因的表達(dá)量與黃酮含量的相關(guān)性，結(jié)果如表4所示。僅CsPHY6基因表達(dá)量與黃酮含量呈極顯著相關(guān)（P<0.01，下同），CsPHY1、CsPHY2、CsPHY3、CsPHY4和CsPHY5基因的表達(dá)量與黃酮含量均無顯著相關(guān)性。由此推測，CsPHY6基因編碼的光受體蛋白CsPHY6參與調(diào)控茶樹葉片中的黃酮含量。

3 討論

3. 1 CsPHY基因家族成員的篩選及進(jìn)化分析

前人研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥中存在PHYA、PHYB、PHYC、PHYD和PHYE 5種不同亞族的光敏色素基因，其過表達(dá)會影響植株的株形和光合效率（Bradley et al.，1996）。本研究篩選獲得6個典型CsPHY基因，將其編碼蛋白與其他物種PHY蛋白進(jìn)行氨基酸序列同源比對分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)屬于PHYA和PHYB亞族的茶樹基因各有2個，屬于PHYC和PHYE亞族各有1個，其中CsPHY3（PHYB亞族）和CsPHY4（PHYA亞族）分別與美味獼猴桃PHYB和PHYA亞族蛋白的親緣關(guān)系較近，而CsPHY6（PHYE亞族）與中華獼猴桃PHYE亞族蛋白的遺傳距離較近，而CsPHY1（PHYC亞族）與河岸葡萄PHYC亞族蛋白的親緣關(guān)系較近，CsPHY5（PHYB亞族）與美味獼猴桃和葡萄PHYB亞族蛋白的親緣關(guān)系均較近。在漫長的進(jìn)化過程中茶樹基因組經(jīng)歷過兩次全基因組復(fù)制事件，通過分析旁系同源基因?qū)Φ耐x替換率（Ks）分布情況，發(fā)現(xiàn)茶樹與葡萄和中華獼猴共同經(jīng)歷了第一次的全基因組復(fù)制事件（Xia et al.，2017），為茶樹、中華獼猴桃和葡萄基因家族間存在同源性較高提供一定佐證，但有待進(jìn)一步探究。

本研究未發(fā)現(xiàn)茶樹PHYD亞族基因，可能是茶樹進(jìn)化歷程出現(xiàn)的基因功能冗余所造成。Aukerman等（1997）研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥PHYD亞族蛋白的結(jié)構(gòu)與PHYB亞族蛋白相近，但二者均可響應(yīng)避光調(diào)節(jié)，表明植物中天然存在PHYD-1突變現(xiàn)象。李建平等（2014）則研究表明，在不同光下PHYD亞族基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)較穩(wěn)定，但其對擬南芥幼苗的光形態(tài)建成的調(diào)控作用較微弱。上述研究結(jié)果表明，在自然環(huán)境條件下，許多植物的PHYD亞族基因并非必需。

3. 2 CsPHY基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)域及其表達(dá)模式差異分析

基因中不同外顯子編碼的結(jié)構(gòu)域是蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能單元（Bork，1991）廣泛參與植物基因轉(zhuǎn)錄、翻譯調(diào)控和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生命過程（廉德君和許根俊，1997），而光對植物的生長發(fā)育及化學(xué)成分調(diào)節(jié)是通過特異基因的調(diào)控來實(shí)現(xiàn)（Quail，2002）。本研究發(fā)現(xiàn)，6個CsPHY蛋白中，除CsPHY6蛋白外，其他蛋白的N端均存在PAS-GAF-PHY 3個結(jié)構(gòu)域組成的光敏核心區(qū)，該區(qū)段可結(jié)合吸收紅光/遠(yuǎn)紅光生色團(tuán)的前體藻藍(lán)膽素生色團(tuán)，負(fù)責(zé)光感受（Kawai et al.，2003），但所有成員在C端均存在2個PAS和1個HisKA結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域可構(gòu)成光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)體系負(fù)責(zé)光調(diào)節(jié)（Li et al.，2005）。但所有成員的C端PAS/PAC結(jié)構(gòu)域在位置分布上存在差異，可能是PHY基因家族成員表達(dá)模式存在差異的原因。本研究發(fā)現(xiàn)，CsPHY6基因在R0～R6時段相對表達(dá)量無明顯變化，而其他基因在該時段內(nèi)均上調(diào)表達(dá)，其中，CsPHY4和CsPHY5基因均顯著上調(diào)表達(dá)。此外，由于R6～R12時段的自然光從無到有，由弱變強(qiáng)，但CsPHY6基因表達(dá)顯著下調(diào)，其原因可能是CsPHY6蛋白N端缺失PAS結(jié)構(gòu)域，從而造成光感受障礙或延遲，致使CsPHY6基因的轉(zhuǎn)錄受到抑制，但需后續(xù)試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。

