周姝穎 楊青楊 趙 輝*

（1 黑龍江大學(xué) 農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心 哈爾濱150500 2 黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 黑龍江省普通高校微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 哈爾濱150080）

中國(guó)白酒歷史悠久，因具有獨(dú)特的發(fā)酵工藝、蒸餾技術(shù)、儲(chǔ)存方法，在世界酒類(lèi)行業(yè)中占有重要地位[1-3]。在白酒生產(chǎn)時(shí)會(huì)產(chǎn)生甲醇等有害物質(zhì)[4-5]，國(guó)標(biāo)蒸餾酒甲醇含量小于0.036 g/100 mL[6]，應(yīng)盡量去除或控制其含量。酒曲中微生物將原料發(fā)酵生成乙醇的同時(shí)，微生物分泌的果膠酯酶也將果膠質(zhì)分解生成甲醇。果膠質(zhì)主要結(jié)構(gòu)是由α-1，4糖苷鍵鏈接D-半乳糖醛酸及其甲酯的聚合物[7]，其存在于水果、蔬菜和谷類(lèi)的細(xì)胞壁中[8]。我國(guó)每年用于白酒生產(chǎn)的玉米、高粱、大麥、小麥、豆類(lèi)等谷物中都含有果膠物質(zhì)[9]。果膠酶（pectinases）是由聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase，簡(jiǎn)稱PG）、果膠裂解酶 （pectin lyase，簡(jiǎn)稱PL） 和果膠酯酶（pectin methyl esterase，簡(jiǎn)稱PE）等酶協(xié)同作用將果膠物質(zhì)分解的酶類(lèi)總稱[10-13]。果膠酯酶水解果膠質(zhì)中半乳糖醛酸與甲氧基（-OCH3）相連的酯建，使甲氧基從半乳糖醛酸鏈上游離出來(lái)，形成果膠酸和甲醇；果膠酸進(jìn)一步被PG，PL 分解生成半乳糖醛酸和不飽和產(chǎn)物，被釀酒酵母等微生物利用[14]。

白酒生產(chǎn)中甲醇的來(lái)源大體分為兩個(gè)方面：一是原料中果膠質(zhì)受熱分解產(chǎn)生，二是微生物分泌果膠酯酶將原料中果膠質(zhì)分解生成甲醇[15]。張文葉[16]、Nicolini 等[17]對(duì)山楂果酒和葡萄酒的研究發(fā)現(xiàn)，許多因素影響甲醇的生成，如原料品種，原料中果膠質(zhì)類(lèi)型與含量，釀酒工藝，使用不同釀酒微生物、發(fā)酵條件和蒸餾方法等[18-19]。Glatthar 等[20]通過(guò)降低梨汁的pH 值和縮短發(fā)酵時(shí)間控制果酒中甲醇的含量。Hang 等[21]在蘋(píng)果酒發(fā)酵時(shí)，不同品種的蘋(píng)果和果汁發(fā)酵前經(jīng)高溫處理，都可降低甲醇的生成。Roberto 等[22]研究發(fā)現(xiàn)，用果膠甲酯酶處理原料無(wú)法降低甲醇含量，而采用分離的酵母發(fā)酵可使甲醇濃度降低。細(xì)菌、絲狀真菌和酵母等都可產(chǎn)生果膠酶，可以通過(guò)選擇優(yōu)良的功能微生物控制發(fā)酵酒中甲醇的含量[23-26]。

本文以黑龍江省某酒業(yè)有限公司的優(yōu)質(zhì)酒曲為樣品，從酒曲中分離、篩選PE 酶活較低的菌株。將優(yōu)選菌株做白酒發(fā)酵試驗(yàn)，通過(guò)氣相色譜測(cè)定發(fā)酵液中產(chǎn)甲醇最低的1 株細(xì)菌，對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，生理生化指標(biāo)和16S rDNA 鑒定。篩選菌株以不同接種量接種于添加曲粉和釀酒酵母的玉米水解液發(fā)酵培養(yǎng)基中，通過(guò)菌株菌群優(yōu)勢(shì)抑制酒曲中其它果膠降解菌的生長(zhǎng)[27-28]，以期降低白酒中甲醇的含量，確定最佳接種量。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與培養(yǎng)基