3. 3 黃酮含量與CsPHY基因表達(dá)量的相關(guān)性分析

植物PHY基因作為重要的光信號受體蛋白編碼基因，對于植物的生長發(fā)育、形態(tài)建成、次生代謝及抗逆性起重要作用（Baldwin and Ohnmeiss，1994;Aphalo and Lehto，1997;Deng et al.，2002;王靜，2009）。朱新貴等（1999）研究發(fā)現(xiàn)，光照能明顯促進(jìn)玫瑰茄細(xì)胞黃酮含量的增加。本研究發(fā)現(xiàn)，茶樹鮮葉的黃酮含量在R18時最高，說明自然光的減弱影響茶樹葉片中黃酮類化合物的合成，而傍晚茶青黃酮含量達(dá)峰值，可能是生物合成代謝流累積的結(jié)果，在一定程度上或許可印證烏龍茶產(chǎn)區(qū)“早青不如午青，午青不如晚青”的說法。本研究相關(guān)性分析結(jié)果表明，黃酮含量與CsPHY6基因表達(dá)量呈顯著正相關(guān)，其他5個基因的相對表達(dá)量與黃酮含量均無顯著相關(guān)性，推測CsPHY6基因參與調(diào)控黃酮的合成，其原因是該基因編碼蛋白CsPHY6屬于PHYE亞族，在氨基酸數(shù)量、結(jié)構(gòu)域及Motif數(shù)量和種類方面均與其他成員存在明顯差異，說明其生物學(xué)功能也存在明顯差異。何靜雯等（2018a，2018b）研究發(fā)現(xiàn)，在近源物種葡萄中PHYE亞族基因表達(dá)量隨脅迫程度的升高而降低，其與葡萄的抗逆性及生理機(jī)能存在密切聯(lián)系，但該研究未提及與黃酮合成和代謝的關(guān)系。在今后的研究中，應(yīng)深入研究茶樹CsPHY6基因在光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及黃酮代謝方面的調(diào)控機(jī)理。

4 結(jié)論

CsPHY基因家族中僅缺少PHYD亞族成員，盡管各成員間功能結(jié)構(gòu)較相似，但表達(dá)模式存在明顯差異。光照影響茶樹葉片中黃酮含量，CsPHY6基因編碼的光受體蛋白參與調(diào)控茶樹葉片中的黃酮含量。

參考文獻(xiàn)：

陳碧薇. 2014. 光敏色素下游轉(zhuǎn)錄因子基因沉默對番茄生長和營養(yǎng)品質(zhì)及丁香假單胞菌Pst DC3000脅迫抗性的影響[D]. 杭州：浙江大學(xué). [Chen B W. 2014. Effects of phytochrome downstream transcription factor gene silen-cing on the growth，nutritional quality and stress tolerance to Pst DC3000 in tomato[D]. Hangzhou：Zhejiang University.]

顧建偉，劉婧，薛彥久，臧新，謝先芝. 2011. 光敏色素在水稻生長發(fā)育中的作用[J]. 中國水稻科學(xué)，25（2）：130-135. [Gu J W，Liu J，Xue Y J，Zang X，Xie X Z. 2011. Phytochrome functions in rice development[J]. Chinese Journal of Rice Science，25（2）：130-135.]