優(yōu)質(zhì)酒曲，由黑龍江省富裕老窖酒業(yè)有限公司提供。

89 株果膠酶產(chǎn)生菌，分離自優(yōu)質(zhì)酒曲。

釀酒酵母（S.cerevisiae），本實(shí)驗(yàn)室保藏菌株。

果膠（HM），安徽宇寧生物科技有限公司；甲醇、正丁醇（色譜純），天津市精細(xì)化工研究所；耐高溫α-淀粉酶；基因組DNA 提取試劑盒（細(xì)菌）、dNTP 混合液、耐熱DNA 聚合酶，生工生物工程（上海）股份有限公司等。

富集培養(yǎng)基：牛肉膏3 g、氯化鈉5 g、蛋白胨10 g、蒸餾水1 000 mL，pH 7.0～7.2，121 ℃滅菌20 min。

分離培養(yǎng)基：果膠4 g、氯化鈉5 g、牛肉膏3 g、瓊脂18～20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0～7.2，121℃滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、果膠5 g、磷酸氫二鈉0.3 g、氯化鈉5 g、硫酸鎂0.5 g、氯化鈣0.2 g、蒸餾水1 000 mL，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

玉米水解液的制備：取100 g 玉米粉，加入250～300 mL 蒸餾水，攪拌升溫至70 ℃，加入2.0 g耐高溫α-淀粉酶，升溫至90～95 ℃后，保溫20～40 min，測(cè)定玉米水解液糖含量為15%～20%時(shí)停止水解。

玉米水解發(fā)酵培養(yǎng)基：糖含量為15%玉米水解液，硫酸銨2%，pH 自然。

1.2 儀器與設(shè)備

PCR 擴(kuò)增儀，德國(guó)BIOMETRA；島津氣相色譜儀（GC-2010），武漢頓杰測(cè)量?jī)x器有限公司；高速冷凍離心機(jī)（GS-15R），上海兆茗電子科技有限公司等。

1.3 方法

1.3.1 酒曲中產(chǎn)果膠酶菌株的初篩 在超凈工作臺(tái)中取曲塊表面和內(nèi)部的酒曲混勻作為樣品，于4 ℃保存。

在滅菌后的99 mL 富集培養(yǎng)基中加入1 g 酒曲，37 ℃、120 r/min 搖床培養(yǎng)12 h。取菌液0.5 mL，加入盛有4.5 mL 的無(wú)菌水試管中，梯度稀釋。每個(gè)梯度取0.1 mL 菌液，涂布于以果膠為唯一碳源的分離培養(yǎng)上，37 ℃恒溫培養(yǎng)12～24 h。待長(zhǎng)出單菌落后，將菌株分別影印接于2 個(gè)新的分離培養(yǎng)基上，將剛果紅染色呈現(xiàn)透明圈的菌株，根據(jù)菌落形態(tài)、顏色等初步歸類(lèi)，純化后4 ℃保藏于冰箱中。

1.3.2 產(chǎn)果膠酶菌株的復(fù)篩

1.3.2.1 酶活測(cè)定 在白酒發(fā)酵過(guò)程中PE 酶活越高，產(chǎn)甲醇量越高。PG 與PL 酶活越高有利于原料利用，增加乙醇的含量。對(duì)初篩菌株進(jìn)行酶活測(cè)定，以篩選PE 酶活低，PG 和PL 酶活相對(duì)較高的菌株作為復(fù)篩標(biāo)準(zhǔn)。

PE 的測(cè)定為滴定法[29]：粗酶液與果膠溶液底物在35 ℃下反應(yīng)，用NaOH 溶液滴定產(chǎn)生羧基。酶活單位定義為：每毫升酶液每分鐘釋放出1 μmol 羧基為一個(gè)PE 酶活力單位。PG 和PL 酶活通過(guò)比色法進(jìn)行的測(cè)定。PG 酶活力單位定義[30]：在50 ℃，每毫升PG 單位時(shí)間內(nèi)分解果膠生成1 μg 還原糖量。PL 酶活力單位定義[31]：50 ℃下，每毫升PL 在單位時(shí)間內(nèi)水解聚半乳糖醛酸釋放1 μg 不飽和多聚半乳糖酸量。

1.3.2.2 白酒發(fā)酵條件 篩選的菌株均具有3 種酶活力，且酶活力不同。以5%的接種量將篩選菌株的種子液分別接種于玉米水解液培養(yǎng)基中，在37 ℃下靜止發(fā)酵，當(dāng)殘?zhí)墙抵?%以下且趨于不變，停止發(fā)酵后蒸餾，采用氣相色譜測(cè)定發(fā)酵液中甲醇的含量和乙醇的含量，選取產(chǎn)甲醇量低的菌株作為初發(fā)菌株。

1.3.2.3 氣相色譜條件 進(jìn)樣溫度200 ℃，檢測(cè)器溫度200 ℃；程序升溫：50 ℃保溫3 min，以5 ℃/min 升溫至150 ℃，保溫10 min，高純氮載氣流速為0.5～1.0 mL/min，進(jìn)樣量0.2 μL。

1.3.3 菌株形態(tài)學(xué)及生理生化 依照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[32]對(duì)低活性PE 菌株進(jìn)行形態(tài)特征描述和生理生化鑒定，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3 次[33-35]。

1.3.4 酒曲中篩選菌株的16SrDNA 鑒定

1.3.4.1 細(xì)菌基因組DNA 的提取 按菌株基因組DNA 提取按試劑盒說(shuō)明書(shū)的步驟進(jìn)行，通用引物設(shè)計(jì)如下：

正向引物fz1：8F 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；反向引物Rz2：1512R 5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。

1.3.4.2 PCR 反應(yīng)體系和程序 PCR 反應(yīng)體系如表1所示。

取5 μL 擴(kuò)增樣品，在1%的瓊脂糖凝膠、電壓108 V 下進(jìn)行電泳檢測(cè)，將條帶清晰、亮度高的PCR 產(chǎn)物置于-20 ℃下保存，待測(cè)序。

表1 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系Table 1 System of PCR

PCR 擴(kuò)增反應(yīng)程序：

1.3.4.3 16Sr DNA 片段的測(cè)序與系統(tǒng)發(fā)育分析將PCR 產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序（生工生物工程股份有限公司），測(cè)序結(jié)果與Gen Bank 數(shù)據(jù)庫(kù)中已報(bào)道的序列進(jìn)行BLAST 比對(duì)分析，經(jīng)MEGA 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，確定該菌株在微生物系統(tǒng)發(fā)育學(xué)地位。

1.3.5 ZS04 生長(zhǎng)曲線的繪制及培養(yǎng)條件的研究

1.3.5.1 ZS04 生長(zhǎng)曲線的繪制 以菌體濃度為考察依據(jù)，37 ℃培養(yǎng)，以菌液的OD 值為指標(biāo)，繪制菌株ZS04 生長(zhǎng)曲線，確定最佳培養(yǎng)時(shí)間。

1.3.5.2 ZS04 培養(yǎng)條件研究 采用稀釋涂布法，考察接種量、溫度、初始pH 對(duì)ZS04 菌株濃度的影響。

1） 最佳接種量確定 溫度37 ℃、初始pH 7.0，將種子液分別以1%，2%，3%，4%和5%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)36 h，測(cè)定菌體濃度。

2） 最佳培養(yǎng)溫度確定 接種量為4%，初始pH 7.0，培養(yǎng)36 h，測(cè)定31，34，37，40，43 ℃，測(cè)定菌體濃度。

3） 最佳pH 確定 培養(yǎng)基初始為pH 5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，接種量為4%，37 ℃培養(yǎng)36 h，測(cè)定菌體濃度。

4） 以優(yōu)化后培養(yǎng)條件培養(yǎng)菌株ZS04，通過(guò)涂板計(jì)數(shù)，確定最大菌體濃度，以備下一步試驗(yàn)。

1.3.6 菌株ZS04 降低白酒發(fā)酵中甲醇含量的研究 將優(yōu)化后含量為7.9×107CFU/mL 的種子液（表2），按0.5%，1%，2%，3%，4%的接種量接種于玉米水解液發(fā)酵培養(yǎng)基中，并分別添加酒曲和接種釀酒酵母，做白酒發(fā)酵試驗(yàn)?？瞻讓?shí)驗(yàn)不添加菌株ZS04，其它成分添加量與試驗(yàn)組相同。37 ℃靜止發(fā)酵，殘?zhí)墙抵?%以下且趨于不變，停止發(fā)酵，蒸餾得到蒸餾酒。通過(guò)氣相色譜測(cè)定甲醇含量，確定甲醇含量與菌株ZS04 接種量的關(guān)系。