何靜雯，李晨，邱甜，吳燕燕，沈梓力，吳月燕. 2018a. 弱光脅迫下鄞紅葡萄生理生化特性及相關(guān)基因的研究[J]. 華北農(nóng)學(xué)報，33（6）：123-129. [He J W，Li C，Qiu T，Wu Y Y，Shen Z L，Wu Y Y. 2018a. Effects of weak light stress on physiological and biochemical characteristics and relative gene expression of Yinhong grape[J]. Acta Agriculturae Boreali-Sinica，33（6）：123-129.]

何靜雯，趙晟，岳慶春，吳月燕. 2018b. 弱光脅迫下‘鄞紅’葡萄光合特性及相關(guān)基因的表達(dá)[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，31（12）：2520-2526. [He J W，Zhao S，Yue Q C，Wu Y Y. 2018b. Effects of weak light stress on photosynthetic characteristics and relative fene expression of ‘Yinhong’ grape[J]. Southwest China Journal of Agricultural Scien-ces，31（12）：2520-2526.]

李建平，楊建平，宋梅芳，蘇亮，侯佩，郝曉燕，邵琳，陳果，足木熱木，黃全生. 2014. 擬南芥光敏色素D（AtphyD）在不同光質(zhì)下的表達(dá)特性分析[J]. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，51（2）：305-310. [Li J P，Yang J P，Song M F，Su L，Hou P，Hao X Y，Shao L，Chen G，Zumuremu，Huang Q S. 2014. Di-fferential patterns of expression of the Arabidopsis phytochrome D under different light conditions[J]. Xinjiang Agricultural Sciences，51（2）：305-310.]

李娜，張曉燕，田紀(jì)元，賈禮，龔春燕，居鑫，劉自力，崔瑾. 2017. 藍(lán)光連續(xù)光照對大豆芽苗菜類黃酮合成的影響[J]. 大豆科學(xué)，36（1）：51-59. [Li N，Zhao X Y，Tian J Y，Jia L，Gong C Y，Ju X，Liu Z L，Cui J. 2017. Effect of blue light continuous illumination on flavonoid synthesis in soybean sprouts[J]. Soybean Science，36（1）：51-59.]

廉德君，許根俊. 1997. 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能中的結(jié)構(gòu)域[J]. 生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，24（6）：482-486. [Lian D J，Xu G J. 1997. Structure domains in protein structure and function[J]. Progress in Biochemistry and Biophysics，24（6）：482-486.]

劉栓桃，張志剛，李巧云，王淑芬，趙智中，盧金東，張曉燕，徐文玲，劉賢嫻，付衛(wèi)民. 2014.? 光敏色素B基因（PHYB）啟動子突變及與大白菜開花時間的關(guān)聯(lián)分析[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，22（7）：853-861. [Liu S T，Zhang Z G，Li Q Y，Wang S F，Zhao Z Z，Lu J D，Zhang X Y，Xu W L，Liu X X，F(xiàn)u W M. 2014. Association analysis between phytochrome B gene（PHYB） promoter mutantions and flowering time in Chinese cabbage（Brassica rapa L. ssp. pekinensis）[J]. Journal of Agricultural Biotechnology，22（7）：853-861.]

劉轉(zhuǎn)霞，余運(yùn)康，陳裕坤，馮新，劉煒?gòu)O，張梓浩，程春振，林玉玲，賴鐘雄. 2017. 福州野生蕉隱花色素和光敏色素基因家族的克隆及其表達(dá)分析[J]. 熱帶作物學(xué)報，38（11）：2089-2099. [Liu Z X，Yu Y K，Chen Y K，F(xiàn)eng X，Liu W H，Zhang Z H，Cheng C Z，Lin Y L，Lai Z X. 2017. Cloning and expression analysis of Cryptochrome and Phytochrome family genes in the wild banana（Musa spp.） from Fuzhou City[J]. Chinese Journal of Tropical Crops，38（11）：2089-2099.]