表2 發(fā)酵對(duì)比試驗(yàn)Table 2 Fermentation comparison test

2 結(jié)果與分析

2.1 低果膠酯酶活性菌株的分離篩選結(jié)果

測(cè)定89 株菌株的酶活并進(jìn)行比較，對(duì)株菌ZS04、ZY23 所產(chǎn)3 種酶的酶活力進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表3。細(xì)菌ZS04 所產(chǎn)PE 酶活力在分選菌株中最低，為0.093 U/mL，真菌的PE 酶活最高為0.189 U/mL。細(xì)菌ZS04 的PG、PL 酶活比真菌ZY23 的PG、PL 酶活低。為比較3 種酶活力高、低與白酒中甲醇含量的關(guān)系，對(duì)細(xì)菌ZS04 和真菌ZY23 進(jìn)行液體白酒發(fā)酵試驗(yàn)。

表3 株菌ZS04、ZY23 所產(chǎn)3 種酶的酶活力比較Table 3 Comparison of three enzyme activities from ZS04 and ZY23 strains

發(fā)酵72 h 后，終止發(fā)酵，蒸餾并測(cè)定甲醇含量。對(duì)照組與兩株優(yōu)選菌株在白酒發(fā)酵中產(chǎn)甲醇量見(jiàn)表4。接菌株ZS04 組的甲醇含量比接真菌組低45.3%，比對(duì)照組低39.01%，說(shuō)明白酒發(fā)酵中甲醇含量增加僅與PE 酶活有關(guān)，與PG 和PL 活力無(wú)關(guān)。

表4 菌株ZS04、ZY23 在白酒發(fā)酵中甲醇含量Table 4 The methanol contents of ZS04、ZY23 in liquor fermentation

2.2 菌株的鑒定結(jié)果

2.2.1 篩選菌株初步鑒定結(jié)果 菌株ZS04 為圓形白色，表面濕潤(rùn)褶皺，邊緣不整齊，桿狀、芽孢著生前段，革蘭氏染色為陽(yáng)性。生理生化鑒定，結(jié)果見(jiàn)表5。從以上試驗(yàn)結(jié)果可初步鑒定菌株ZS04 為芽孢桿菌屬。

表5 ZS04 菌株生理生化鑒定結(jié)果Table 5 The physiology and biochemistry properties of ZS04 strain

2.2.2 菌株ZS04 的16Sr DNA 鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果 ZS04 菌株基因組DNA 經(jīng)PCR 擴(kuò)增、凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果表明 （圖1），與DL2000 Marker 比較，在1 000～2 000 bp 處有一明亮、無(wú)其它非特異性條帶，與測(cè)序結(jié)果1 154 bp 相吻合。

將ZS04 菌株的基因測(cè)序結(jié)果與GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST 比對(duì)分析，繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果見(jiàn)圖2，菌株ZS04 與解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）相似度為99%，確定菌株ZS04為解淀粉芽孢桿菌。

2.3 ZS04 生長(zhǎng)曲線的繪制及培養(yǎng)條件

2.3.1 ZS04 生長(zhǎng)曲線 從圖3可知，0～12 h 為菌株ZS04 的遲緩期，12～34 h 為對(duì)數(shù)期，穩(wěn)定期為34～43 h，衰亡期為43～60 h。最終確定該菌株最佳培養(yǎng)時(shí)間為36 h。

2.3.2 ZS04 培養(yǎng)條件 從圖4可知，當(dāng)接種量為5%時(shí)，菌體濃度達(dá)到最高值。從圖5可知，ZS04 菌株的最佳培養(yǎng)溫度為37 ℃。從圖6可知，菌體生長(zhǎng)的最適pH 值為6.5。

圖1 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 The electrophoresis photographs of PCR amplified prod

圖2 ZS04 的16S rDNA 的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of 16SrDNA gene of ZS04

圖3 ZS04 菌株的生長(zhǎng)曲線Fig.3 The growth curve of ZS04 strain

圖4 接種量對(duì)菌體濃度的影響Fig.4 The influence of inoculation amount on bacteria growth

圖5 溫度對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響Fig.5 The influence of temperature on bacteria