羅麗，郭雅玲. 2004. 福建烏龍茶黃酮類化合物含量分析[J]. 中國茶葉加工，（3）：32-34. [Lou L，Guo Y L. 2004. Analysis of flavonoids in Fujian Oolong tea[J]. China Tea Processing，（3）：32-34.]

馬曉凈. 2018. 玉米PHYB1基因在擬南芥中的功能分析[D]. 北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院. [Ma X J. 2018. Functional ana-lyses of maize PHYB1 in Arabidopsis thaliana[D]. Beijing：Chinese Aca-demy of Agricultural Sciences.]

牛驤，郭林，楊宗舉，孫蕾，李紅丹，游光霞，徐宏，孟凡華，佘躍輝，楊建平. 2017. 2個玉米光敏色素C基因的轉(zhuǎn)錄豐度對多種光質(zhì)處理的響應(yīng)[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，50（12）：2209-2219. [Niu X，Guo L，Yang Z J，Sun L，Li H D，You G X，Xu H，Meng F H，She Y H，Yang J P. 2017. Transcription abundances of two phytochrome C in response to different light treatment in Zea mays[J]. Scientia Agricultura Sinica，50（12）：2209-2219.]

王靜，王艇. 2007. 高等植物光敏色素的分子結(jié)構(gòu)、生理功能和進(jìn)化特征[J]. 植物學(xué)通報，24（5）：649-658. [Wang J，Wang T. 2007. Molecular structure，physiological function and evolution of phytochrome in higher plant[J]. Chinese Bulletin of Botany，24（5）：649-658.]

王靜. 2009. 裸子植物PHY基因GAF和PHY-PAS1結(jié)構(gòu)域的適應(yīng)性進(jìn)化研究[D]. 武漢：中國科學(xué)院武漢植物園. [Wang J. 2009. Adaptive evolution in the GAF and PHY-PAS1 domains of PHY gene in gymnosperms[D]. Wuhan：Wuhan Botanical Garden，Chinese Academy of Scien-ces.]

夏濤，高麗萍. 2009. 類黃酮及茶兒茶素生物合成途徑及其調(diào)控研究進(jìn)展[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，42（8）：2899-2908. [Xia T，Gao L P. 2009. Advances in biosynthesis pathways and regulation of flavonoids catechins[J]. Scientia Agricultura Sinica，42（8）：2899-2908.]

徐茂軍，朱睦元，顧青. 2003. 發(fā)芽大豆中異黃酮積累的光誘導(dǎo)作用研究[J]. 中國糧油學(xué)報，（1）：44-47. [Xu M J，Zhu M Y，Gu Q. 2003. Light-induced effects of isoflavone accumulation in germinated soybean[J]. Journal of the Chinese Cereals and Oils Association，（1）：44-47.]

張曉燕，魯燕舞，魏圣軍，崔瑾. 2014. 光質(zhì)對大豆芽苗菜生長和大豆異黃酮含量及PAL活性的影響[J]. 大豆科學(xué)，33（1）：46-52. [Zhang X Y，Lu Y W，Wei S J，Cui J. 2014. Effects of light quality on growth，soy isoflavone content and PAL activity of soybean sprouts[J]. Soybean Scien-ce，33（1）：46-52.]

朱新貴，郭勇，林捷. 1999. 光質(zhì)對玫瑰茄懸浮細(xì)胞合成花青素的影響[J]. 華南理工大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），（3）：57-60. [Zhu X G，Guo Y，Lin J. 1999. Effects of monochromic light on synthesis of anthocyanin in roselle（Hibscus sabdariffa L.） cells suspension[J]. Journal of South China University of Technology（Natural Science），（3）：57-60.]

Ahlgren P，Jarneving B，Rousseau R. 2003. Requirements for a cocitation similarity measure，with special reference to Pearson’s correlation coefficient[J]. Journal of the Association for Information Science & Technology，54（6）：550-560.

Alba R，Kelmenson P M，Cordonnier-Pratt M M，Pratt L H. 2000. The phytochrome gene family in tomato and the rapid differential evolution of this family in angiosperms[J]. Molecular Biology and Evolution，17（3）：362-373.

Aphalo P J，Lehto T. 1997. Effects of light quality on growth and N accumulation in birch seedlings[J]. Tree Physiology，17（2）：125-132.

Aukerman M J，Hirschfeld M，Wester L，Weaver M，Clack T，Amasino R M，Sharrock R A. 1997. A deletion in the PHYD gene of the Arabidopsis Wassilewskija ecotype defines a role for phytochrome D in red/far-red light sen-sing[J]. The Plant Cell，9（8）：1317-1326.

Baldwin I T，Ohnmeiss T E. 1994. Coordination of photosynthetic and alkaloidal responses to damage in uninducible and inducible Nicotiana sylvestris[J]. Ecology，75（4）：1003-1014.

Bork P. 1991. Shuffled domains in extracellular proteins[J]. Febs Letters，286（1-2）：47-54.

Bradley J M，Murphy G P，Whitelam G C，Harberd N P. 1996. Identification of phytochrome B amino acid residues mutated in three new phyB mutants of Arabidopsis thaliana[J]. Journal of Experimental Botany，47（302）：1449-1455.

Clack T，Mathews S，Sharrock R A. 1994. The phytochrome apoprotein family in Arabidopsis is encoded by five genes：The sequences and expression of PHYD and PHYE[J]. Plant Molecular Biology，25（3）：413-427.

Deng J M，Bin J H，Pan R C. 2002. Effect of light quality on the primary nitrogen assimination of rice（Oryza sativa L.） seedlings[J]. Acta Botanica Sinica，42（3）：234-238.

Franklin K A，Quail P H. 2010. Phytochrome functions in Arabidopsis development[J]. Journal of Experimental Bo-tany，61（1）：11-24.

Kawai H，Kanegae T，Christensen S，Kiyosue T，Sato Y，Imaizumi T，Kadota A，Wada M. 2003. Responses of ferns to red light are mediated by an unconventional photoreceptor[J]. Nature，421（6920）：287-290.

Li F W，Melkonian M，Rothfels C J，Villarreal J C，Stevenson D W，Graham S W，Wong G K S，Pryer K M，Mathews S. 2005. Phytochrome diversity in green plants and the origin of canonical plant phytochromes[J]. Nature Communications，6：7852.

Mathews S，Lavin M，Sharrock R A. 1995. Evolution of the phytochrome gene family and its utility for phylogenetic analyses of angiosperms[J]. Annals of the Missouri Botanical Garden，82（2）：296-321.

Quail P H. 2002. Phytochrome photosensory signalling networks[J]. Nature Reviews Molecular Cell Biology，3（2）：85-93.

Rockwell N C，Lagarias J C. 2010. A brief history of phytochromes[J]. Chemphyschem：A European Journal of Che-mical Physics & Physical Chemistry，11（6）：1172-1180.

Rockwell N C，Su Y S，Lagarias J C. 2006. Phytochrome structure and signaling mechanisms[J]. Annual Review of Plant Biology，57（1）：837-858.

Sharrock R A，Quail P H. 1989. Novel phytochrome sequen-ces in Arabidopsis thaliana：Structure，evolution，and differential expression of a plant regulatory photoreceptor family[J]. Genes & Development，3（11）：1745-1757.

Xia E H，Zhang H B，Sheng J，Li K，Zhang Q J，Changhoon Kim，Zhang Y，Liu Y，Zhu T，Li W，Huang H，Tong Y，Nan H，Shi C，Shi C，Jiang J J，Mao S Y，Jiao J Y，Zhang L P，Liu Y L，Liu B Y，Yu Y，Shao S F，Ni D J，Eichler E E，Gao L Z. 2017. The tea tree genome provides insights into tea flavor and independent evolution of ca-ffeine biosynthesis[J]. Molecular Plant，10（6）：866-877.

Zhou Z W，Deng H L，Wu Q Y，Liu B B，Yue C，Deng T T，Lai Z X，Sun Y. 2019. Validation of reference genes for gene expression studies in post-harvest leaves of tea plant（Camellia sinensis）[J]. PeerJ：7：6385-4401.

（責(zé)任編輯 陳 燕）