圖6 初始pH 對(duì)菌體濃度的影響Fig.6 The influence of initial pH on the bacteria growth

以此條件培養(yǎng)菌株ZS04，菌體濃度最大為7.9×107CFU/mL。

2.4 ZS04 菌株在白酒發(fā)酵試驗(yàn)中的接種量

模擬白酒發(fā)酵進(jìn)行至72 h 時(shí)終止發(fā)酵，蒸餾，用氣相色譜測(cè)定發(fā)酵液中甲醇含量。如表6和圖7可知，試驗(yàn)組各接種量的發(fā)酵液中甲醇含量比對(duì)照組的甲醇含量低。試驗(yàn)組接種量從0.5%，1%，2%，3%逐漸升高，而甲醇含量逐漸降低。接種量為0.5%時(shí)甲醇含量為0.705 mg/100 mL，比對(duì)照組低20.96%。接種量為3%時(shí)甲醇含量最低為0.313 mg/100 mL，比對(duì)照組降低66.03%。接種量為4%時(shí)發(fā)酵液中甲醇含量開(kāi)始升高，高于對(duì)照組甲醇含量。發(fā)酵過(guò)程中接種菌株ZS04，抑制其它果膠降解菌的生長(zhǎng)，而菌株ZS04 PE 酶活低，產(chǎn)甲醇量也隨之降低；當(dāng)接種量提高于3%時(shí)，可能因菌種接種量過(guò)高，導(dǎo)致產(chǎn)甲醇量也隨之升高。接種量為0.5%時(shí)乙醇含量為8 739.0 mg/100 mL，比對(duì)照組和其它接種量高，說(shuō)明在菌株ZS04 分泌的PG、PL 共同作用下，生成短鏈的聚半乳糖醛酸及其不飽和產(chǎn)物，為釀酒酵母提供了碳源，提高乙醇的產(chǎn)量[36-37]。而接種量高于0.5%時(shí)，過(guò)高的菌株ZS04 濃度抑制了酒曲中酵母的生長(zhǎng)，使酒精產(chǎn)量降低。

GBT/10781.1-2006 《濃香型白酒》 高度酒（41°～68°）要求甲醇含量（g/100 mL）≤0.0400。將發(fā)酵液蒸餾為45°白酒后，試驗(yàn)組的甲醇含量均小于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和對(duì)照組。白酒發(fā)酵中既要求乙醇含量高，又要求降低甲醇含量，可選0.5%接種量。如果對(duì)甲醇的含量有較高要求（如歐盟標(biāo)準(zhǔn)），可選3%接種量進(jìn)行發(fā)酵，能大幅度降低甲醇的含量。

圖7 ZS04 菌株不同接種量產(chǎn)生甲醇和乙醇含量Fig.7 The contents of methanol and ethanol by different inoculation amount from strain ZS04

表6 ZS04 菌株不同接種量時(shí)發(fā)酵液中甲醇含量Table 6 The methanol content of ZS04 adding by the different inoculation in the liquor fermentation

3 結(jié)論

從優(yōu)質(zhì)酒曲中篩選PE 酶活力較低的菌株進(jìn)行白酒液態(tài)發(fā)酵，確定產(chǎn)甲醇量最少的菌株。經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化和16S rDNA 鑒定，確定為解淀粉芽孢桿菌 （Bacillus amyloliquefaciens），命名為ZS04。對(duì)其培養(yǎng)條件進(jìn)行初步研究，菌株生長(zhǎng)的最適溫度37 ℃、pH 6.5，在此條件下最低菌濃度為7.9×107CFU/mL。模擬白酒發(fā)酵，探究對(duì)菌株ZS04接種量與甲醇含量的關(guān)系。試驗(yàn)組接種量從0.5%，1%，2%，3%逐漸升高，甲醇含量逐漸降低，當(dāng)接種量為4%時(shí)甲醇含量升高。接種量3 %時(shí)甲醇含量最低，比對(duì)照組降低66.03%；接種量為0.5%時(shí)甲醇含量為0.705 mg/100 mL，比對(duì)照組低20.96%，同時(shí)乙醇含量比對(duì)照組高5.77%。發(fā)酵中如果要求降低甲醇含量，并要求乙醇含量較高，可選0.5%接種量進(jìn)行白酒發(fā)酵；如果對(duì)白酒中甲醇含量要求較苛刻，則可選3%接種量進(jìn)行發(fā)酵，該方法同樣可用于固體白酒發(fā)酵，以期從源頭減少發(fā)酵中甲醇的生長(zhǎng)，提高發(fā)酵白酒的品質(zhì)。